李 琪，冉 軻，孔令鋒

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266237)

貝類屬于軟體動物門(Mollusca)，是無脊椎動物中最重要的門類之一，其物種數(shù)量僅次于節(jié)肢動物門(Arthropoda)，是動物界中第二大門，物種數(shù)量在13萬種以上[1]。貝類的絕大部分物種為海洋貝類，其種類和數(shù)量極為豐富，不僅具有重要的經(jīng)濟價值，而且具有生態(tài)和工藝價值。海洋貝類的分類鑒定是海洋生物多樣性研究的重要組成部分，也是漁業(yè)資源調(diào)查和自然資源評估的參考依據(jù)。目前，海洋貝類的物種鑒定主要依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學特征。然而，貝類種類眾多，形態(tài)特征多樣，絕大多數(shù)種類在不同生長階段具有不同的形態(tài)特征。此外，趨同進化(Convergent evolution)和表型可塑性(Phenotypic plasticity)也會導致貝類形態(tài)特征的改變，從而導致一些不同種個體之間的形態(tài)特征相似、而同種個體之間的形態(tài)特征具有差異，這對傳統(tǒng)的形態(tài)學分類方法提出了很大的挑戰(zhàn)[2]。對海洋貝類進行準確地鑒定和分類是極為重要的，這不僅是理解和認識海洋貝類多樣性的需要，也是海洋環(huán)境保護、海水養(yǎng)殖、貝類漁業(yè)資源合理利用和食品安全等行業(yè)的迫切需求。

近年來，隨著全球氣候變化、環(huán)境問題和能源問題的加劇，人類可持續(xù)發(fā)展對理解和認識生物多樣性的要求日益迫切，物種的準確和快速鑒定作為對生物多樣性保護和持續(xù)利用的基礎，成為全球性的重大需求。DNA條形碼通過一個標準化、較短的基因序列變異來鑒定物種，是近年來生命科學和生物技術領域進展最迅速的學科前沿之一。DNA條形碼不僅是傳統(tǒng)物種鑒定的強有力補充，而且使標本鑒定過程實現(xiàn)自動化和標準化，突破了對經(jīng)驗的過度依賴，能夠在較短時間內(nèi)建立形成易于利用的應用系統(tǒng)。

本文主要綜述了DNA條形碼的產(chǎn)生、原理、分析步驟、優(yōu)勢、局限性及其在海洋貝類種質(zhì)資源保護中的應用進展，并闡述了DNA條形碼技術未來的發(fā)展。

1 DNA條形碼的產(chǎn)生、原理、分析步驟、優(yōu)勢和局限性

1.1 DNA條形碼的產(chǎn)生

對物種進行準確鑒定和分類是種質(zhì)資源保護的基礎，也是生物學研究的基本條件。人類對生物的研究具有悠久的歷史。而分類學作為一門古老的學科，從林奈、拉馬克時代就已經(jīng)開始了，這些分類學家的工作為后來生物系統(tǒng)發(fā)育的深入研究奠定了基礎。近年來，隨著科學技術的不斷提高，越來越多的新紀錄種和新種被發(fā)現(xiàn)和報道。盡管在地球上生存的生物種類多、數(shù)量大、分布廣，但是由于氣候變化、環(huán)境污染和過度采集等原因，導致一些生物物種的數(shù)量急劇下降，甚至一些種類可能還沒被人類發(fā)掘就已經(jīng)滅絕。如果僅僅依賴分類學家采用傳統(tǒng)的形態(tài)學方法來大量鑒定物種，其工作難度較大。此外，對物種準確的鑒定和分類是進行種質(zhì)資源保護、生物學研究、充分的利用生物資源和維持全球生態(tài)系統(tǒng)平衡的基礎，尤其是對于具有重要生態(tài)價值和經(jīng)濟價值的種類[3]。因此，對大量生物進行準確快速的鑒定和分類是至關重要的。2003年，受到“商品條形碼”的啟示，Hebert等[4]第一次提出“DNA條形碼”的概念，即通過選擇一段DNA基因序列片段作為條形碼進行物種的鑒定。自此以后，DNA條形碼迎來了黃金時代。Hebert等[5]探討和分析了采用線粒體細胞色素 c 氧化酶 I(Cytochrome c oxidase subunit I, COI)基因序列作為條形碼來進行物種鑒定的可行性。隨后，Hebert等[6]將DNA條形碼技術用于北美260種鳥類的鑒定中，并取得了成功。這些工作為后來采用DNA條形碼技術在生物物種鑒定和分類中的應用奠定了基礎，對物種種質(zhì)資源保護起到了關鍵作用。

