李 姣, 任秋蓉, 古 蕾, 朱曉換, 王亞男
(四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都610101)
為了控制植物病毒引起的植物病害發(fā)生和防止植物病毒在國(guó)家和地區(qū)之間傳播,必須對(duì)植物進(jìn)行病毒檢測(cè).植物病毒檢測(cè)在無(wú)病毒植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中(特別是在脫除病毒之后)是重要環(huán)節(jié)之一.長(zhǎng)期以來(lái),人們一直致力于開發(fā)簡(jiǎn)單有效的植物病毒檢測(cè)方法,如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[1-4]、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT -PCR)[5-7]、real -time RT -PCR[8-9]、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(RT - loop - mediated isothermal amplification,RT-LAMP)[10-11]、微陣列[12]和下一代測(cè)序[13]等.其中,靈敏度高且操作較簡(jiǎn)便的方法是RT-PCR,已被廣泛應(yīng)用于病毒檢測(cè)[14-18].
在采用RT - PCR 技術(shù)檢測(cè)植物病毒的過(guò)程中,第一個(gè)步驟是通過(guò)分離和純化RNA 獲得RNA模板.RNA的分離是一項(xiàng)技術(shù)性強(qiáng)、耗時(shí)長(zhǎng)的工作,需要一定量的植物材料和幾個(gè)離心步驟.RNA提取后,還必須對(duì)RNA提取液進(jìn)行純化,以獲得高質(zhì)量的RNA模板.在提取和純化的步驟中,操作人員的技術(shù)錯(cuò)誤可能會(huì)導(dǎo)致RNA 污染或降解等問(wèn)題,從而使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性、假陽(yáng)性等錯(cuò)誤[14,18].因此,目前RT -PCR 檢測(cè)植物病毒的方法存在RNA模板制備較困難的缺點(diǎn).
簡(jiǎn)化RNA模板的制備過(guò)程將有助于提高植物病毒檢測(cè)的效率,降低檢測(cè)成本,并能極大地促進(jìn)RT-PCR在其他領(lǐng)域的應(yīng)用.一種稱為微量組織直接RT -PCR 反應(yīng)(Microtissue direct RT -PCR)的簡(jiǎn)單快速的RNA模板制備方法最初由Hosokawa等[19]于2006 年提出,有效檢測(cè)了菊花植株中的2種類病毒,即菊花矮化類病毒(CSVd)和菊花褪綠斑駁類病毒(CChMVd).他們的研究發(fā)現(xiàn),無(wú)菌注射器針頭(25 G)比剃刀更適合于CChMVd的檢測(cè),而且在高濃度和低濃度類病毒感染的菊花植株中均能檢測(cè)到類病毒.然而,此后未有微量組織直接RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)其他植物病毒的研究,由此人們對(duì)該方法產(chǎn)生了2 個(gè)疑問(wèn):該方法是否只局限于菊花類病毒檢測(cè)?該方法可以應(yīng)用于更多種類的植物病毒檢測(cè)嗎?為了解決這2 個(gè)問(wèn)題,讓微量組織直接RT-PCR反應(yīng)方法應(yīng)用到更多種類的植物病毒檢測(cè)中,本研究建立與優(yōu)化了該方法,可檢測(cè)4種不同屬植物病毒感染的4 種植物,即葡萄卷葉相關(guān)病毒3(Grapevine leafroll-associate virus-3,GLRaV-3)感染的葡萄、蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)感染的蘋果、馬鈴薯卷葉病毒(Potato leafroll virus,PLRV)感染的馬鈴薯和百合花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)感染的百合.GLRaV-3、ASGV、PLRV和CMV分別是Ampelovirus屬[20]、Capillovirus屬[21]、Polerovirus屬[22]和Cucumovirus屬[23]病毒的成員.經(jīng)正反向引物擴(kuò)增所產(chǎn)生的特異性DNA條帶的長(zhǎng)度分別是:GLRaV -3為546 bp[24],ASGV 為524 bp[5],PLRV 約為600 bp[25],CMV為657 bp[26].本研究首先以GLRaV -3 感染的葡萄試管苗為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行微量組織直接RT-PCR反應(yīng),以優(yōu)化RNA模板的制備工藝,然后應(yīng)用于其他3 種植物病毒感染的3 種植物中,以檢測(cè)微量組織直接RT - PCR 反應(yīng)的敏感性和廣譜性.
