蔣麗元 史瑩?dān)L 葉恬恬 楊俊文

梅尼埃?。∕eniere's disease，MD）是一種臨床常見(jiàn)的內(nèi)耳疾病。MD 好發(fā)于40～50 歲中年人，以發(fā)作性眩暈、波動(dòng)性感音神經(jīng)性聽(tīng)力下降、耳鳴、耳悶脹感伴惡心、嘔吐為典型的臨床表現(xiàn)[1]。電針治療MD 能疏通耳部氣血，改善前庭及內(nèi)耳功能，緩解眩暈、耳鳴癥狀[2]。筆者在前期工作中證實(shí)電針百會(huì)、聽(tīng)宮穴能顯著減輕耳源性眩暈豚鼠膜迷路積水，改善耳蝸聽(tīng)功能[3]，與電針治療MD 的臨床效果一致。MD 的病理基礎(chǔ)是膜迷路積水[4]。位于耳蝸蝸管外側(cè)壁的血管紋細(xì)胞是產(chǎn)生內(nèi)淋巴液、維持耳蝸內(nèi)淋巴液離子成分平衡及特殊電化學(xué)特征的關(guān)鍵部位[5]。有研究者通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)皮下注射血管加壓素（arginine vasopressin，AVP）處理后的大鼠耳蝸血管紋細(xì)胞內(nèi)空泡形成，血管紋間隙增大，因此推測(cè)AVP 與表達(dá)于血管紋細(xì)胞頂側(cè)膜的血管加壓素受體2（vasopressin type 2 receptor，V2R）結(jié)合，引起鄰近外淋巴腔隙一側(cè)的血管紋細(xì)胞底側(cè)膜表面水通道蛋白2（aquaporin2，AQP2）表達(dá)水平增加或構(gòu)型改變，水通道開(kāi)放，外淋巴液通過(guò)血管紋流向內(nèi)淋巴間隙，引起血管紋細(xì)胞水腫、血管紋間隙增大，內(nèi)淋巴液增多，最終發(fā)生膜迷路積水[6]。本研究旨在觀察電針對(duì)膜迷路積水模型豚鼠耳蝸積水程度及血管紋細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，探討電針對(duì)梅尼埃病膜迷路積水的干預(yù)作用及可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用清潔級(jí)雄性白毛紅目豚鼠39 只，體重350～400 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供[使用SYXK（浙）2013-0184]。實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的所有處置均符合2006 年國(guó)家科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的相關(guān)規(guī)定。將39 只豚鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為電針組、模型組、空白組，每組13 只。3 組分別取8 只豚鼠行HE 染色法光鏡觀察耳蝸積水程度，另5 只行透射電子顯微鏡觀察耳蝸血管紋細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.2 主要試劑與儀器 醋酸去氨加壓素（海南中和制藥股份有限公司，批號(hào)：20170701，規(guī)格1 ml∶4 μg）；透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司，H-7650 型）。

1.3 豚鼠膜迷路積水模型的建立與評(píng)價(jià) 電針組與模型組采用腹腔注射醋酸去氨加壓素建立膜迷路積水模型[7]：先按4 μg/（kg·d）給予腹腔注射，連續(xù)7 d，第8 天將劑量加大為6 μg/（kg·d），連續(xù)3 d，共10 d，第11 天起開(kāi)始干預(yù)。模型評(píng)價(jià)以耳蝸病理觀察為準(zhǔn)[8]。

1.4 干預(yù)方法 電針組豚鼠固定后，于百會(huì)穴向前平刺2 mm，一側(cè)聽(tīng)宮穴直刺3 mm，針刺后接HANS-100A型鎮(zhèn)痛電針儀連接兩穴毫針；調(diào)節(jié)刺激參數(shù)為：輸出電流1 mA，波形為100 Hz 連續(xù)波，電針持續(xù)刺激20 min，1 次/ d，連續(xù)干預(yù)10 d；對(duì)側(cè)聽(tīng)宮穴不做任何處理。模型組豚鼠僅予相同方法固定。豚鼠百會(huì)、聽(tīng)宮穴定位均采用動(dòng)物比較解剖取穴方法，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]中的描述，于動(dòng)物顱頂骨正中處選取百會(huì)穴，于側(cè)面部耳屏正前方凹陷處選取聽(tīng)宮穴。空白組豚鼠不作干預(yù)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般行為學(xué)觀察 觀察各組豚鼠一般行為學(xué)變化，包括豚鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)、步態(tài)、進(jìn)食、體重變化、自發(fā)活動(dòng)情況、耳郭反應(yīng)等一般情況。