1.2 DNA條形碼的原理

DNA條形碼其實是一段短的基因序列，其目的是用這一序列作為快速鑒定物種的標記，同時希望與生物物種建立一一對應的關系。DNA條形碼由四種堿基(A、T、G、C)組成，通過每個堿基的變異和組合，一段序列可以有很多種情況，以此來區(qū)分和鑒定不同的生物。在理論上，一段長度為幾百個堿基的DNA序列，其四種堿基可能的組合多達數(shù)十億個，這完全可以涵蓋全球所有生物的物種數(shù)量，理論上可以通過DNA條形碼區(qū)分所有生物[7]。然而，并非所有的基因序列都可以用來作為DNA條形碼，該基因序列必須要具備兩個最基本的特征：(1)為了將每個物種準確地區(qū)分和鑒定，所選的基因片段具有足夠的變異度。(2)基因序列要有一定的保守性，以便引物的選擇和基因片段的擴增[8]。核基因和線粒體基因都可被用作DNA條形碼，但是線粒體基因用的較廣，其主要原因是該基因具有以下幾個特點：其一，在細胞中，線粒體的數(shù)量較多，達數(shù)百個，從而選擇線粒體DNA比較方便；其二，線粒體基因無內(nèi)含子(Intron)，并且絕大多數(shù)動物為母系遺傳，重組現(xiàn)象較少，更適合作為通用條形碼；其三，線粒體DNA具有很快的突變速率，而核DNA的突變速率較慢，線粒體DNA的突變速率大約是核DNA的10倍，這有利于線粒體DNA條形碼能更加高效精確地區(qū)分物種[9]。研究表明，在動物的物種鑒定中，有超過95%的動物種類可以用COI基因進行種水平上的鑒定[10]。

1.3 DNA條形碼的分析步驟

DNA條形碼技術的操作步驟如下：(1)樣品采集。根據(jù)研究所需的物種，對物種進行采集，同時記錄樣品采集的時間、地點和底質(zhì)環(huán)境等。(2)樣品保存。采集完成后，對樣品進行保存，一般通過95%酒精或冷凍保存。(3)樣品DNA提取。(4)PCR擴增及測序。(5)數(shù)據(jù)分析。首先使用序列分析軟件(如SeqMan)對序列進行校正，保證每條序列準確無誤，然后使用序列比對軟件(如BioEdit v.7.2.6.軟件中內(nèi)置的 Clustal W)對序列進行比對，最后計算遺傳距離和構建系統(tǒng)進化樹，并分析結(jié)果。(6)樣品信息的上傳。將所研究樣品的分類地位、照片、采集地點、時間、環(huán)境以及序列等上傳到相關的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，做到數(shù)據(jù)共享。

1.4 DNA條形碼的優(yōu)勢和局限性

1.4.1 DNA條形碼的優(yōu)勢 與傳統(tǒng)的形態(tài)分類方法相比，DNA條形碼技術具有很多優(yōu)勢：(1)鑒定個體不完整的生物。DNA條形碼技術可以利用物種的組織片段進行物種的鑒定，例如，可以鑒定一些海產(chǎn)品或通過動物胃里的食物殘渣來分析食物來源等[11]。(2)鑒定形態(tài)特征相似的生物。盡管一些個體屬于不同的種，但是它們具有極其相似的外部形態(tài)特征，例如自然界中的一些擬態(tài)現(xiàn)象，使用形態(tài)學方法很難鑒定。(3)鑒定處于不同生長階段的物種。受性別和不同發(fā)育階段的影響，許多物種在不同的生長階段具有完全不同的外部形態(tài)特征，如果在不了解其生活史的情況下，僅僅使用形態(tài)特征很難對其進行鑒定和分類。(4)鑒定形態(tài)可塑性強的物種。一些物種的外部形態(tài)具有很強的可塑性，為了適應所處的生長環(huán)境，同種個體在不同的環(huán)境中呈現(xiàn)出完全不同的形態(tài)特征，傳統(tǒng)方法很難對其進行鑒定。(5)鑒定物種更加快速而高效。據(jù)統(tǒng)計，地球上總共被鑒定的種類大約有200多萬種[12]，這只占全球生物的一小部分，如果使用傳統(tǒng)方法來鑒定和分類，一些種類可能還沒有被人類發(fā)現(xiàn)就已經(jīng)滅絕。(6)對系統(tǒng)發(fā)育方面的貢獻。通過輔助傳統(tǒng)分類方法，豐富和完善系統(tǒng)發(fā)育樹等[13]。DNA條形碼數(shù)據(jù)庫豐富了生物種類的遺傳信息，這有助于研究和分析生物種類間的系統(tǒng)發(fā)生關系。(7)有利于發(fā)現(xiàn)隱存種和新種。(8)數(shù)據(jù)共享性。DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的構建，不僅共享了每個國家和地區(qū)生物的信息，而且對保護全球生物多樣性的工作做出了很大貢獻，有利于物種種質(zhì)資源的保護與利用。

