袁宇，徐林

前言

骨缺損是一項(xiàng)臨床常見的問題，常由創(chuàng)傷、感染、腫瘤或一些先天性疾病所造成［1-2］。目前臨床中骨缺損的主要手術(shù)方式是采用自體骨或異體骨移植，但手術(shù)治療中存在著機(jī)體創(chuàng)傷大、移植物來(lái)源有限及其潛在的免疫應(yīng)答風(fēng)險(xiǎn)，考慮到患者的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)及基礎(chǔ)疾病因素且存在術(shù)后感染和并發(fā)癥等缺點(diǎn)，極大限制了其應(yīng)用。近年來(lái)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）在基因工程、骨組織工程中的價(jià)值在基礎(chǔ)研究和臨床中得到廣泛關(guān)注及應(yīng)用發(fā)現(xiàn)并報(bào)道［3］，因其來(lái)源豐富、易培養(yǎng)且增殖能力強(qiáng)、低免疫原性和基因轉(zhuǎn)染率高并能穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)，在特定誘導(dǎo)條件下可以向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等分化，通過(guò)旁分泌參與組織修復(fù)并介導(dǎo)免疫應(yīng)答［4-6］。目前被認(rèn)為是組織工程中的理想種子細(xì)胞，為骨缺損的治療提供新的思維方向及應(yīng)用前景。利用BMSCs依附在適當(dāng)?shù)闹Ъ茌d體上再造組織或器官是目前臨床研究的重點(diǎn)［7］。2001年Mastrogiacomo等［8］報(bào)道了以羥基磷灰石為支架結(jié)合BMSCs 的方法成功治療了3 例骨缺損患者。隨后又有大量的實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)了BMSCs結(jié)合支架材料治療骨缺損的可行性［9-10］。目前生物3D 打印技術(shù)是將種子細(xì)胞及特定的支架材料按照預(yù)設(shè)的構(gòu)建模型再造出特定的組織及器官，因其建模的精確性且不存在免疫排斥反應(yīng)在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床中得到廣泛關(guān)注，是一種新興的有廣泛發(fā)展前景的骨缺損治療技術(shù)。本次研究就BMCSs 的骨組織工程技術(shù)結(jié)合3D 打印載體治療骨缺損的應(yīng)用研究進(jìn)行綜述。

1 BMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定

1.1 BMCSs的分離培養(yǎng)

目前間充質(zhì)干細(xì)胞主要來(lái)源是自體骨髓和臍帶組織，分化來(lái)源于中胚層［11］，因其優(yōu)秀的增殖并且具有誘導(dǎo)多向分化能力、低免疫原性和不存在倫理問題在干細(xì)胞組織工程中得到廣泛研究和應(yīng)用。因骨髓間充質(zhì)細(xì)胞含量少，細(xì)胞數(shù)量和活性隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸減少，在實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用中受限，所以要獲取數(shù)量充足且有活性的BMSCs必須依賴體外分離培養(yǎng)及擴(kuò)增技術(shù)。

BMSCs在不同個(gè)體和不同年齡段中細(xì)胞活性和數(shù)量各不相同，目前在人體中的來(lái)源提取主要是取自髂骨和腰椎弓板和棘突［12］。目前實(shí)驗(yàn)室中BMSCs分離培養(yǎng)的主要方法有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、表型分離法、免疫磁珠分選法和流式細(xì)胞儀分選法等［13］。全骨髓貼壁法和密度梯度離心法操作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、獲取目的細(xì)胞效率較高，是目前最常用的分離方法［14］。免疫磁珠分選法與流式細(xì)胞儀分選法分離過(guò)程較復(fù)雜且價(jià)格較高，應(yīng)用并不廣泛。

隨著對(duì)BMSCs 研究的系統(tǒng)化和規(guī)范化，機(jī)體本身BMSCs 的獲取數(shù)量有限，有研究者提出誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（induced Pluripotent Stem Cells,iPSC）替代的BMSCs 概念。iPSC 易獲取、來(lái)源廣泛，沒有取材時(shí)引起的副損傷等優(yōu)點(diǎn)，并且同樣擁有多向誘導(dǎo)分化能力，在未來(lái)臨床治療中是BMSCs 的一種優(yōu)秀的替代來(lái)源，從而具有重要的應(yīng)用價(jià)值［15］。雖然目前對(duì)iPSC 的誘導(dǎo)研究發(fā)現(xiàn)其分裂增殖能力優(yōu)越，但增殖過(guò)程中缺乏可控性，有潛在成瘤生長(zhǎng)的可能，在其培養(yǎng)和應(yīng)用中還需要更深入的研究［16-17］。

1.2 BMCSs的鑒定

分離提純的BMSCs在外觀上呈體積較小的梭形細(xì)胞、核漿比大，隨著間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取方法的多樣化，國(guó)際間充質(zhì)干細(xì)胞委員會(huì)也提出了BMSCs 的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，主要針對(duì)分離出的細(xì)胞進(jìn)行免疫表型的篩選要求，常用的方法有免疫熒光染色法和流式細(xì)胞術(shù)，BMSCs 通常表達(dá)CD90、CD105、CD73，較少表達(dá)CD19、CD79、CD45、CD34、CD14 和HLA-DR 表面分子［18-19］。雖然BMSCs 的分離培養(yǎng)趨于多樣化和標(biāo)準(zhǔn)化，但目前還沒有其特異性的免疫標(biāo)志物進(jìn)行鑒定分離［20］，在BMSCs 的篩選純化方面還需要進(jìn)一步的研究［21］。實(shí)驗(yàn)室中對(duì)分離提純的BMSCs監(jiān)測(cè)其誘導(dǎo)成骨分化是否成熟常用其分泌產(chǎn)物進(jìn)行分析，常用的有堿性磷酸酶（ALP）和骨涎蛋白。

1.2.1 ALP 在BMCSs 鑒定中的應(yīng)用ALP 由成骨細(xì)胞分泌，在成骨過(guò)程中水解磷酸酯、啟動(dòng)鈣化程序，是成熟成骨細(xì)胞最重要的標(biāo)志酶，也是最常用來(lái)監(jiān)測(cè)的工具酶，可以通過(guò)檢測(cè)ALP 的含量及活動(dòng)判斷成骨細(xì)胞的分解代謝水平及分化成熟程度。ALP 作用于鈣離子使其在骨基質(zhì)上聚集沉積完成基質(zhì)鈣化，在鈣化初始時(shí)ALP 活性最高，隨著鈣化的進(jìn)行ALP 逐漸下降。ALP 染色法是最常用的檢測(cè)方法，通常用Von Kossa 法、茜素紅法染色等可顯示礦化結(jié)節(jié)，目前RT-PCR 技術(shù)可定性定量地檢測(cè)ALP 活性以幫助分析成骨細(xì)胞成骨過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化［22］。