1.1 實(shí)驗(yàn)材料本研究以GLRaV -3 感染的葡萄品種“Cabernet Sauvignon”、ASGV 感染的蘋果品種“Gala”、PLRV感染的馬鈴薯品種“紫花白”和CMV感染的百合品種“Siberia”為植物材料,在MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行離體組織培養(yǎng),同時(shí)以相應(yīng)的無(wú)病毒試管苗作為陰性對(duì)照.MS培養(yǎng)基添加了質(zhì)量濃度30 g/L的蔗糖和質(zhì)量濃度7 g/L的瓊脂,pH值為5.8,在121 ℃高壓滅菌20 min.離體組織培養(yǎng)的條件:光照由冷白色熒光管提供,光照周期為16 h 光照/8 h黑暗,光亮度為50 μmol·s /m2,溫度為(24 ±2)℃.離體培養(yǎng)物每4 周進(jìn)行一次繼代培養(yǎng).
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 植物組織總RNA 提取 按照傳統(tǒng)的RNA模板的制備方法,將植物組織(鮮質(zhì)量0.5 g)放入事先盛有液氮的研缽中,充分研磨,然后按照北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司提供的植物組織總RNA提取的說(shuō)明書,用該公司提供的植物組織總RNA提取試劑盒進(jìn)行操作.
根據(jù)修改過(guò)的Hosokawa 等[19]用微量組織直接制備RNA 模板的方法,用無(wú)菌注射器針(Terumo,日本)在立體顯微鏡下刺入GLRaV -3 感染的葡萄試管苗的莖中直到其到達(dá)莖的中間部分,具體步驟如下:
1)無(wú)菌注射器針頭分別在莖、葉柄和根取樣(如圖1A所示);
2)無(wú)菌注射器針頭刺入取樣部位的中間部分,在那里停留2 ~3 s(如圖1B所示);
3)在室溫中將沾有組織液的針頭直接浸入RT反應(yīng)液中15 min.
圖1 微量組織直接RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)GLRaV-3 感染的葡萄赤霞珠試管苗時(shí)RNA模板直接制備的方法示意圖Fig. 1 Illustrations of microtissue direct preparation method of RNA template in in vitro grapevine“Cabernet Sauvignon”stock plantlets infected with GLRaV-3
本研究通過(guò)2 個(gè)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了微量組織直接制備RNA模板的工藝.在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中,用3 種不同尺寸的無(wú)菌注射器針頭刺入葡萄試管苗的莖中,以選擇一種最佳尺寸的針頭來(lái)獲取組織液,制備RNA模板.這3 種尺寸分別為26 G(0. 45 ×16 RW -LB)、25 G(0.5 ×16 RW - LB)和23 G(0. 6 ×25 TW-LB).在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中(如圖1A 所示),使用無(wú)菌注射器針頭(26 G)從葡萄試管苗的不同部位(包括莖、葉柄、葉和根)來(lái)獲取組織液,制備RNA模板,以確定哪些植物組織適合于用微量組織直接RT-PCR反應(yīng)檢測(cè).
1.2.2 RT -PCR 反應(yīng) RT -PCR 反應(yīng)首先對(duì)傳統(tǒng)法提取的RNA模板或者微量組織汁液中含有的RNA進(jìn)行RT反應(yīng),然后對(duì)RT 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.
傳統(tǒng)的RT 反應(yīng)體系的總體積為20 μL,其中各成分含量為:1 μg RNA 和4 μL 5 × TRUE RT MasterMix(該試劑包含M -MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和一對(duì)隨機(jī)引物).各成分配置完成后,以ddH2O 補(bǔ)齊至20 μL,于42 ℃恒溫反應(yīng)20 min,獲得DNA 模板,隨后于85 ℃放置5 s,使逆轉(zhuǎn)錄酶失活,終止反應(yīng).
微量組織直接RT 反應(yīng)體系總體積為20 μL,其成分與傳統(tǒng)的RT 反應(yīng)體系的成分相同,只是不加RNA,以ddH2O補(bǔ)齊至20 μL.將黏附了組織汁液的針尖浸在RT反應(yīng)體系中,室溫反應(yīng)15 min,獲得DNA模板,隨后于85 ℃放置5 s,使逆轉(zhuǎn)錄酶失活,終止反應(yīng).操作中,盡量使黏附了組織汁液的針尖完全浸在RT反應(yīng)液中,并蓋嚴(yán)管蓋,否則會(huì)影響RT反應(yīng)結(jié)果.
PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL,其中各成分含量為:12.5 μL 2 ×Utaq PCR MasterMix、10 μmol/mL正反向引物(表1)各1 μL、2 μL cDNA 模板.各成分配置完成后,以ddH2O補(bǔ)齊至25 μL,放入Bio-Rad PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增.
用于檢測(cè)GLRaV-3 的PCR反應(yīng)條件:1)預(yù)變性:94 ℃,3 min;2)35 個(gè)循環(huán):94 ℃,30 s;52 ℃,30 s;72 ℃,60 s;3)末次延伸:72 ℃,7 min.
用于檢測(cè)ASGV 的PCR 反應(yīng)條件:1)預(yù)變性:94 ℃,3 min;2)35 個(gè)循環(huán):94 ℃,30 s;54 ℃,45 s;72 ℃,60 s;3)末次延伸:72 ℃,5 min.
用于檢測(cè)PLRV的PCR反應(yīng)條件:1)預(yù)變性:94 ℃,3 min;2)35 個(gè)循環(huán):94 ℃,30 s;50 ℃,30 s;72 ℃,30 s;3)末次延伸:72 ℃,10 min.
用于檢測(cè)CMV的PCR反應(yīng)條件:1)預(yù)變性:94 ℃,3 min;2)30 個(gè)循環(huán):94 ℃,15 s;54 ℃,30 s;72 ℃,30 s;3)末次延伸:72 ℃,5 min.
表1 用于微量組織直接RT-PCR反應(yīng)和傳統(tǒng)RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)4 種植物病毒的引物序列及特異性條帶長(zhǎng)度Tab. 1 Primer sequences and the specific band sizes used for detection of 4 plant viruses by micro-tissue RT-PCR and RT-PCR
1.2.3 2%瓊脂糖凝膠電泳成像 RT -PCR反應(yīng)產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè).將0.6 g的瓊脂糖放入30 mL TAE緩沖液(40 mmol/mL Trisacetate,1 mmol/mL EDTA,pH8.0)中溶解,滴入1.5 μL Goldview 核酸染料(5 μL 核酸染料/100 mL TAE緩沖液),倒入膠模中,室溫靜置約30 min,使膠完全凝固.把膠放入裝有適量TAE緩沖液的Bio-Rad凝膠電泳儀的電泳槽內(nèi),分別往孔道中加入6 μL DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和6 μL RT -PCR反應(yīng)產(chǎn)物的混合液(1 μL 反應(yīng)產(chǎn)物/5 μL 上樣緩沖液)后,蓋上電泳槽,通電1 ~5 V/cm,使DNA向陽(yáng)極移動(dòng).電泳完畢后,取出凝膠,在Bio -Rad 成像系統(tǒng)中檢查凝膠并拍照.
1.2.4 數(shù)據(jù)處理 本研究中所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次,每次使用20 株同種植物的陰性對(duì)照(即無(wú)病毒感染)試管苗和20 株同種植物的陽(yáng)性對(duì)照(即病毒感染)試管苗.所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2013 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì).
2.1 以GLRaV -3 感染的葡萄試管苗為實(shí)驗(yàn)材料優(yōu)化微量組織直接RT-PCR反應(yīng)的工藝
2.1.1 26 G 針頭最適用于微量組織直接RT -PCR反應(yīng) 本研究首先以GLRaV -3 感染的葡萄試管苗為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)2 個(gè)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了微量組織直接制備RNA 模板的工藝.第一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2、表2 顯示,圖2 中M為分子標(biāo)記,N為陰性對(duì)照,P為陽(yáng)性對(duì)照,泳道1—3 為感染樣本,泳道4 為健康樣本。雖然3 種不同尺寸的無(wú)菌注射器針頭刺入葡萄試管苗莖的中間部位時(shí)所采集的組織液都可以通過(guò)微量組織直接RT -PCR 反應(yīng)檢測(cè)到GLRaV-3 的特異性DNA條帶(546 bp),但是能檢測(cè)到該條帶的樣本數(shù)量和百分比在三者中差別很大.通過(guò)25和23 G針頭制備的RNA模板直接RT-PCR反應(yīng)分別檢測(cè)到50%和25%樣本中的GLRaV-3 條帶,而通過(guò)26 G 針頭制備的RNA 模板直接RT -PCR反應(yīng)檢測(cè)到100%樣本中的GLRaV -3 條帶(表2),說(shuō)明在3 種不同尺寸的針頭中,26 G 針頭最適用于獲取植物組織液,制備RNA模板.