1.4.2 DNA條形碼的局限性 DNA條形碼在提出后得到了學者的高度關注和廣泛應用，尤其是在物種區(qū)分和鑒定、隱存種和新種的發(fā)現(xiàn)等方面發(fā)揮了非常重要的作用。然而，在其推廣的過程中也引起了很大爭議。爭議點可以概括為以下幾個方面：(1)基于單基因的DNA條形碼能否鑒定每一種生物。由于假基因和異質(zhì)性等現(xiàn)象的存在，使用單基因的線粒體DNA序列進行種的分類很容易出現(xiàn)錯誤。另外，在動植物中由于基因漸滲雜交(Introgressive hybridization)和祖先多態(tài)性不完全分支(Incomplete lineage sorting of ancestral polymorphism)導致多系(Polyphyly)發(fā)生和旁系(Paraphyly)發(fā)生的現(xiàn)象很常見，僅僅使用線粒體DNA序列來區(qū)分物種和發(fā)現(xiàn)新種可能導致錯誤的鑒定結(jié)果[14]。(2)基于COI基因的DNA條形碼技術能否用于所有生物的鑒定。Hebert等[5]將基于COI基因的DNA條形碼用于腔腸動物的物種鑒定時發(fā)現(xiàn)，該類動物中大部分種類的種間差異小于2%，不能有效地區(qū)分該類群。Moritz等[15]曾質(zhì)疑使用COI基因能否區(qū)分和鑒定北美鳥的近緣種。此外，由于植物和動物COI基因的進化速率差異很大，通常植物的COI基因的進化速率慢。因此，一些學者認為基于COI基因的DNA條形碼技術不能鑒定大部分植物[16]。(3)DNA條形碼的方法是否可取。開展DNA條形碼技術的前提是需要獲得所研究物種標本的組織，這容易損壞樣品的完整性，尤其是一些稀有物種或難采集的標本，不利于形態(tài)學的研究。此外，Cameron等[17]認為進行DNA條形碼研究的成本較高，構建一個涵蓋全球所有生物的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的成本遠高于預期，對公眾來說無直接應用價值。盡管如此，DNA條形碼技術作為一種新興的分子技術仍然得到了高度的關注，已經(jīng)在很多生物類群中得到了應用，在分類學研究中潛力大，研究價值高。