1.5.2 耳蝸積水程度檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第21 天，3 組豚鼠腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg），麻醉后快速打開(kāi)胸腔，充分暴露心臟，4%多聚甲醛（pH=7.2）灌注至豚鼠身體僵硬發(fā)白，斷頭后剝離附著的肌肉軟組織，取出并打開(kāi)觀察側(cè)聽(tīng)泡，暴露耳蝸組織后，置于4%多聚甲醛中固定，過(guò)夜后再置于10%乙二胺四乙酸（pH=7.4）中，室溫下脫鈣約3 周，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。沿耳蝸蝸軸中央平面切片，厚約4.5 μm，HE 染色，光鏡下觀察耳蝸積水程度。運(yùn)用Imagepro-plus 系統(tǒng)測(cè)量耳蝸中軸兩側(cè)第二轉(zhuǎn)蝸管橫截面積及前庭階橫截面積，計(jì)算蝸管橫截面積/（蝸管橫截面積+前庭階橫截面積）比值（R 值），兩側(cè)取平均值。

1.5.3 耳蝸血管紋細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 3 組豚鼠麻醉后快速斷頭，取出觀察側(cè)聽(tīng)泡，迅速放入預(yù)冷（4 ℃）的2.5%戊二醛固定液（pH=7.4）中，打開(kāi)聽(tīng)泡，暴露耳蝸組織，用1 ml 注射器吸取固定液自前庭窗孔灌入，耳蝸灌流數(shù)次后，置于固定液中（容積約為組織體積的10 倍左右），放入4 ℃冰箱中固定2 d。為排除各組取材與固定時(shí)間差異對(duì)組織超微結(jié)構(gòu)的影響，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中取材迅速，并確保動(dòng)物麻醉至耳蝸灌流結(jié)束所用時(shí)間基本一致。固定結(jié)束后，繼續(xù)放入4 °C 冰箱內(nèi)脫鈣約4 周，經(jīng)后固定、梯度脫水、浸透包埋、聚合后，超薄切片機(jī)半薄切片，厚約1～2 μm，甲苯胺藍(lán)染色后于顯微鏡下定位。鉆石刀超薄切片，厚約70～80 nm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色液染色，用H-7650 透射電鏡觀察耳蝸血管紋細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并拍攝照片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組豚鼠一般行為學(xué)觀察 適應(yīng)性喂養(yǎng)期間，3 組豚鼠均精神狀態(tài)良好，耳郭反應(yīng)靈敏。經(jīng)造模后，電針組和模型組豚鼠普遍出現(xiàn)精神萎靡，輕微脫毛，步態(tài)遲緩，進(jìn)食減少，體重增長(zhǎng)緩慢甚至出現(xiàn)下降，活動(dòng)減少，耳郭反應(yīng)遲鈍。經(jīng)電針干預(yù)后，電針組豚鼠精神狀況及耳郭反應(yīng)靈敏度與模型組比較均有所改善，但電針組豚鼠皮毛光亮程度、飲食、體重、自發(fā)活動(dòng)情況與模型組比較無(wú)差別。

2.2 3 組豚鼠耳蝸積水程度比較 電針組R 值為0.32±0.05，模型組為0.48±0.06，空白組為0.28±0.03，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），模型組高于電針組和空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）?？瞻捉M豚鼠均未出現(xiàn)膜迷路積水，前庭階、鼓階、蝸管結(jié)構(gòu)無(wú)異常；模型組出現(xiàn)膜迷路積水，表現(xiàn)為前庭膜向前庭階方向不同程度的隆起擴(kuò)張；電針組前庭膜隆起程度較模型組減輕，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。

2.3 3 組豚鼠耳蝸血管紋細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 電針組血管紋細(xì)胞胞核清晰可見(jiàn)，胞質(zhì)與細(xì)胞器電子密度不均程度較模型組減輕，細(xì)胞水腫程度較模型組減輕，線(xiàn)粒體空泡化變性及腫脹程度明顯改善，見(jiàn)圖2a（插頁(yè)）。模型組血管紋細(xì)胞胞核可見(jiàn)，胞漿與細(xì)胞器電子密度不均，較空白組增高，細(xì)胞器受損，結(jié)構(gòu)顯示不清，大部分線(xiàn)粒體腫脹，出現(xiàn)空泡化變性，細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體嵴出現(xiàn)斷裂甚至消失，見(jiàn)圖2b（插頁(yè)）?？瞻捉M血管紋細(xì)胞核可見(jiàn)，胞漿與細(xì)胞器電子密度均勻，線(xiàn)粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)；細(xì)胞間血管內(nèi)皮細(xì)胞及線(xiàn)粒體、基膜結(jié)構(gòu)顯示正常，見(jiàn)圖2c（插頁(yè)）。