1.2.1 骨涎蛋白在BMCSs 鑒定中的應(yīng)用骨涎蛋白主要是由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，破骨細(xì)胞和成齒細(xì)胞也有少量合成，其活性與ALP 在成骨過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化不同，在成骨細(xì)胞成熟的過(guò)程中骨涎蛋白的含量呈遞增的趨勢(shì)，與鈣化過(guò)程呈正相關(guān)，對(duì)血清或血漿中的骨涎蛋白含量的測(cè)定可判斷成骨細(xì)胞的分化階段，結(jié)合ALP 的定量檢測(cè)可以較準(zhǔn)確地分析出分化各階段成骨細(xì)胞的活性。骨涎蛋白可與I型骨膠原的α-2鍵結(jié)合，占到非膠原的骨基質(zhì)的5%～10%，這種特性也使骨涎蛋白作為一種促血管形成因子，在組織修復(fù)和重建中具有重要作用［23］。除此之外骨鈣素是僅有成骨細(xì)胞可以合成分泌的酸性蛋白，在鈣化初期表達(dá)較旺盛，也是檢測(cè)成骨細(xì)胞分化成熟特異性較高的標(biāo)志酶。

2 BMSCs分化的影響因素

目前已知有多種細(xì)胞因子、化學(xué)藥物和一些物理刺激如機(jī)械應(yīng)力、氧濃度、電磁場(chǎng)和超聲波等都對(duì)BMSCs增殖分化起到調(diào)控作用。早期的研究者發(fā)現(xiàn)在BMSCs 的體外培養(yǎng)中，加入富血小板血漿可以促進(jìn)其分裂增殖［24］，后來(lái)人們?cè)谘獫{等體液中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并提純了許多促進(jìn)BMSCs 的生長(zhǎng)因子，對(duì)BMSCs的增殖及誘導(dǎo)分化的研究更加系統(tǒng)和深入。

2.1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）對(duì)BMSCs分化的影響

BMP-2 屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）超家族，是目前基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床中應(yīng)用最廣泛的成骨誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子，因其具有誘導(dǎo)BMSCs 向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞定向分化的能力，成骨作用效果顯著且穩(wěn)定，與ALP 具有協(xié)同作用，且能獨(dú)立誘導(dǎo)成骨過(guò)程［25-26］，成為骨組織工程中重要的成骨誘導(dǎo)劑［27-28］。

BMP-2 來(lái)源廣泛，在BMSCs、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞中均有表達(dá)，主要作用于間充質(zhì)干細(xì)胞及成骨細(xì)胞［29］。BMP-2 在體內(nèi)環(huán)境下通過(guò)誘導(dǎo)BMSCs 向骨母細(xì)胞分化成熟進(jìn)而誘導(dǎo)成骨，修復(fù)骨折損傷部位骨組織［30］，在成骨修復(fù)過(guò)程中介導(dǎo)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的骨吸收重建過(guò)程，在誘導(dǎo)成骨及成軟骨過(guò)程的同時(shí)促進(jìn)血管內(nèi)皮因子表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)損傷部位循環(huán)系統(tǒng)的修復(fù)重建，并介導(dǎo)周圍炎癥及免疫應(yīng)答促進(jìn)組織的修復(fù)，在移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療中具有重要作用［31-34］。最近研究發(fā)現(xiàn)除了BMP-2，BMP-6、BMP-7、BMP-9 在促進(jìn)BMSCs成骨分化中具有協(xié)同作用，亦具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)效果［35］。

2.2 激素對(duì)BMSCs的成骨分化作用

目前雌激素在成骨分化的作用上得到廣泛證實(shí)，低濃度的雌激素有促進(jìn)成骨的作用，這也被應(yīng)用在預(yù)防女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥等方面［36-38］。地塞米松常用于抗自身免疫性疾病的治療中，研究者在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)地塞米松可以促進(jìn)BMSCs的成骨及成軟骨分化，并存在濃度依賴性，低濃度呈現(xiàn)誘導(dǎo)分化作用，高濃度（＞10-8M）呈抑制作用［39-43］。

成骨生長(zhǎng)肽（Osteogenic Growth Peptide,OGP）是一類多肽類生長(zhǎng)因子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)OGP 的BMSCs 誘導(dǎo)成骨分化作用，但誘導(dǎo)分化的過(guò)程及結(jié)果存在不確定性，具體生化機(jī)制還需要進(jìn)一步研究［44］。

甲狀旁腺激素具有促進(jìn)破骨細(xì)胞活性升高血鈣濃度的作用，最近體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺激素在與1，25（OH）2VD3聯(lián)合作用時(shí)對(duì)BMSCs成骨分化有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究［45］。

2.3 細(xì)胞因子對(duì)BMSCs分化的影響

TGF-β 對(duì)BMSCs 的誘導(dǎo)分化存在濃度依賴性，低濃度時(shí)促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，高濃度時(shí)增殖減少、誘導(dǎo)分化作用增加［46］。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）是對(duì)骨的再生與重建具有重要的作用，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的遷移和分化。VEGF 與BMP-2 的表達(dá)相互調(diào)節(jié)相互影響，聯(lián)合應(yīng)用生長(zhǎng)因子對(duì)骨缺損修復(fù)具有協(xié)同調(diào)控的作用［47］。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic Fibrob1ast Growth Factor,bFGF）是一種常用的促細(xì)胞分裂劑，是目前發(fā)現(xiàn)對(duì)BMSCs 促分裂增殖能力最強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，目前對(duì)bFGF 介導(dǎo)細(xì)胞分裂增殖過(guò)程的分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其可能與BMP-2 協(xié)同作用促進(jìn)BMSCs的增殖并誘導(dǎo)成骨分化，有多種細(xì)胞因子共同參與，以自分泌或旁分泌形式介導(dǎo)胞內(nèi)及胞外信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟加快骨基質(zhì)的礦化過(guò)程［48-49］。

EPHA2 可通過(guò)增加RUNX2 的表達(dá)促進(jìn)BMSCs的成骨分化，如果RT-PCR檢測(cè)EPHA2的動(dòng)態(tài)變化顯示隨著BMSCs成骨分化數(shù)量的提高其表達(dá)水平也在提高。整合素是細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的重要介質(zhì)，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明整合素具有促進(jìn)BMSCs 成骨分化及增殖的重要作用［50-51］。在BMSCs 分化研究中發(fā)現(xiàn)其在成骨分化與向脂肪細(xì)胞分化是競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)節(jié)［52-53］，在正常生理?xiàng)l件下兩種分化處于向成骨分化的平成狀態(tài)［54-56］。三磷酸腺苷可使BMSCs 成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)增高，而且可抑制向脂肪分化的基因表達(dá)，可能與激活ERK1/2通路有關(guān)。

雙膦酸鹽（Bisphosphates,BPs）在臨床中被用來(lái)治療老年骨質(zhì)疏松癥的常用藥［57-58］。最近實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藥物濃度的不同對(duì)BMSCs的增殖與成骨分化具有較大的影響。低濃度時(shí)誘導(dǎo)成骨作用有所增強(qiáng)，但高濃度時(shí)抑制BMSCs 的增殖及成骨分化，并展現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)［59］。

最近的研究表明，一些他汀類藥物，甘油磷酸鹽、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1［60］（Stromal Cell-Derived Factorl,SDF-1）、Vit C 和β-甘油磷酸鈉可通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、刺激ALP 和骨鈣素的表達(dá)、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分［61-64］。Toll 樣受體激動(dòng)劑、脂多糖［65］，氯化鋰等鋰鈣復(fù)合鹽也可通過(guò)旁分泌作用介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)BMSCs增殖及成骨分化過(guò)程［66］。