2 DNA條形碼在海洋貝類種質(zhì)資源保護中的應用

海洋貝類種類豐富、數(shù)量龐大、分布廣，形態(tài)特征極為多樣。近年來，DNA條形碼技術已經(jīng)廣泛用于海洋貝類的物種鑒定、隱存種和新種的發(fā)現(xiàn)、系統(tǒng)發(fā)育及物種多樣性保護等研究，對海洋貝類種質(zhì)資源保護與利用起到至關重要的作用。Meyer等[18]選取寶貝科的 2 026 個個體作為研究對象，獲取了每個個體的COI序列，盡管結(jié)果顯示寶貝科的一些種的種內(nèi)和種間不存在條形碼間隙，種間和種內(nèi)遺傳距離存在重疊，但是基于COI基因的DNA 條形碼技術的鑒定效率還是高達96%，可以用于該類群物種的鑒定。寶貝科貝類形狀奇特，色彩瑰麗，具有收藏和研究價值，盡管已經(jīng)獲得了好多種類的COI序列，并可以將其鑒定，但是寶貝科各類群之間的系統(tǒng)發(fā)生關系有待進一步研究。Mikkelsen 等[19]通過分析 12 種雙殼貝類的 COI 基因序列，發(fā)現(xiàn)種間和種內(nèi)存在條形碼間隙，種間和種內(nèi)的序列具有顯著的差異度，結(jié)果表明使用COI基因可以用于對雙殼類物種的鑒定。陳軍等[20]為了驗證DNA條形碼物種鑒定的可行性，獲得了中國沿海11種綴錦蛤亞科貝類51個個體的COI基因序列，最終發(fā)現(xiàn)使用DNA 條形碼技術能夠?qū)⑺芯康募s 98%的綴錦蛤亞科貝類鑒定到種的水平。Liu等[21-23]首次驗證了 DNA 條形碼技術在貽貝科和牡蠣科種類鑒定中應用的可行性，同時，在對從中國沿海采集的 16 個及日本沿海采集的1 個櫛江珧 (Atrinapectinata)群體進行分析時使用COI基因、核 ITS基因以及形態(tài)特征標記，從而為研究海洋物種的分類、物種多樣性的保護和演化等問題提供參考。Zou等[24-26]使用基于多基因序列的DNA 條形碼技術對新腹足目貝類，尤其是一些經(jīng)濟種類，如織紋螺科和骨螺科貝類，進行了全面的物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究，并驗證了 DNA 條形碼及其分析方法的有效性，進一步表明大量的分析樣本及分析多基因序列對新腹足目的系統(tǒng)發(fā)育研究非常關鍵。Feng等[27-28]將 DNA 條形碼技術用于珍珠貝亞目和蚶目物種的鑒定中，然后用多個分子標記研究了這兩大類群的系統(tǒng)發(fā)生關系，驗證了 DNA 條形碼技術的可行性。盡管DNA條形碼技術不能完全取代傳統(tǒng)的形態(tài)學分類方法，但將兩者有效結(jié)合進行物種的鑒定是非常必要的。Sun等[29]分析了采自中國沿海的45種110個新進腹足目動物個體的COI基因序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)科內(nèi)、屬內(nèi)、種內(nèi)遺傳距離分別為22.27%、13.96% 和 0.44%，表明使用DNA條形碼能夠有效精確地鑒定該類動物，豐富了海洋貝類的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。Dai等[30]利用基于COI 基因的DNA條形碼對采自中國沿海的34種132個頭足類進行了物種鑒定，并研究和探討了基于 COI 和 16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育關系，驗證了DNA條形碼技術對頭足類物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育關系研究的可行性，證實該技術可以發(fā)掘傳統(tǒng)形態(tài)方法難以區(qū)分的隱存種的存在。Ni等[31]利用基于COI與16S rRNA基因的DNA條形碼有效的鑒定了蛤蜊科貝類，并對其系統(tǒng)進化關系進行了分析研究。Yu等[32-33]利用 DNA 條形碼技術和相關標記對異齒亞綱貝類進行了全面的物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究，最終驗證 DNA 條形碼技術及其分析方法在異齒亞綱貝類中的可行性。Lin等[34]對采自中國沿海真帽貝(花帽貝科和笠貝科)13個種135個個體進行基于COI基因的DNA條形碼研究，結(jié)果證明了使用DNA條形碼技術能夠快速準確地鑒定真帽貝物種，為真帽貝的系統(tǒng)演化研究奠定了基礎。Barco等[35]對采自北海的113種軟體動物進行了DNA條形碼分析，并獲得579條序列，極大的豐富了軟體動物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。Sun 等[36]首次系統(tǒng)而全面的分析了來自中國、日本和韓國的569種軟體動物，總共2 801條DNA條形碼序列，顯示了西北太平洋軟體動物的物種多樣性。Ran等[37]成功構建了海南島120種腹足綱貝類的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，為當?shù)馗棺憔V貝類的漁業(yè)管理、種質(zhì)資源保護提供了參考資料。截至目前，DNA條形碼技術在腹足綱、雙殼綱和頭足綱的物種鑒定方面得到了廣泛的應用，而在無板綱、單板綱和掘足綱中的研究較少，今后應加強這3個綱貝類的DNA條形碼研究，從而系統(tǒng)全面地構建海洋貝類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。

