唐黎威 竺王玉 樂涵波

肺癌患者生存率低的主要因素包括缺乏早期有效診斷及預后不良，因為早期肺癌的臨床癥狀并沒有特異性，許多患者在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于晚期，導致后續(xù)的治療也不甚理想。因此在病變早期及時得到診斷、治療，并對預后進行監(jiān)測，才能獲得較好的療效，這對提高肺癌患者的生存率尤為重要。目前，低劑量螺旋CT 是一種較為有效的早期篩查方式，組織活檢則可以作為確診的一項標準，但是這兩種方法仍存在一定的局限性，因此迫切需要開發(fā)新的檢測手段。液體活檢作為近年來出現(xiàn)的一項突破性技術，是一種非侵入式的血液檢測，主要包括循環(huán)腫瘤細胞、循環(huán)腫瘤DNA 以及外泌體的檢測[1-2]。目前，針對外泌體的研究越來越多，外泌體已經(jīng)逐漸成為在早期肺癌診斷和監(jiān)測預后等方面的研究熱點，因此探索肺癌外泌體將為肺癌的診斷和預后開拓新的視野。本文就外泌體中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及miRNA 作為肺癌診斷和預后標志物的研究進展作一綜述。

1 外泌體概述

1983 年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)，1987 年Johnstone 將其命名為“exosome”。外泌體是直徑約為30～100 nm 的雙膜杯狀囊泡，主要來源于細胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到細胞外基質(zhì)中。目前發(fā)現(xiàn)多種細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，如網(wǎng)織紅細胞、B 淋巴細胞、T 細胞、血小板、肥大細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞，也可由非造血來源的細胞產(chǎn)生，如上皮細胞（腸上皮細胞）、施萬氏細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元、間皮瘤細胞、脂肪細胞、成纖維細胞和腫瘤細胞等，并可釋放到生物體液中，如唾液、血漿、尿液、母乳、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液和腹水等[1，3-5]，因此，外泌體獲取來源可有多種選擇。既往研究表明，外泌體可以作為信號物質(zhì)在靶細胞中傳遞，并且攜帶有多種蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等，這些生物活性分子被一層脂質(zhì)雙層膜所包圍，因此這些生物源在循環(huán)中就可免受降解，成為穩(wěn)定的傳遞信號分子，形成了一種全新的細胞-細胞間信息傳遞系統(tǒng)，可參與細胞通訊、細胞遷移、血管新生和腫瘤細胞生長等過程。進一步研究表明，外泌體的分泌運輸主要通過兩種方式，其中一種形成、運輸機制需要內(nèi)涵體分選轉(zhuǎn)運復合體（ESCRT），ESCRT 由4 種蛋白質(zhì)組成，它在外泌體內(nèi)腔中包裝生物分子以及幫助外泌體從細胞中釋放出去等方面起著重要的作用；另一種分泌方式是ESCRT 非依賴性機制，這種外泌體分泌方式需要鞘脂（神經(jīng)酰胺）幫助[3，5-6]?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)證明腫瘤細胞分泌的大量外泌體所包含的特異性蛋白質(zhì)、核酸等可以反映親代細胞的特征，因此腫瘤來源的外泌體可以幫助探索外泌體在促進腫瘤細胞增殖、細胞外基質(zhì)重塑、遷移侵襲、血管生成中發(fā)揮的作用，進一步了解外泌體對腫瘤細胞的免疫抑制作用，以及分析外泌體在腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性中的作用機制[4-5，7-8]。肺癌來源的外泌體具有上述特點，因此鑒定肺癌來源的外泌體成分可以為肺癌的診斷和監(jiān)測預后提供重要的臨床參考。