BMSCs的成骨分化受多方面生長(zhǎng)因子及蛋白質(zhì)影響，在細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)多方面信號(hào)傳導(dǎo)下調(diào)控其增殖及分化方向，所以對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的研究至關(guān)重要［67］。目前對(duì)BMSCs成骨作用及分化成熟相關(guān)的信號(hào)通路的研究還不成熟，已知的信號(hào)通路有骨形態(tài)發(fā)生蛋白/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 通路［68］、Notch 信號(hào)通路［69-70］、Wnt/β-catenin信號(hào)通路［71-72］等，相信隨著對(duì)信號(hào)通路研究的深入，有助于對(duì)BMSCs 的分化調(diào)節(jié)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控。

2.4 傳統(tǒng)中藥對(duì)BMSCs分化的影響

近年來(lái)涌現(xiàn)出很多中藥提取物對(duì)促進(jìn)BMSCs增殖分化的研究，并取得了大量的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)證實(shí)。中藥及提取物具有獲取方便、價(jià)格低等優(yōu)勢(shì)，并且作用靶點(diǎn)豐富，在作為BMSCs 增殖及定向分化研究方面具有重要應(yīng)用價(jià)值和潛在的發(fā)展前景。

淫羊藿苷是淫羊藿的提取物，是目前研究最早也是最廣泛的BMSCs成骨分化誘導(dǎo)劑，目前大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了其確切的誘導(dǎo)成骨效果［73］。研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷對(duì)BMSCs的增殖與分化的調(diào)節(jié)有Wnt/β-catenin通路、p38MAPK信號(hào)通路等多條信號(hào)通路共同調(diào)控，p38MAPK信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs的分裂增殖且保持細(xì)胞性能的穩(wěn)定［74］，ERα-Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路可促進(jìn)其成骨分化［75］。

麝香酮在體內(nèi)環(huán)境下可促進(jìn)BMSCs 增殖，其誘導(dǎo)成骨分化能力與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)，即低濃度促進(jìn)BMSCs 成骨分化［76］。駱駝蓬堿促進(jìn)了BMSCs 骨形成蛋白的表達(dá)而促進(jìn)成骨分化［77］，鹿茸多肽使骨BMSCs 中ALP 活性增強(qiáng)，間接實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)成骨作用［78］。除此之外，像異補(bǔ)骨脂素［79］、齊墩果酸、川芎嗪［80］、二苯乙烯苷、補(bǔ)腎活血湯［81］、巴戟天及龜板及杜仲提取物［82-87］等諸多中藥成分都對(duì)BMSCs 的增殖誘導(dǎo)成骨分化具有調(diào)節(jié)作用。

2.5 物理因素對(duì)BMSCs分化的影響

除了化學(xué)因素、細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的相互作用外，研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞所處的環(huán)境及物理因素對(duì)BMSCs自身的代謝調(diào)節(jié)和信號(hào)傳導(dǎo)也起到重要作用。

2.5.1 培養(yǎng)環(huán)境中氧濃度、超聲波及電磁場(chǎng)對(duì)BMSCs分化的影響在對(duì)BMSCs 培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)環(huán)境氧濃度的不同對(duì)其增殖產(chǎn)生不同的影響，高氧濃度會(huì)促進(jìn)BMSCs 的成骨分化，低氧則會(huì)起抑制作用［88-89］。目前低強(qiáng)度超聲波在臨床尤其是治療骨折延遲愈合和骨不連領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣泛，研究發(fā)現(xiàn)超聲波通過(guò)在骨不連區(qū)域制造“微骨折”來(lái)影響局部溶骨及成骨代謝的機(jī)制治療骨不連，還可通過(guò)調(diào)節(jié)c-fos 及COX-2 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)BMSCs 成骨分化和成熟，加快骨基質(zhì)鈣化過(guò)程［90］。近年來(lái)研究者在實(shí)驗(yàn)室對(duì)大鼠BMSCs 的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)電磁場(chǎng)性質(zhì)或強(qiáng)度的變化對(duì)BMSCs增殖及成骨分化有不同的作用。正弦波及低頻電磁波對(duì)BMSCs 成骨分化有促進(jìn)作用，高頻電磁波則抑制細(xì)胞分裂增殖，這可能與細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷表達(dá)影響細(xì)胞代謝水平有關(guān)，具體機(jī)制還要進(jìn)一步的研究［91-93］。

2.5.2 培養(yǎng)環(huán)境中力學(xué)的變化對(duì)BMSCs 分化的影響在體內(nèi)環(huán)境中骨可對(duì)外在機(jī)械應(yīng)力和牽張力產(chǎn)生適應(yīng)性變化，比如牽張力作用于骨后，成骨相關(guān)基因ALP、DcⅣ表達(dá)水平增高［94］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)BMSCs所處環(huán)境的機(jī)械力學(xué)與其貼附生長(zhǎng)的基底剛度對(duì)其增殖分化有著重要影響。研究者在實(shí)驗(yàn)中改變細(xì)胞周圍力學(xué)的性質(zhì)來(lái)觀察BMSCs的動(dòng)態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外液的剪切力與牽張力使BMSCs向成骨分化增多，而靜水壓力的增高會(huì)使成軟骨基因的表達(dá)增高促進(jìn)其向軟骨分化［95］，但具體的機(jī)制尚未清晰，可能與細(xì)胞間電信號(hào)的改變和細(xì)胞因子間的相互作用有關(guān)，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)與蛋白質(zhì)的合成，且不同組織細(xì)胞對(duì)機(jī)械力的感受器敏感度不同所以其作用效果也有差異［96-98］。

BMSCs 根據(jù)誘導(dǎo)條件的不同可以向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等分化，體外培養(yǎng)時(shí)貼附材料基底力學(xué)的不同對(duì)其分化也可產(chǎn)生不同的影響，即基底支架材料的力學(xué)性能也是BMSCs 定向分化的誘導(dǎo)因素，且各種定向分化的適宜材料的力學(xué)性能各不相同［99-101］。目前對(duì)機(jī)械力學(xué)與BMSCs的關(guān)系研究較少，實(shí)驗(yàn)室中主要是通過(guò)改變BMSCs 貼附的支架材料后對(duì)干細(xì)胞分化進(jìn)行定性定量分析，間接得到基底的機(jī)械力學(xué)對(duì)BMSCs 增殖分化的影響，也有研究者使用更先進(jìn)的機(jī)械生物反應(yīng)器來(lái)測(cè)量機(jī)械力學(xué)對(duì)干細(xì)胞增殖分化的影響［102］。隨著對(duì)BMSCs 與機(jī)械力學(xué)相互影響的研究更加深入，為調(diào)節(jié)BMSCs的增殖分化和選擇合適的支架材料有了更廣闊的思路，為未來(lái)骨缺損的治療提供強(qiáng)大的理論支撐和技術(shù)支持。

2.6 BMSCs增殖分化中的雙向免疫調(diào)節(jié)性

研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)環(huán)境中BMSCs的活性受周圍炎癥因子的影響又反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答［103］，這種特性在體外重塑BMSCs載體中具有重要作用。

研究者發(fā)現(xiàn)BMSCs對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)具有雙向性和可塑性，具有反饋式雙向免疫調(diào)節(jié)性即雙向免疫調(diào)節(jié)性，雙向性與炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和性質(zhì)密切相關(guān)，有NK 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞參與，一氧化氮合成酶在局部反應(yīng)中起到重要調(diào)節(jié)作用。