近年來，隨著高通量測序技術的不斷發(fā)展以及測序成本的持續(xù)降低，其測序通量保持指數(shù)增長，對樣品的測序開始從單個物種到多個物種發(fā)展[38-39]。在此背景下，通過將DNA條形碼鑒定技術與高通量測序技術結(jié)合，隨之出現(xiàn)了DNA宏條形碼(DNA metabarco-ding)，即可以一次性大批量檢測混合樣本中多個種類的條形碼序列。目前，該技術已經(jīng)應用于動物多樣性鑒定研究和物種種質(zhì)資源保護等方面，并且在評估環(huán)境中類群的生物多樣性以及復雜的群落結(jié)構方面具有很大潛力[40]。Sarkissian等[41]通過提取海洋軟體動物貝殼中的DNA，并采用高通量測序技術、線粒體DNA基因組、條形碼等方法，進一步證明了對軟體動物物種的分類和鑒定是正確的。周天成等[42]分析了基于18S rDNA條形碼技術的珊瑚礁區(qū)塔形馬蹄螺(Tectuspyramis)的食性組成，使用高通量測序技術，最終測得了41個OUT，分別屬于11個門類，準確鑒定了其消化道中的食物組成，這在清除珊瑚表面藻類基質(zhì)、促進珊瑚幼體附著過程中發(fā)揮一定的作用, 對于維護珊瑚生態(tài)系統(tǒng)的健康和穩(wěn)定具有積極意義。Bakker等[43]通過分析深海的環(huán)境DNA宏條形碼，評估了熱帶大陸架真核生物群落的生物多樣性，這有助于促進快速生物監(jiān)測手段的發(fā)展，并對目前海洋生物多樣性的現(xiàn)狀有了進一步的認識。施軍瓊等[44]利用高通量測序探討了大寧河不同水華期真核浮游生物的群落組成，發(fā)現(xiàn)水華末期雙殼綱和顎足綱的豐度明顯降低，通過高通量測序的方法，獲得了大寧河不同水華時期真核生物群落結(jié)構變化特點，克服了其從形態(tài)特征上進行準確分類的困難。Schroeder等[45]為了評估DNA宏條形碼對海洋浮游動物多樣性和生物監(jiān)測的適用性，在亞得里亞海北部進行了季節(jié)性的采樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)形態(tài)學方法相比，DNA宏條形碼技術的鑒定結(jié)果具有更高的類群豐富度，能更好地區(qū)分季節(jié)浮游生物，表明該技術是一種評價生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性的有效工具。

然而，為了實現(xiàn)利用DNA宏條形碼技術進行高通量、準確、快速地鑒定物種，最為重要的前提條件是構建權威的物種 DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫、物種的信息資料庫及信息共享平臺，這更加有利于對物種種質(zhì)資源的保護。

3 展望

海洋貝類與人類息息相關，既能供人類食用和藥用，又可以作為養(yǎng)殖生物的餌料。由于環(huán)境污染和過度捕撈等原因，海洋貝類數(shù)量急促下降，必須加快對其進行種質(zhì)資源保護。盡管隨著DNA條形碼技術的不斷發(fā)展和應用，涵蓋各類生物的DNA條形碼數(shù)據(jù)也在不斷地補充和完善，但是目前各平臺生物信息上傳的審核制度還不完善，數(shù)據(jù)庫中生物信息錯誤百出。因此，為了準確區(qū)分和鑒定各生物種類，保護物種的種質(zhì)資源，構建一個涵蓋各類生物的權威DNA條形碼數(shù)據(jù)庫已經(jīng)成為必然趨勢。

近年來，DNA條形碼技術也提供了可信息化的分類標準和行之有效的分類學手段，并為系統(tǒng)分類學、系統(tǒng)發(fā)育、生物多樣性研究、生物檢測和保護、數(shù)字化平臺建設、食品質(zhì)量檢測及醫(yī)學等方面的研究開辟了一個新的思路。DNA條形碼技術不僅已經(jīng)成為傳統(tǒng)形態(tài)物種鑒定方法的強有力輔助手段，而且通過以數(shù)字化形式呈現(xiàn)，使樣品鑒定的過程實現(xiàn)了標準化和自動化。同時，DNA條形碼技術擺脫了對分類學專家的過度依賴，為種質(zhì)資源保護與利用、保護生物多樣性、建設生態(tài)環(huán)境提供了準確且快速的物種信息服務。使用DNA條形碼對海洋貝類種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析具有重要意義，一方面通過揭示科內(nèi)不同種之間的親緣關系，確定近緣類群，為發(fā)掘優(yōu)質(zhì)基因和改良品種提供重要參考；另一方面通過比較不同海區(qū)的種質(zhì)資源的基因多樣性，從而發(fā)現(xiàn)不同類群的分布規(guī)律，為收集和保護海洋貝類種質(zhì)資源提供重要指導。因此，建立一個主要海洋貝類的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫是非常有必要的。

隨著宏條形碼(Metabarcoding)、微條形碼(Minibarcoding)、細胞器條形碼(Organelle-barcode)以及超級條形碼(Ultra-barcode)等技術的出現(xiàn)，DNA條形碼技術的潛力巨大，通過與其他分類學方法相結(jié)合，在種質(zhì)資源保護等方面會起到非常關鍵的作用。