2 外泌體對于肺癌的診斷作用

2.1 外泌體相關蛋白質(zhì)與肺癌的診斷 外泌體是內(nèi)吞起源的多囊泡體，并且可由正?；虿±頎顟B(tài)的細胞釋放，它的成分可以反映親代細胞的特征。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中所包含的蛋白質(zhì)、miRNA 以及脂質(zhì)等生物分子對于肺癌的診斷具有很大的價值[1-2]。其中，膜轉(zhuǎn)運和融合蛋白、熱休克蛋白（HSP）、鳥苷三磷酸酶、多囊泡體生物發(fā)生蛋白、細胞骨架蛋白、代謝酶、信號轉(zhuǎn)導蛋白和載體是外泌體中最常見的鑒定蛋白。另外，諸如四跨膜蛋白家族（CD63、CD81、CD9）、腫瘤易感基因101、調(diào)亡相關基因-2 受體蛋白和HSP 普遍存在于外泌體中，這些蛋白質(zhì)通常可以作為識別外泌體的標志物[3，5，9-10]。已有研究表明，CD151、CD171 和四跨膜蛋白8（TSPAN8）這3種外泌體蛋白可以用來鑒別診斷肺癌患者，且進一步研究發(fā)現(xiàn)它們可以區(qū)別肺癌的組織學類型，高水平的外泌體CD151 與腫瘤的侵襲性相關，且CD151 和TSPAN8與肺癌轉(zhuǎn)移密切相關，外泌體CD171 則與肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變、轉(zhuǎn)移和預后不良有關[10-14]。另有研究表明，在唾液中檢測到的外泌體蛋白具有腫瘤特異性，同時發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌（NSCLC）患者能夠在尿液中檢測到外泌體；對此，通過免疫組化染色檢測到原發(fā)性腫瘤中富含亮氨酸α-2 糖蛋白1（Lrg1）的高表達與尿液標本中Lrg1 的存在呈一定程度上的正相關，這提示了尿液中外泌體的Lrg1 可能來源于原發(fā)性腫瘤組織，因此檢測尿液中外泌體的Lrg1 也可以作為診斷NSCLC 患者的潛在標志物[3，9，13-17]。此外還有研究發(fā)現(xiàn)絲甘蛋白聚糖、原肌球蛋白3、血小板反應蛋白以及含有HECT 結構域的E3 泛素連接酶在作為區(qū)分肺腺癌的生物標志物時具有較強的特異性。綜上研究表明，外泌體相關蛋白質(zhì)在肺癌的診斷方面具有巨大潛力。

2.2 外泌體脂質(zhì)與肺癌的診斷 在外泌體中檢測到的脂質(zhì)具有外泌體細胞起源的特征。外泌體富含有作為信號分子的脂質(zhì)，包括TC、TG、鞘磷脂、磷脂、甘油磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、聚甘油磷脂、前列腺素和白三烯以及相關的脂類代謝活性酶等。且進一步研究發(fā)現(xiàn)，與親代細胞相比，某些外泌體脂質(zhì)（鞘磷脂、甘油磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇）的比例顯著升高，而且發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺對于外泌體的發(fā)生和觸發(fā)癌細胞死亡起到非常重要的作用，這可能提示了脂質(zhì)在外泌體的生物發(fā)生和在腫瘤微環(huán)境中的作用扮演了重要角色，影響了腫瘤的發(fā)展[5，9，19]。在一項研究中，研究人員使用了超高分辨率傅里葉變換質(zhì)譜法探討了NSCLC 患者血漿外泌體的脂質(zhì)譜，采集了39例健康體檢者和91 例NSCLC 患者（早期44 例，晚期47例）的血漿外泌體脂質(zhì)譜，使用兩種統(tǒng)計學方法LASSO和RF 進行分析，結果顯示使用所選特征脂質(zhì)的早期和晚期NSCLC 患者與健康體檢者相比，AUC 分別為0.79和0.77（LASSO）、0.85 和0.88（RF），成功地將健康體檢者、早期和晚期NSCLC 患者區(qū)分開來[19]。

2.3 外泌體相關miRNA 與肺癌的診斷 外泌體RNA因其高度的腫瘤特異性而具有很高的臨床診斷價值。miRNA 是短的（18～25 nt）、單鏈非編碼RNA，目前已證明外泌體miRNA 的表達與多種癌癥相關。研究表明肺癌患者的外泌體RNA 水平明顯高于健康者，且RNA水平與肺癌的進展程度、治療反應、生存率都密切相關。通過基因芯片、高通量測序法和qRT-PCR 等方法發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中的外泌體miRNA 對NSCLC 的診斷有較大幫助。已有大量研究證明有12 個特異性外泌體miRNA（miR-17-3p、miR-21、miR-106a、miR-146、miR-155、miR-191、miR-192、miR-203、miR-205、miR-210、miR-212和miR-214）是有助于篩選肺癌的生物標志物[4-5，8，15，20]。在一項實驗中發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，NSCLC 患者分離的外泌體中發(fā)現(xiàn)有8 種miRNA（miR-30b、miR-30c、miR-103、miR-122、miR-195、miR-203、miR-221 和miR-222）的表達存在差異[8]。最近有報道稱外泌體miRNA 能夠顯著區(qū)分肺癌患者組與健康對照組，并且發(fā)現(xiàn)在肺鱗狀細胞癌中，外泌體內(nèi)的5 種miRNA（miR-205、miR-19a、miR-19b、miR-30b 和miR-20a）水平可被用作診斷標志物[6，8，14]。在另外一些研究中發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體中鑒定出的4 種miRNA（miR-378a、miR-379、miR-139-5p 和miR-200b-5p）在篩選和區(qū)分肺病變（肺腺癌和肉芽腫）患者和健康對照者中有一定意義[4]。此外，還有研究選擇了6 種外泌體miRNA（miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR-200b-5p、miR-629、miR-100 和miR-154-3p）來作為診斷標志物以區(qū)分肺腺癌和肉芽腫，發(fā)現(xiàn)它們具有診斷意義[4，6，21，22]。一項前瞻性研究則探討了支氣管肺泡灌洗液外泌體miRNA 對于肺腺癌的早期診斷價值，評估了已知對肺腺癌有診斷價值的miRNAs（miR-7、miR-21、miR-126、let-7a、miR-17 和miR-19），其中發(fā)現(xiàn)miR-126 和let-7a 水平有明顯升高，進一步證明了對于早期肺腺癌的診斷價值[23]。另有研究則探討了有利于肺癌診斷而不是非腫瘤性病因（如結核?。┑膍iRNA（miR-205-5p、miR-483-5p、miR-375、miR-200C-3p、miR-429、miR-200b-3p、miR-200a-3p、miR-203a-3p 和miR-141-3p），發(fā)現(xiàn)具有診斷意義[17，22]。綜上所述，分析外泌體miRNA 可為探索早期肺癌診斷的分子標志物提供理論依據(jù)。