炎癥反應(yīng)所產(chǎn)生的白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子α、干擾素-γ［104］等刺激BMSCs 對(duì)一氧化氮合成酶的表達(dá)增高，一氧化氮合成酶在局部產(chǎn)生NO 抑制T 細(xì)胞的活性來(lái)發(fā)揮免疫抑制作用。其次BMMSCs可通過(guò)旁分泌作用，抑制B淋巴細(xì)胞活性及趨化因子的表達(dá)減低炎癥反應(yīng)［105］。另一方面，BMSCs 通過(guò)旁分泌表達(dá)如RANTES、CXCL-9 等炎性趨化因子，招募周圍的T 淋巴細(xì)胞向BMSCs 遷移促進(jìn)炎癥反應(yīng)，這在體外實(shí)驗(yàn)中亦得到證實(shí)［106-107］。

BMSCs對(duì)周圍炎癥的促進(jìn)或抑制作用多與炎癥反應(yīng)的水平與刺激有關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)低水平的炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)BMSCs 炎性趨化因子表達(dá)增加，并促進(jìn)成熟T 細(xì)胞的增殖促進(jìn)炎癥反應(yīng)［108］。相反，當(dāng)局部IFN-γ、TNF-α 等炎癥因子水平較高時(shí)，BMSCs 對(duì)一氧化氮合成酶的表達(dá)更加活躍，使得T 淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞活性受抑制，從而起到負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用［109］。目前對(duì)BMSCs 免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制尚存在許多問題，總體來(lái)說(shuō)，BMSCs對(duì)免疫調(diào)節(jié)的雙向性依賴于炎性反應(yīng)的強(qiáng)度，而對(duì)免疫調(diào)節(jié)的結(jié)果在總體上是促進(jìn)骨骼及軟組織的再生與修復(fù)［110-111］。

3 BMSCs的臨床應(yīng)用

3.1 BMSCs在骨疾病中的應(yīng)用

BMSCs 對(duì)于骨、軟骨及肌腱等軟組織修復(fù)的治療中具有潛在的應(yīng)用前景和重要的臨床意義。早期有臨床實(shí)驗(yàn)中將骨髓血引至骨缺損處或直接將分離提純過(guò)的BMSCs 通過(guò)局部注射的方法，在機(jī)體自身體液環(huán)境中誘導(dǎo)BMSCs 成骨分化而修復(fù)缺損，目前被廣泛應(yīng)用在骨缺損、骨折不愈合和骨性關(guān)節(jié)炎的臨床實(shí)驗(yàn)和治療中［112］。有研究者將純化后的BMSCs經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)與纖維蛋白聯(lián)合通過(guò)局部注射的方法治療萎縮性骨不連并取得了良好的治療效果［113］。許多研究結(jié)果顯示BMSCs 的自我增殖分化能力對(duì)降低股骨頭壞死的發(fā)生具有重要意義［114］。

目前通過(guò)BMSCs治療骨缺損的方法有腔內(nèi)局部注射、復(fù)合載體支架填充等方法，這對(duì)軟骨和骨缺損具有不同的臨床意義。Osugi 等［115］在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BMSCs分泌的細(xì)胞因子與周圍組織微環(huán)境的相互作用和驅(qū)化性，BMSCs 可定向遷移至骨缺損處促進(jìn)骨折的修復(fù)。Dogan 等［116］構(gòu)建股骨缺損模型，將BMSCs 移植到含硼的聚乳酸一羥基乙酸共聚物（PLGA）支架中，結(jié)果顯示，含硼PLGA 支架可提高OC、I型膠原蛋白表達(dá)水平。Wei等［117］證實(shí)聚己內(nèi)酯（PCL）支架可以促進(jìn)BMSCs 增殖和分化，增強(qiáng)骨形成與骨整合。

3.2 BMSCs在其它疾病中的應(yīng)用

3.2.1 BMSCs 在組織器官修復(fù)中的應(yīng)用在一些肺纖維化等肺部間質(zhì)性疾病治療中，BMSCs 可通過(guò)旁分泌的方式與周圍單核細(xì)胞相互作用減少炎性反應(yīng)，促進(jìn)炎癥修復(fù)而減緩肺部纖維化進(jìn)程［118］。有一些臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將自體BMSCs 靜脈注射到急性心肌梗死的患者體內(nèi)，其心功能得到明顯改善且沒有明顯并發(fā)癥的發(fā)生［119］。這種治療方法在腦梗塞患者治療中亦得到良好的效果，其可減少顱內(nèi)局部缺血區(qū)炎性細(xì)胞的聚集，有效減輕缺血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，并且在神經(jīng)功能恢復(fù)方面有促進(jìn)作用［120-121］。

3.2.2 BMSCs 在器官移植中的應(yīng)用有學(xué)者提出由于BMSCs 低免疫原性的特性，能逃避免疫監(jiān)視［122］，行同種異體BMMSCs 移植依然具有優(yōu)秀的治療效果，但在獲取人異體干細(xì)胞時(shí)要對(duì)供體進(jìn)行病原微生物學(xué)與家族史等安全性篩查。目前將自體分離純化后的BMSCs 進(jìn)行體外擴(kuò)增，再定向移植到某組織和器官中，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)增殖后修復(fù)重建器官已取得了明確的成效，如椎間盤、肝臟［123-125］等。Mohamed等［126］報(bào)告指出，BMSCs 在高血壓腎病中具有改善腎小球?yàn)V過(guò)功能和腎小管重吸收作用，并且可逆轉(zhuǎn)病理結(jié)構(gòu)，這是現(xiàn)有藥物中所不具備的。

研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)組織器官的修復(fù)不僅是細(xì)胞增殖分化作用，BMSCs 分泌的多種生長(zhǎng)因子參與調(diào)節(jié)組織微環(huán)境，促進(jìn)周圍血管重建與內(nèi)源性細(xì)胞增殖等［127］。在體內(nèi)環(huán)境下BMSCs 通過(guò)旁分泌對(duì)前列腺素E2和TGF-β的調(diào)控作用，對(duì)自身免疫性疾病、減少免疫排斥等治療提供一種新的思路［128］。目前雖然發(fā)現(xiàn)BMSCs可以分化并修復(fù)多種不同類型的組織及器官，但對(duì)其修復(fù)的具體分子生物學(xué)機(jī)制尚未十分清晰，總體而言，BMSCs的損傷修復(fù)作用一方面是其分化替代能力，另一方面是其與周圍細(xì)胞組織及免疫系統(tǒng)的相互作用和旁分泌功能，營(yíng)造出適宜的微環(huán)境共同調(diào)節(jié)組織器官的增殖與分化過(guò)程［129-130］。

4 BMSCs復(fù)合支架材料修復(fù)骨缺損

BMSCs結(jié)合支架材料治療骨缺損的研究已有幾十年的歷史，傳統(tǒng)的高分子材料與金屬缺乏天然骨的仿生性和力學(xué)性能且易出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)等并發(fā)癥，不適合應(yīng)用于BMSCs的載體支架。