圖2 3 種規(guī)格的針頭采集微量組織后直接RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)葡萄赤霞珠試管苗莖中的GLRaV-3Fig. 2 Microtissue direct RT-PCR for detection of GLRaV-3 in stems of in vitro infected stock plantlets of grapevine“Cabernet Sauvignon”using three sizes of sterile syringe needles
表2 微量組織直接RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)GLRaV-3,用3種不同尺寸的無(wú)菌注射器針頭采集GLRaV-3 感染葡萄試管苗莖的組織液直接制備RNA模板的所產(chǎn)生的特異性條帶(546 bp)的數(shù)量和百分比Tab. 2 Number and percentages of specific bands(546 bp)detected by RT-PCR in microtissue direct preparations of RNA templates of stems infected with GLRaV-3 using 3 sizes of sterile syringe needles
2.1.2 植物莖、葉柄或根是微量組織直接RT -PCR反應(yīng)的適宜器官 第二個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示,M為分子標(biāo)記,N 為陰性對(duì)照,P 為陽(yáng)性對(duì)照,泳道1 為感染植株的莖,泳道2 為感染植株的葉柄,泳道3 為感染植株的根,泳道4 為健康莖.在葡萄試管苗莖、葉柄和根中都檢測(cè)到了GLRaV -3 的DNA條帶,說(shuō)明植物任一部位都可以用于采集組織液,進(jìn)行微量組織直接RT-PCR反應(yīng).
圖3 微量組織直接RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)GLRaV-3在葡萄赤霞珠試管苗不同組織中的表達(dá)Fig. 3 Detection of GLRaV-3 by microtissue direct RT-PCR in various tissues of in vitro infected stock plantlets of grapevine“Cabernet Sauvignon”
2.2 微量組織直接RT -PCR 反應(yīng)與傳統(tǒng)RT -PCR反應(yīng)檢測(cè)GLRaV-3 的敏感性比較本研究以傳統(tǒng)的RT -PCR 檢測(cè)植物病毒的方法為對(duì)照,將建立且優(yōu)化的微量組織直接RT -PCR 檢測(cè)方法的敏感性與之進(jìn)行了比較.雖然微量組織直接RT -PCR反應(yīng)產(chǎn)生的GLRaV-3 條帶相對(duì)較弱,但是病毒被檢測(cè)到的頻率在兩者之間沒有差異,如圖4 所示,M為分子標(biāo)記,P 為陽(yáng)性對(duì)照,N 為陰性對(duì)照,泳道1、2 為傳統(tǒng)RT -PCR 的檢測(cè)結(jié)果,泳道3、4為微量組織直接RT -PCR 的檢測(cè)結(jié)果.結(jié)果表明其足以用于檢測(cè)葡萄試管苗中的GLRaV-3.
圖4 微量組織直接RT-PCR反應(yīng)與傳統(tǒng)的RT-PCR反應(yīng)在葡萄赤霞珠試管苗莖中檢測(cè)GLRaV-3 的敏感性比較Fig. 4 Comparison in the sensitivity of detection of GLRaV-3 in stems of in vitro infected stock plantlets of grapevine“Cabernet Sauvignon”between the traditional RT-PCR and microtissue direct RT-PCR
2.3 微量組織直接RT -PCR 反應(yīng)與傳統(tǒng)RT -PCR反應(yīng)檢測(cè)ASGV、PLRV和CMV 的敏感性比較本研究把在葡萄試管苗已建立并且優(yōu)化的微量組織直接RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)一步應(yīng)用于其他3 種病毒的檢測(cè),獲得了可信度高的檢測(cè)結(jié)果.在檢測(cè)ASGV 時(shí),雖然微量組織直接RT -PCR 檢測(cè)到的ASGV特異性DNA 條帶(524 bp)比傳統(tǒng)RT -PCR檢測(cè)到的條帶較弱,但是其檢測(cè)到所有感染該病毒樣本(樣本量為20,百分比為100%)中的病毒條帶(表3、圖5),說(shuō)明病毒被檢測(cè)到的頻率在兩者之間沒有差異.圖中,M 為分子標(biāo)記,P 為陽(yáng)性對(duì)照,N 為陰性對(duì)照,泳道1、2 為RT -PCR 檢測(cè)感染樣本,泳道3、4為RT-PCR 檢測(cè)健康樣本,泳道5、6 為MD RT -PCR檢測(cè)感染樣本,泳道7、8 為MD RT-PCR檢測(cè)健康樣本.