3 外泌體對肺癌的預后作用

3.1 外泌體蛋白質(zhì)對肺癌的預后 目前，肺癌的治療以手術、化學治療、放射治療、分子靶向治療的綜合治療為主，但由于肺癌的晚期診斷和肺癌治療中的獲得性耐藥，導致患者預后往往較差，因此監(jiān)測肺癌患者預后尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，基于外泌體及其相關成分的研究對于監(jiān)測預后有重大意義。外泌體中有幾種與肺癌發(fā)展相關的蛋白，如表皮生長因子受體（EGFR）、鼠類肉瘤病毒癌基因（Kras）、細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導劑、緊密連接蛋白和Rab 家族蛋白等，這些蛋白的表達與肺癌患者的不良預后密切相關，因此檢測外泌體中的此類蛋白表達可以幫助監(jiān)測預后。其他研究也表明膜蛋白CD91、CD317 和EGFR 是NSCLC 潛在的外泌體標志物，并且發(fā)現(xiàn)在NSCLC 患者中紐約食管鱗癌蛋白1、EGFR 和人胎盤堿性磷酸酶水平增加，CD171 表達與患者不良預后相關，T 細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3 和半乳糖凝集素9這兩種蛋白質(zhì)則與腫瘤大小和分期相關，并有助于區(qū)分轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性NSCLC 的脂多糖結合蛋白[6，14，17，24-26]。另外，在一項相關研究中對NSCLC 外泌體蛋白組學進行分析后發(fā)現(xiàn)，EGFR、信號轉(zhuǎn)導相關蛋白等含量均明顯增加，還發(fā)現(xiàn)在NSCLC 外泌體中肝細胞生長因子受體、Ras 相關的C3 肉毒素底物1 和Kras 蛋白水平均明顯增加[6，9，14-15]。還有研究結果表明，HSP 90、細胞周期蛋白D1（CCND1）、血管內(nèi)皮生長因子、Notch1 蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶2 在復發(fā)性腫瘤患者中的表達水平明顯高于原發(fā)性腫瘤患者，其中CCND1 是NSCLC 中研究最多的細胞周期蛋白之一，但由于其在肺癌患者預后中的作用在一些文獻報道中存在爭議，仍需要更進一步研究進行證明[20]。還有一項研究則探討了Rab 蛋白家族中的RabA 和RabB，發(fā)現(xiàn)其表達水平與肺癌轉(zhuǎn)移預后相關，特別是RabB 的高表達是肺鱗癌不良預后的因素之一，而RabA 則需要更進一步的驗證[27]。總之，上述外泌體蛋白質(zhì)的探索對于肺癌預后研究進展具有非常重要的意義。