4.1 BMSCs復(fù)合支架材料在骨缺損的應(yīng)用

磷酸鈣最早在20 世紀(jì)末就被作為骨缺損替代材料之一，磷酸鈣廣泛存在于人體的無(wú)機(jī)材料中，其具有優(yōu)秀的生物相容性且能調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣離子與磷離子的濃度影響骨質(zhì)礦化，且具有成骨誘導(dǎo)特性被廣泛應(yīng)用于骨水泥、磷酸鈣陶瓷與骨缺損支架等材料中［131-132］。磷酸鈣骨水泥是常用于骨缺損的填充物，但其脆性大、強(qiáng)度低，在承重方面具有很大缺陷［133］。Boehm 等［134］對(duì)磷酸鈣結(jié)合了碳纖維材料制成聚磷酸鈣纖維復(fù)合材料，改善了材料的韌性和剛度進(jìn)而大大提高了其作為骨填充物或支架材料的力學(xué)性能。成骨細(xì)胞是否能在骨缺損替代材料上貼附并增殖決定著支架材料的生物學(xué)活性。近年來(lái)伴隨著骨組織工程的深入研究，研究者將BMSCs 培養(yǎng)基引入磷酸鈣支架中，其成骨作用提高了BMSCs 的增殖與成骨分化效率亦增強(qiáng)了磷酸鈣支架的生物相容性［135］。

4.2 BMSCs復(fù)合支架材料在軟骨缺損的應(yīng)用

近年來(lái)BMSCs復(fù)合支架材料制成的三維軟骨修復(fù)材料得到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，在相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了諸多成果。研究表明BMSCs在成軟骨分化是以逐層分化疊加成多層復(fù)合體結(jié)構(gòu)［136-137］。Tali 等［138］將BMSCs 作為種子細(xì)胞，結(jié)合誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基成功制作出具有生物活性的體外軟骨，并植入在大鼠的骨缺損模型中取得了理想的修復(fù)效果，且沒有出現(xiàn)明顯的并發(fā)癥。Cap1an 等［139］在體外利用BMSCs制作成全層軟骨損傷模型再將其植入兔膝關(guān)節(jié)處，經(jīng)培養(yǎng)觀察后發(fā)現(xiàn)損傷模型處長(zhǎng)出新生軟骨，同樣達(dá)到了損傷修復(fù)的目的。

5 生物3D打印技術(shù)

生物3D 打印技術(shù)是傳統(tǒng)3D 打印技術(shù)結(jié)合干細(xì)胞組織工程技術(shù)的擴(kuò)展運(yùn)用，是一種新型的快速成型技術(shù)。3D 打印技術(shù)在上個(gè)世紀(jì)80年代逐漸開始發(fā)展運(yùn)用，在近幾十年的發(fā)展中3D 打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)需求的個(gè)性化、精準(zhǔn)化和產(chǎn)業(yè)化，近年來(lái)3D生物打印技術(shù)蓬勃發(fā)展，在醫(yī)學(xué)相關(guān)材料的設(shè)計(jì)與制備取得了重要的成果。

5.1 生物3D打印技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

3D生物打印技術(shù)核心的三大構(gòu)成要素為：干細(xì)胞（種子細(xì)胞）、支架材料和生長(zhǎng)因子。目前骨缺損特別是較大體積的骨缺損是臨床治療中常需面臨的困擾，最常應(yīng)用于較大骨缺損的治療方法是自體或人工骨移植，但因?yàn)槎问中g(shù)對(duì)患者的損傷和材料來(lái)源的受限限制了其廣泛應(yīng)用，且人工骨存在造價(jià)昂貴、潛在的免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)和構(gòu)造建模缺乏特異性等弊端。近年來(lái)生物3D打印骨缺損得到了越來(lái)越多的關(guān)注，其解決了人工骨和同種異體骨在免疫排斥和倫理問題方面的缺陷，可在計(jì)算機(jī)輔助下利用CT、MRI成像技術(shù)對(duì)骨缺損部位進(jìn)行精確設(shè)計(jì)，尤其對(duì)于頜面部骨缺損等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的修復(fù)中具有強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)，并可制造出與缺損骨完全匹配的3D替代支架［140］。

與原始骨缺損填充支架不同的是其在機(jī)械強(qiáng)度和微觀空間結(jié)構(gòu)上可與人體骨組織相似，支架材料的無(wú)毒性和可溶解性使BMSCs作為種子細(xì)胞在支架內(nèi)三維生長(zhǎng)后可達(dá)到與缺損骨組織的完全替代整合，是對(duì)骨缺損疾病具有廣泛前景的新型治療技術(shù)。國(guó)內(nèi)學(xué)者張鈺［141］通過(guò)3D 打印技術(shù)成功設(shè)計(jì)并制造出了在孔徑結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能與天然骨質(zhì)相似的仿生人工踝關(guān)節(jié)，在打印精度和材料設(shè)計(jì)中都取得了重要突破。He 等［142］利用3D 生物打印技術(shù)制備了人膝關(guān)節(jié)仿生骨假體，具有良好的生物相容性和力學(xué)性能，在與人體關(guān)節(jié)空間結(jié)構(gòu)匹配精確度方面較傳統(tǒng)人工假體明顯提高。

5.2 生物3D打印技術(shù)的打印程序

目前在結(jié)合3D 打印的骨組織工程中，如何打印出具有生物活性的載體是研究的熱點(diǎn)。打印過(guò)程中溫度過(guò)高或局部壓力過(guò)強(qiáng)都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的失活，種子細(xì)胞周圍的基質(zhì)成分和各種細(xì)胞因子所構(gòu)成的微環(huán)境也極其關(guān)鍵。

目前國(guó)際中主流的打印程序有兩種：一種方式是需要2 個(gè)以上不同特性的打印噴頭，將BMSCs 與原始支架材料同時(shí)復(fù)合打印，優(yōu)勢(shì)是打印完成即具有所需的生物活性，但對(duì)打印要求高，打印溫度和打印速度稍有調(diào)動(dòng)即可造成細(xì)胞的失活和打印的失?。?43］。另一種是根據(jù)設(shè)計(jì)的載體材料預(yù)先打印出仿生骨的原始支架，再將分離培養(yǎng)的BMSCs 及基質(zhì)液在原始支架中種植，通過(guò)傳代培養(yǎng)和誘導(dǎo)成骨分化后最終形成有活性的三維骨組織修復(fù)材料，此種方式是目前最常用于生物骨的打印，優(yōu)勢(shì)是操作方便、技術(shù)難度低和成活率高，但缺點(diǎn)是培養(yǎng)周期相對(duì)較長(zhǎng)［144-146］。

5.3 生物3D打印技術(shù)的原理

生物3D打印技術(shù)的主要步驟為通過(guò)醫(yī)學(xué)成像在計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)建模后，運(yùn)用適宜的打印技術(shù)將原料打印出成品的過(guò)程。目前在干細(xì)胞組織工程中應(yīng)用于生物3D 打印技術(shù)有噴墨打印技術(shù)、選擇性激光燒結(jié)技術(shù)（Selective Laser Sintering,SLS）、光固化成型技術(shù)（Stereo Lithography Apparatus,SLA）和熔融沉積成型技術(shù)（Fused Deposition Modeling,FDM）等［147］，3D 打印技術(shù)對(duì)細(xì)胞分布的可控性建模的自由選擇性是應(yīng)用于骨組織工程的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)［148］。每種打印技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，不同的環(huán)境溫度、結(jié)構(gòu)應(yīng)力對(duì)生物材料的影響不同，應(yīng)根據(jù)打印材料的選擇選取合適的打印方法。