圖6 中,M 為分子標(biāo)記,P 為陽(yáng)性對(duì)照,N 為陰性對(duì)照,泳道1、2 為RT-PCR檢測(cè)感染樣本,泳道3、4 為MD RT-PCR檢測(cè)感染樣本.
表3 微量組織直接RT-PCR反應(yīng)和傳統(tǒng)RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)4 種植物病毒的敏感性的比較Tab. 3 Comparison in the sensitivity of virus detection by microtissue direct RT-PCR and the traditional RT-PCR
圖5 微量組織直接RT-PCR反應(yīng)與傳統(tǒng)RT-PCR反應(yīng)在蘋果“Gala”試管苗莖中檢測(cè)ASGV的敏感性比較Fig. 5 Comparison in the sensitivity of detection of ASGV by traditional RT-PCR and microtissue direct RT-PCR in stems of in vitro infected stock plantlets of apple“Gala”
圖6 微量組織直接RT-PCR反應(yīng)與傳統(tǒng)RT-PCR反應(yīng)在馬鈴薯“紫花白”中檢測(cè)PLRV的敏感性比較Fig. 6 Comparison of the sensitivity in detection of PLRV by traditional RT-PCR and microtissue direct RT-PCR in stems of in vitro infected stock plantlets of potato“Zihuabai”
圖7 中,M 為分子標(biāo)記,N 為陰性對(duì)照,P 為陽(yáng)性對(duì)照,泳道1、2 為RT -PCR 檢測(cè)感染樣本,3、4條帶為MD RT-PCR檢測(cè)感染樣本.
圖7 微量組織直接RT-PCR反應(yīng)與傳統(tǒng)RT-PCR反應(yīng)在百合“Siberia”試管苗莖中檢測(cè)CMV的敏感性比較Fig. 7 Comparison of the sensitivity in detection of CMV by traditional RT-PCR and microtissue direct RT-PCR in stems of in vitro infected stock plantlets of Lilium Oriental hybrid“Siberia”
在應(yīng)用微量組織直接RT-PCR檢測(cè)PLRV(圖6)和CMV(圖7)時(shí)也獲得了類似的結(jié)果.
根據(jù)每種病毒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)使用20 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣本和20 個(gè)陰性對(duì)照樣本的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,與傳統(tǒng)RT-PCR相比,4 種植物病毒被微量組織直接RTPCR檢測(cè)到的頻率無(wú)明顯差異(表3),說(shuō)明微量組織直接RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性足夠用于檢測(cè)這4 種不同屬的植物病毒.
Hosokawa等[19]在使用微量組織直接RT -PCR反應(yīng)檢測(cè)CSVd 和CChMVd 時(shí)發(fā)現(xiàn)無(wú)菌注射器針頭(25 G)比剃刀更適合于CChMVd的檢測(cè).本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)直徑較大(26 G)的針頭所制備的RNA模板通過(guò)RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)到病毒的頻率高于直徑較?。?5 和23 G)的針頭.植物的莖、葉柄和根都是微量組織直接RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)病毒的適宜器官.
本研究建立并優(yōu)化的微量組織直接RT -PCR反應(yīng)檢測(cè)植物病毒的方法成功地應(yīng)用于葡萄、蘋果、馬鈴薯和百合試管苗的病毒檢測(cè),有效地檢測(cè)了GLRaV-3、ASGV、PLRV和CMV.雖然該方法檢測(cè)的病毒特異性DNA 條帶比傳統(tǒng)RT -PCR 檢測(cè)到的條帶較弱,但是病毒被檢測(cè)到的頻率在兩者之間無(wú)明顯差異,說(shuō)明該方法的敏感性足以檢測(cè)植物病毒.
這是首次基于RT-PCR反應(yīng)直接利用植物組織液制備RNA模板在4 種試管苗中有效和快速檢測(cè)4 個(gè)不同屬植物病毒的方法.該方法消除了RNA模板制備過(guò)程中最麻煩的環(huán)節(jié)(即RNA 提取和純化),節(jié)省了時(shí)間,降低了成本.因此,在海關(guān)等檢疫機(jī)構(gòu)檢測(cè)植物病毒和無(wú)病毒植物組織培養(yǎng)中具有潛在的應(yīng)用前景.接下來(lái),本研究還會(huì)將該方法推廣到大田等自然生長(zhǎng)的植物的病毒檢測(cè)中.