3.2 外泌體相關miRNA 對肺癌的預后 外泌體中的miRNA 是被用作監(jiān)測肺癌預后的一種重要生物標志。相關miRNA（let-7、miR-221、miR-137、miR-372 和miR-182）的表達與肺癌患者的生存率有一定關系。研究證明，包括miR-486、miR-30d、miR-1、miR-499 在內(nèi)的miRNA的表達水平與疾病預后顯著相關，而在肺腺癌患者中，相關miRNA 在腫瘤組織中高度表達，表明了let-73、miR-25、miR-191、miR-34a、miR-34c 與患者預后相關。同樣有研究發(fā)現(xiàn)，miR-129-3、miR-96、miR-21、miR-95、miR-155 和miR-337-5p 在腫瘤復發(fā)患者中表達上調(diào)，特別是miR-21 和miR-155 表達呈顯著上調(diào)[20，24]。另一方面從NSCLC 復發(fā)患者分離出的外泌體中miR-21 和miR-4257 水平與無復發(fā)患者具有高度可比性，它們在疾病復發(fā)患者中的水平顯著上調(diào)，且這兩種外泌體miRNA 也與腫瘤的大小、組織類型和轉(zhuǎn)移有關，表明這兩種外泌體miRNA 是可以作為NSCLC 患者復發(fā)的生物標志物；相對的，與腫瘤抑制相關的兩種miRNAs，即miR-51 和miR-373 的外泌體表達在肺癌患者中降低，與患者不良預后相關[6，14，16，28-30]。EGFR 突變是NSCLC患者預后不良的最常見的一種因素，基于此有研究發(fā)現(xiàn)外泌體miRNA（miR-25、miR-122、miR-195、miR-21和miR-125b）與EGFR 突變的NSCLC 患者對吉非替尼的敏感性有關，表明外泌體有可能對于患者的靶向治療選擇有一定幫助，而外泌體miR-221 和miR-222 與EGFR 突變患者對奧西替尼的良好治療反應有關[8，17，26]。還有報道稱miR-23b-3p、miR-10b-5p 和miR-21-5p水平在NSCLC 患者中被證實是上調(diào)的，同樣證明其是有前景的預后生物標志物，有待于更深入的研究[6，14，22，26]。另外在幾項臨床試驗中，研究者測定比較了肺癌患者和健康對照組間miRNA 表達的相對變化，發(fā)現(xiàn)在外泌體中相關miRNA（miR-30b、miR-30c、miR-103、miR-122、miR-195、miR-203、miR-221 和miR-222）呈高水平狀態(tài)，表明這些miRNA 作為肺癌的標志物具有監(jiān)測預后價值[9]。綜上所述，分析外泌體中的相關蛋白以及miRNA對于肺癌患者的預后評估具有很大幫助。

4 小結

肺癌的早期診斷和預后監(jiān)測是提高患者生存率的關鍵，得益于液體活檢這一項技術的發(fā)展和成熟，外泌體作為液體活檢的對象之一，在各方面都具有很大的潛力。液體活檢與以往作為金標準的組織活檢不同，組織活檢是一種侵入性的檢查，具有一定的局限性（如腫瘤的異質(zhì)性和進化、腫瘤組織無法獲取或不足以進行完整的基因分析以及對于患者的侵入性風險等），液體活檢相對于傳統(tǒng)的手術活檢和穿刺活檢相比，優(yōu)勢在于它是一項非侵入性的技術，對患者的不良反應更小，可以重復獲取樣本，且成本更為低廉。然而，目前對于外泌體的研究仍存在以下幾個問題：（1）外泌體作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，其在NSCLC 的進展過程中的具體作用機制尚不清楚，外泌體可以在肺癌細胞及其微環(huán)境之間轉(zhuǎn)移具有生物活性的分子，但是其能準確將這些生物分子遞送到特定靶細胞的機制仍需要闡明；（2）外泌體在NSCLC 診治中的靈敏度和特異度有待提高；（3）由于目前技術的限制和較高的研究成本，獲得大量的、高純度的外泌體及外泌體全面表征仍具有挑戰(zhàn)性，這也將影響臨床應用、生物醫(yī)學研究和生產(chǎn)成本，因此需要結合多種分離技術來優(yōu)化外泌體的分離及富集；（4）外泌體的定量、純化和保存尚未標準化，這對實驗過程和結果產(chǎn)生一定影響；（5）外泌體是一種很有前景的肺癌診斷、監(jiān)測預后以及實時監(jiān)測治療效果的生物標志物，但目前的研究樣本量通常較少，重復性較差，因此需要大型的多中心研究提高液體活檢的有效性；（6）外泌體用于靶向治療的不良反應目前還尚未明確。基于上述問題，仍需要對外泌體作為肺癌診斷標志物進行大量驗證和分析。隨著對外泌體生物學結構和功能及其在肺癌發(fā)生、發(fā)展中機制的進一步研究和更深入的理解，相信外泌體作為液體活檢的對象之一及蛋白質(zhì)、DNA 及RNA 等穩(wěn)定遺傳物質(zhì)的可靠來源，可以為肺癌的早期診斷和預后監(jiān)測提供新的策略。