噴墨打印是最早被應(yīng)用的打印技術(shù)，但打印精度不高、力學(xué)性能較差在仿生骨的生物活性材料中運(yùn)用較局限。FDM 技術(shù)操作簡(jiǎn)單、無(wú)用損耗少且成本低是目前最常用的生物3D打印技術(shù)。其將原材料加熱呈熔溶態(tài)，噴頭在計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)程序下將原料噴出，通過(guò)逐層累加的方式構(gòu)建所需模型，但其溫度較高，在打印過(guò)程中含藥物載體和細(xì)胞中極易損傷變性，所以常先打印固態(tài)支架再在原支架上接種種子細(xì)胞進(jìn)行二次培養(yǎng)的方法獲得生物活性的載體［149］。

Hong 等［150］將聚己內(nèi)酯/聚乳酸復(fù)合材料通過(guò)FDM 技術(shù)在大鼠的骨缺損模型中得到成功的實(shí)驗(yàn)。SLA 技術(shù)在骨組織工程中應(yīng)用較早，其打印精度較高，材料可在納米級(jí)進(jìn)行操作，常使用聚己內(nèi)酯、聚乳酸和特殊蛋白質(zhì)等光敏材料，使用的亦是逐層打印技術(shù)，利用材料的光敏性用激光進(jìn)行定點(diǎn)雕刻而固態(tài)成形［151-152］。SLS 技術(shù)與SLA 相似，但取材廣泛，不受光敏性的約束，像羥基磷灰石、PCL 和明膠類蛋白均可采用，在骨和軟骨構(gòu)建中廣泛實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用［153］。

5.4 生物3D打印的載體及支架材料

在骨組織工程技術(shù)的三大要素里，合適的支架材料決定著BMSCs的成活及增殖，支架的力學(xué)性能、微觀結(jié)構(gòu)的空隙結(jié)構(gòu)、支架材質(zhì)仿生性對(duì)支架內(nèi)細(xì)胞外微環(huán)境的形成、BMSCs 的成骨誘導(dǎo)分化及其三維生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)至關(guān)重要［154-155］。

5.4.1 生物3D 打印的骨組織支架的必備條件3D 打印的骨組織支架常需要具備以下幾個(gè)生物學(xué)性能：①支架材料的生物相容性與骨誘導(dǎo)性：移植后不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)是移植物成活的基礎(chǔ)也是移植材料發(fā)揮其生物活性的首要前提，這與支架材料的選取、純度有關(guān)；材料可與BMSCs 相互作用進(jìn)而誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞［156-158］；②支架材料的空間結(jié)構(gòu)和適宜的孔隙：支架材料表面易于細(xì)胞附著，仿生骨材料的活性關(guān)鍵在于BMSCs 在支架內(nèi)的三維生長(zhǎng)，所以材料內(nèi)部孔隙的相互連接至關(guān)重要，三維孔隙結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞外液的流通，可使生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均勻作用于種子細(xì)胞并為其內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的建立創(chuàng)造條件，還可將細(xì)胞代謝產(chǎn)物通過(guò)開放的細(xì)胞外微環(huán)境運(yùn)輸排泄?？讖?、孔隙的分布和密度與支架結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度密切相關(guān)，而且生物支架的降解效率也與支架的孔隙率和表面積有關(guān)；③支架的力學(xué)性能和機(jī)械強(qiáng)度：適宜的機(jī)械強(qiáng)度和硬度不僅可以為人體骨骼系統(tǒng)做支撐作用還是對(duì)BMSCs完成成骨分化前的保護(hù)，BMSCs 在增殖分化過(guò)程中對(duì)周圍環(huán)境的力學(xué)刺激和不同剛度的基底產(chǎn)生反饋?zhàn)饔糜绊懽陨淼脑鲋撑c分化方向，學(xué)者們常稱之為機(jī)械力學(xué)微環(huán)境，是調(diào)節(jié)BMSCs 增殖分化非常重要的元素［159-161］。

除此之外，還有由于材料的選擇不同可表現(xiàn)出一些特殊的特性，比如可降解性等。這些諸多的生物學(xué)特性與BMSCs及細(xì)胞因子共同構(gòu)成了生物學(xué)支架的微環(huán)境，各因素之間的相互作用共同調(diào)整著BMSCs的增殖與分化［162］。

5.4.2 生物3D打印骨組織載體及支架材料的選擇在骨缺損3D生物支架材料的選擇中，需要根據(jù)缺損骨的生理功能和受力情況及生物相容性選取適宜的支架材料，還要將BMSCs在支架材料中黏附、增殖和分化等問題考慮在內(nèi)。目前，應(yīng)用于生物3D打印的支架材料主要分為兩類：一類是天然高分子生物材料，如膠原蛋白、海藻酸鹽、明膠、纖維蛋白和殼聚糖等［163-165］，其來(lái)源廣泛，主要由動(dòng)植物體內(nèi)獲?。涣硪活愂侨斯ず铣傻母叻肿由锊牧?，如磷酸三鈣、羥基磷灰石、聚乙醇酸、聚乳酸、聚氨基酸和納米陶瓷類等［166-175］。

目前隨著對(duì)3D 打印生物支架功能要求的提高，研究從單一的材料打印技術(shù)向復(fù)合基因工程、低溫技術(shù)和固液相分離技術(shù)制作與內(nèi)環(huán)境鍥合的多功能復(fù)合材料轉(zhuǎn)變。比如打印設(shè)計(jì)在支架孔隙表面可置的藥物或細(xì)胞載體，細(xì)胞不但可以在支架表面貼附生長(zhǎng)，而且可以復(fù)合生長(zhǎng)因子、抗菌藥物等制成藥物緩釋的載藥活性支架，聚乳酸就是一種常用的人工合成的聚酯類高分子，可結(jié)合3D 打印技術(shù)在支架中制作藥物緩釋載體結(jié)構(gòu)預(yù)防植入后感染等；還可以利用磷脂雙分子層的微球脂質(zhì)結(jié)構(gòu)將藥物置入其中制作支架，來(lái)達(dá)到藥物控釋的目的；利用基因工程將BMP-2 導(dǎo)入復(fù)合材料的載體細(xì)胞中，達(dá)到直接誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的目的等［176-180］。

6 常用的生物3D打印骨組織載體及支架材料

目前根據(jù)局部骨缺損的特性構(gòu)建具有優(yōu)秀的生物相容性、合適的力學(xué)性能和空間結(jié)構(gòu)的個(gè)性化支架材料是骨組織工程研究的方向，以下是目前研究中流行的支架材料。

6.1 羥基磷灰石

骨的主要礦化無(wú)機(jī)成分是羥基磷灰石結(jié)晶［181］，目前3D生物打印材料多是以人工高分子材料與天然高分子材料相結(jié)合，如以羥基磷灰石為原料復(fù)合一些如聚乙烯醇、絲素蛋白、鹿瓜多肽等有機(jī)材料進(jìn)行。羥基磷灰石具有優(yōu)秀的組織相容性和骨誘導(dǎo)性［182］，可自行被組織吸收，但其脆性較高，單純運(yùn)用機(jī)械強(qiáng)度欠缺，因其性質(zhì)活潑、其上化學(xué)基團(tuán)易與離子或其他生物制劑發(fā)生反應(yīng)，影響支架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［183］。