3 討論

中醫(yī)學(xué)中無(wú)MD 具體病名的記載，現(xiàn)多將由MD 引起的眩暈歸入“耳源性眩暈”范疇?，F(xiàn)代醫(yī)家總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為中醫(yī)對(duì)耳源性眩暈病機(jī)的認(rèn)識(shí)無(wú)外乎虛實(shí)兩端，其基本病理性質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)。因此臨床對(duì)該病的治療多以補(bǔ)益為主。《靈樞·海論》記載：“髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴”，故臨床治療眩暈首選與腦髓有關(guān)的穴位。百會(huì)歸屬督脈，具有補(bǔ)益腦髓、平肝熄風(fēng)、開(kāi)竅、止眩的功效，為治眩暈要穴；MD 病位在耳，聽(tīng)宮內(nèi)通心、腦及肝膽之氣，針刺聽(tīng)宮可疏利肝膽之氣，宣通耳竅，多用于內(nèi)耳疾病的治療。臨床上常以百會(huì)配伍聽(tīng)宮治療內(nèi)耳眩暈癥[10-12]。本研究結(jié)果顯示，電針刺百會(huì)、聽(tīng)宮穴能顯著減輕膜迷路積水模型豚鼠的耳蝸積水程度，與課題組前期研究結(jié)果相符[13-14]。

內(nèi)淋巴縱流學(xué)說(shuō)與輻流學(xué)說(shuō)是解釋膜迷路容量調(diào)節(jié)的兩種經(jīng)典理論[15-16]?？v流學(xué)說(shuō)認(rèn)為內(nèi)淋巴液主要在耳蝸內(nèi)血管紋組織分泌產(chǎn)生，最終在內(nèi)淋巴囊中被吸收代謝；輻流學(xué)說(shuō)則認(rèn)為內(nèi)淋巴液產(chǎn)生和吸收均是在耳蝸局部進(jìn)行，血管紋是產(chǎn)生和吸收內(nèi)淋巴液的重要部位之一。這兩種理論均充分肯定了耳蝸膜性蝸管外側(cè)壁的血管紋在內(nèi)淋巴液體容量調(diào)節(jié)過(guò)程中的關(guān)鍵作用。耳蝸膜性蝸管外側(cè)壁的血管紋為富含毛細(xì)血管網(wǎng)的復(fù)層上皮，主要由3 層上皮細(xì)胞構(gòu)成，包括由內(nèi)側(cè)（靠近蝸管內(nèi)淋巴腔隙一端）向外側(cè)（靠近螺旋韌帶一端）依次分布的邊緣細(xì)胞，中間細(xì)胞以及基底細(xì)胞。各細(xì)胞以緊密連接的方式相互聯(lián)系，使血管紋處于相對(duì)獨(dú)立的狀態(tài)。耳蝸血管紋是AVP 依賴(lài)性調(diào)節(jié)的靶組織之一。有文獻(xiàn)報(bào)道，血管紋組織中，注射AVP 可通過(guò)AVP- AQP2 系統(tǒng)使血管紋細(xì)胞底側(cè)膜表面的AQP2 表達(dá)水平升高，水通道開(kāi)放程度增加，外淋巴液水流部分快速流向血管紋；透射電鏡下可觀察到血管紋細(xì)胞內(nèi)空泡形成，血管紋間隙增大；而在注射AVP 前1 h 預(yù)先使用V2R 競(jìng)爭(zhēng)性阻滯劑（OPC-31260），則能逆轉(zhuǎn)血管紋細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化[17]。Hideaki 等[18]亦發(fā)現(xiàn)，注射AVP 可使大鼠耳蝸血管紋細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞空泡化變性，細(xì)胞器消失。本實(shí)驗(yàn)中，透射電鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)AVP 注射處理的豚鼠血管紋細(xì)胞胞漿與細(xì)胞器電子密度不均，電子密度增高，細(xì)胞器受損，結(jié)構(gòu)顯示不清，大部分線(xiàn)粒體腫脹，出現(xiàn)空泡化變性，細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體嵴斷裂甚至消失，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[18]。電針可使細(xì)胞水腫程度減輕，線(xiàn)粒體空泡化變性及腫脹程度明顯改善。既往的研究證實(shí)，電針具有保護(hù)細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)，維持線(xiàn)粒體及細(xì)胞正常功能的作用[19]，與本研究結(jié)果相符合。電針客觀改善了膜迷路積水模型豚鼠耳蝸血管紋細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)病理狀態(tài)，耳蝸血管紋細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改善可能與膜迷路積水的減輕，前庭膜結(jié)構(gòu)的恢復(fù)有一定的關(guān)系。電針可能通過(guò)減輕血管紋細(xì)胞水腫及線(xiàn)粒體腫脹、空泡化變性程度，改善細(xì)胞缺氧狀態(tài)，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)離子功能，離子流動(dòng)使細(xì)胞漿膜滲透壓恢復(fù)正常，局部水通道蛋白表達(dá)得到調(diào)控，水轉(zhuǎn)運(yùn)功能恢復(fù)正常，從而使膜迷路積水程度減輕。電針對(duì)膜迷路積水的減輕與對(duì)細(xì)胞形態(tài)、功能的改善形成良性循環(huán)，兩者相互促進(jìn)，使內(nèi)耳內(nèi)環(huán)境達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

綜上所述，電針百會(huì)、聽(tīng)宮穴治療能減輕豚鼠膜迷路積水程度，改善血管紋細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的病理狀態(tài)，對(duì)血管紋細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改善可能是穴位電針干預(yù)膜迷路積水的作用機(jī)制之一。