6.2 磷酸三鈣

Solaiman 等［184］以磷酸三鈣為基礎(chǔ)原料運(yùn)用3D生物打印技術(shù)設(shè)計(jì)出了在力學(xué)性能和材料孔隙與天然骨相似的支架材料，并在骨缺損的治療中取得了滿意的效果。β-磷酸三鈣復(fù)合羥基磷灰石材料增加了材料的韌性和強(qiáng)度的缺陷且具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟的作用［185-186］。Gronthos等［187］成功運(yùn)用β-磷酸三鈣混合材料植入干細(xì)胞制備出具有正常生物活性的牙槽骨組織。

6.3 海藻酸鹽

海藻酸鹽的化學(xué)性質(zhì)與羥基磷灰石相似，通過(guò)對(duì)海藻酸鹽的化學(xué)修飾與添加其他材料賦予了其作為仿生骨支架更優(yōu)秀的生物學(xué)特性，在骨與軟骨材料的支架模型中被廣泛運(yùn)用。將聚乙二醇與海藻酸鹽制成混合膠體原料，可增強(qiáng)打印材料的韌性和彈性［188］。聚乳酸一羥基乙酸共聚物具有良好的生物相容性，在體內(nèi)可降解為羥基乙酸與乳酸，材料和降解產(chǎn)物的生物相容性良好，其與海藻酸鹽制成混合材料使干細(xì)胞對(duì)支架表面的黏附性提高并可促進(jìn)軟骨的分化成熟［189］。納米碳化羥基磷灰石海藻酸鹽調(diào)節(jié)了羥基磷灰石的降解速率，使植入材料與骨組織整合加快并具有誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞再生的能力［190］。

6.4 絲素蛋白

體外對(duì)BMSCs進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中某些蛋白質(zhì)的含量提高促進(jìn)了其成軟骨分化，后來(lái)人們對(duì)其分離純化證明了絲素蛋白對(duì)促BMSCs的增殖和成軟骨分化具有促進(jìn)作用。目前以絲素蛋白做為軟骨支架的組成成分和誘導(dǎo)劑得到了廣泛認(rèn)同和運(yùn)用［191-194］。

6.5 殼聚糖

殼聚糖是一種天然氨基多糖，其本身具有抑菌性和可降解性，經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾或加入其它材料如羥磷灰石可以增強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度在骨和軟骨支架材料的研究中應(yīng)用廣泛，其親水層易于細(xì)胞的黏附增殖，還具有促進(jìn)骨基質(zhì)礦化的作用。通過(guò)低溫3D生物打印技術(shù)將海藻酸鹽與殼聚糖制備出混合材料支架，綜合了兩種材料的優(yōu)勢(shì)設(shè)計(jì)出了生物活性和組織相容性極佳的支架材料［195-196］。Chen 等［197］將殼聚糖與羥基磷灰石經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾制備出殼聚糖-P24/羥基磷灰石復(fù)合材料支架，材料對(duì)P24的釋放具有控釋性且可誘導(dǎo)BMSCs 成骨分化，進(jìn)而提高支架材料與骨質(zhì)的整合與骨缺損修復(fù)效率。

6.6 膠原材料

膠原材料特別是I 型膠原在骨組織工程中應(yīng)用廣泛，主要參與對(duì)軟骨支架材料的構(gòu)成。膠原復(fù)合其他材料在制造軟骨缺損模型和營(yíng)造骨外微環(huán)境中具有重要作用。將纖維蛋白等整合素加入膠原中制成材料具有促進(jìn)BMSCs 黏附增殖作用，復(fù)合陶瓷制成明膠-陶瓷支架植入種子細(xì)胞后促進(jìn)軟骨分化成熟并促進(jìn)膠原的分泌合成［198-200］。

凝膠含水量高、保水性能好、結(jié)構(gòu)具有可塑性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，還滿足構(gòu)建人工仿生骨的可降解性的要求，所以在軟骨支架材料中得到關(guān)注。水凝膠培養(yǎng)基更適合軟骨結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)，梯度交聯(lián)水凝膠使細(xì)胞呈3D生長(zhǎng)模式，培養(yǎng)基可以模擬體內(nèi)環(huán)境，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和分化等過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控和干預(yù)。研究者將種子細(xì)胞接種在3D 打印的水凝膠基質(zhì)中制作人耳軟骨支架，并得到了具有生物學(xué)活性的仿生耳［201］。透明質(zhì)酸是一種天然的高分子聚合物也是細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分，研究者將透明質(zhì)酸加入水凝膠中提高了材料的力學(xué)性能和生物活性，還促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)支架材料的黏附性，促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化［202］。

6.7 聚乙二醇

聚乙二醇具有良好的水溶性和生物相容性，由聚乙二醇制成的支架材料的韌性和機(jī)械強(qiáng)度與軟骨相近［203］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)軟骨周圍基質(zhì)的合成分泌［204］。國(guó)外學(xué)者將成熟的軟骨細(xì)胞和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯利用3D打印技術(shù)制備出可以直接填補(bǔ)修復(fù)的生物活性材料，填補(bǔ)材料不但在機(jī)械力學(xué)性能與自然軟骨組織相似，在組織成分及內(nèi)部結(jié)構(gòu)上與軟骨組織更加相容，這也是充分發(fā)揮了3D打印技術(shù)對(duì)材料堆積的精確控制的優(yōu)勢(shì)［205］。Tay等［206］將聚乙烯醇和聚己內(nèi)酯作為原料，通過(guò)3D 打印制備的支架在機(jī)械強(qiáng)度、微觀結(jié)構(gòu)的空間孔隙分布和連通性能均取得了較滿意的性能。

6.8 人工高分子與天然高分子復(fù)合材料

有研究者將人工高分子材料與天然高分子材料相結(jié)合制成復(fù)合材料。比如將聚乳酸與羥基磷灰石粉末結(jié)合制成復(fù)合材料［207］，新材料將羥基磷灰石優(yōu)秀的組織相容性和聚乳酸的材料韌性相結(jié)合，不但具有誘導(dǎo)BMSCs增殖分化的能力還改良了傳統(tǒng)材料的機(jī)械性能和基底剛度，是骨組織工程材料制備的優(yōu)秀嘗試。與此類似的還有聚醚醚酮（PEEK），PEEK 是一種熔點(diǎn)較高且具有良好的生物相容性的3D 打印材料，因打印材料具有良好的熱穩(wěn)定性得到廣泛關(guān)注，除此之外其支架材料的強(qiáng)度高、耐磨性好和良好的韌性是仿生骨材料制備的重要優(yōu)勢(shì)［208-209］。賴毓霄等［210］將鎂等金屬材料與PLGA、β-磷酸三鈣采用低溫3D打印技術(shù)制備出的復(fù)合材料支架材料具有誘導(dǎo)新生血管的長(zhǎng)入和BMSCs 成骨分化的作用，并且具有生物可降解性且孔隙率佳，并增加了材料的機(jī)械強(qiáng)度。

6.9 生物活性玻璃材料

目前一些生物活性玻璃材料具有抗菌性等生物活性在骨組織支架的研發(fā)中得到廣泛關(guān)注。在體外將干細(xì)胞中培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)45S5生物活性玻璃可調(diào)控基因的表達(dá)，使成骨相關(guān)基因表達(dá)增高，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)成骨分化的作用并且誘導(dǎo)周圍血管的長(zhǎng)入［211-212］。但是玻璃支架有材料脆性高、機(jī)械強(qiáng)度較弱等缺點(diǎn)，有研究者對(duì)其復(fù)合磷酸鈣、橡膠等材料不斷探索改良其機(jī)械強(qiáng)度［213］。

6.10 抗菌材料

移植物感染是移植手術(shù)后嚴(yán)重的并發(fā)癥，骨的修復(fù)能力會(huì)因周圍組織的感染、微循環(huán)障礙或機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)不佳而受抑制［214］。移植物良好的抑菌性能是生物活性支架發(fā)揮功能的重要前提。由于仿生骨材料需要適宜的空間孔隙和易于細(xì)胞貼附的基底，這恰恰也是細(xì)菌易在支架材料表面黏附聚集的原因。

3D打印支架材料可將藥品或者抑菌成分如萘夫西林鈉、硝基呋喃妥因等精確打印在支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)中起到抗菌效果，并且可以預(yù)先判斷預(yù)植物可能感染的菌種設(shè)計(jì)出特異性抗菌支架，取得了滿意的效果［215-216］。伍衛(wèi)剛等［217］利用生物3D 打印技術(shù)制備了一種載藥人工骨，可將抗菌藥物精確堆積，達(dá)到藥物控釋性。有研究者提出可利用類固醇的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)將抗菌藥物注入其中，這不但可利用類固醇誘導(dǎo)BMSCs 成骨分化，還可加強(qiáng)對(duì)骨缺損部位感染的控制能力［218］。但目前3D 打印抗菌材料仍處于初始研究階段，相信其作為抗感染材料的制作技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。

7 生物3D打印材料的活性基礎(chǔ)

經(jīng)過(guò)3D生物打印出具有生物活性的支架材料是骨缺損修復(fù)的第一步，然而，生物活性支架能否在受體存活受多方面因素的影響，最重要的就是支架材料能否建立有效的血液循環(huán)。良好的血液循環(huán)給予BMSCs生長(zhǎng)增殖所需要充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并帶走代謝廢物，如果沒有建立必須的循環(huán)微環(huán)境則支架材料中的干細(xì)胞及生物活性成分死亡或失效，最終導(dǎo)致移植的失敗并可能出現(xiàn)如感染、自體免疫攻擊等并發(fā)癥。

目前就移植支架多通過(guò)添加生長(zhǎng)因子如骨涎蛋白、BMP-2、VEGF 等，不但具有誘導(dǎo)成骨分化還可誘導(dǎo)新生血管生成的復(fù)合材料，這種具有成骨和誘導(dǎo)新生血管雙重作用的現(xiàn)像叫做成骨-血管生成耦聯(lián)［219］，在骨質(zhì)和軟組織修復(fù)中具有重要意義，還有一些支架材料如β-磷酸三鈣、聚乙烯醇卡拉膠等材料本身也具有誘導(dǎo)血管生成的作用，諸多方法都為3D 生物打印支架移植后的成活建立了研究思路［220］。

隨著3D 生物打印技術(shù)的發(fā)展，打印精度越來(lái)越高。國(guó)內(nèi)學(xué)者從恒河猴取自體干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)體外增殖分化篩選出種子細(xì)胞，利用3D 生物打印技術(shù)成功制備出了血管組織，將打印的血管替換了恒河猴體內(nèi)2 cm 的腹主動(dòng)脈，術(shù)后并無(wú)明顯并發(fā)癥的發(fā)生。Lee 等［221］利用活體細(xì)胞和組織打印出了直徑1 mm的具有生物活性的血管組織，這一技術(shù)使3D 生物打印技術(shù)在微米級(jí)材料制備中取得了重大突破，這為支架材料建立血液供應(yīng)提供了有力的技術(shù)支持。3D打印血管與傳統(tǒng)人工血管不同，3D 打印的血管管徑不但更細(xì)小，而且血管壁結(jié)構(gòu)與天然血管相似，都具有外膜、中膜和內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，這使得血管保持良好的彈性等生物活性［222］。一般移植傳統(tǒng)人工血管的壽命是10年，移植后因移植物材料的原因需要終身使用抗凝藥物，但3D 生物打印出的血管組織具有優(yōu)秀的生物相容性，僅需要在術(shù)后5 d 使用抗凝藥且無(wú)需更換血管［223-224］。

8 總結(jié)與展望

目前，雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)生物3D 打印支架材料的研發(fā)和運(yùn)用取得了一些進(jìn)展，但在臨床運(yùn)用中依然處于實(shí)驗(yàn)階段，BMSCs 的誘導(dǎo)分化及支架材料的取材依然存在許多問題。

BMSCs是骨組織工程中治療骨缺損最理想的種子細(xì)胞，但在不同人群和不同年齡中BMSCs 的活性不同，BMSCs在骨髓單核細(xì)胞的比例、增殖能力和分化潛能隨著年齡的增長(zhǎng)而不斷降低，并不是所有人都具有提取適應(yīng)癥［225-226］。雖然BMSCs 成骨分化的誘導(dǎo)劑種類諸多，對(duì)其細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)通路及作用機(jī)制的研究愈加深入和全面，但目前還沒有一種誘導(dǎo)因子能夠?qū)崿F(xiàn)BMSCs 的精確定向分化，對(duì)實(shí)現(xiàn)BMSCs體外增殖和分化的可控性依然是研究的熱點(diǎn)和難題。

雖然BMSCs 具有低免疫原性和免疫逃避能力，且可經(jīng)自體或異體移植，一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明異體移植后BMSCs存活率逐漸下降且活性較低［227］，使得同種異體BMSCs在臨床中的研究與應(yīng)用較少。目前對(duì)BMSCs 的基礎(chǔ)研究在尋找其表面特定標(biāo)志物，在分離及誘導(dǎo)分化的基礎(chǔ)上向移植后對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)和微環(huán)境的構(gòu)建進(jìn)行探索研究。雖然經(jīng)3D生物打印的支架材料在組織相容性和機(jī)械力學(xué)方面取得了重要進(jìn)展，但生物支架在治療骨缺損中缺乏長(zhǎng)期病例的隨訪和回顧性研究，而且目前載有BMSCs 的生物活性支架在受體中如何建立有效的血液循環(huán)仍需進(jìn)一步研究［228］。

3D 生物打印技術(shù)經(jīng)過(guò)近幾十年的發(fā)展，在打印技術(shù)和精度方面有了顯著的提高，但仍存在一些技術(shù)性難題。比如如何將傳統(tǒng)的靜態(tài)打印方式向動(dòng)態(tài)打印方式轉(zhuǎn)換，如何在打印過(guò)程中使種子細(xì)胞免受高溫、壓力等外在因素的干擾依然保持生物活性，怎樣維持各種打印材料之間印刷參數(shù)的兼容性與表征等［229-230］。目前，BMSCs 復(fù)合3D 生物打印技術(shù)治療骨缺損是一種擁有廣闊前景的治療方法，隨著骨組織工程的發(fā)展和生物活性材料的研發(fā)進(jìn)步，通過(guò)3D生物打印技術(shù)為骨缺損患者提供精準(zhǔn)化、個(gè)性化的治療方案提供可行性，相信未來(lái)其在臨床治療中可以發(fā)揮更重要的作用。