劉 博，魏 津，馬 欣，王 甲，李俊平，羅玉峰

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

無菌檢驗(yàn)是獸用生物制品質(zhì)量控制的重要檢驗(yàn)項(xiàng)目，關(guān)系到獸用生物制品的安全性，準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果不僅能夠客觀公正地評(píng)價(jià)相關(guān)制品的質(zhì)量，還能夠?yàn)樯a(chǎn)企業(yè)提供技術(shù)參考，為行業(yè)監(jiān)管和行政決策提供堅(jiān)強(qiáng)的依據(jù)[1]。提高無菌檢驗(yàn)敏感性，降低無菌檢驗(yàn)操作難度，進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)有無菌檢驗(yàn)方法不僅可為行業(yè)內(nèi)獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)提供便利，還可進(jìn)一步保障獸藥安全、促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。本文從無菌檢驗(yàn)的依據(jù)、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基質(zhì)量控制、無菌檢驗(yàn)的具體方法幾個(gè)方面，對(duì)國內(nèi)外主流獸用生物制品無菌檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較分析，以探討影響無菌檢驗(yàn)結(jié)果的因素，為無菌檢驗(yàn)方法的優(yōu)化提供參考。

1 無菌檢驗(yàn)依據(jù)

中國獸用生物制品無菌檢驗(yàn)依據(jù)現(xiàn)行《中國獸藥典》2020年版三部[2]；歐盟國家獸用生物制品無菌檢驗(yàn)依據(jù)《歐洲藥典》10.0版[3]，且人藥和獸藥無菌檢驗(yàn)遵循一致依據(jù)；美國獸用生物制品無菌檢驗(yàn)依據(jù)《美國聯(lián)邦法規(guī)》第九卷(9CFR)[4]，而人藥無菌檢驗(yàn)依據(jù)《美國藥典》第19版，但是9CFR中明確規(guī)定，無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基的質(zhì)量控制需遵守《美國藥典》相關(guān)規(guī)定。

2 無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

2.1 培養(yǎng)基種類 現(xiàn)行《中國獸藥典》《歐洲藥典》及9CFR中無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基相同之處在于均使用兩種常規(guī)培養(yǎng)基，分別是硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(TG)及胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)。其中，TG培養(yǎng)基主要用于厭氧菌和需氧菌的檢查，TSB培養(yǎng)基主要用于真菌及需氧菌的檢查。

2.2 培養(yǎng)基配方 現(xiàn)行《中國獸藥典》《歐洲藥典》及9CFR中無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基的配方有所區(qū)別?！吨袊F藥典》TG和TSB培養(yǎng)基配方唯一?！稓W洲藥典》中TG培養(yǎng)基有兩種，一種與中國獸藥典中所列TG培養(yǎng)基配方一致，另一種省略了瓊脂和刃天青溶液。9CFR中TG培養(yǎng)基有兩種，一種與中國獸藥典中所列TG培養(yǎng)基配方一致，另一種額外添加了0.5%牛肉膏。此外，《中國獸藥典》另使用酪胨瓊脂培養(yǎng)基(GA)用于需氧菌的檢查，9CFR中另使用腦心浸液瓊脂用于真菌和需氧菌的檢查。

2.3 培養(yǎng)條件 《中國獸藥典》中規(guī)定，TG及GA培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度是35～37 ℃及23～25 ℃，TSB培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度是23～25 ℃；歐洲藥典規(guī)定TG培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度是30～35 ℃，TSB培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度是20～25 ℃，對(duì)于含汞類防腐劑的獸用生物制品，用TG替代TSB置于20～25 ℃培養(yǎng)；9CFR規(guī)定TG培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度是30～35 ℃，TSB培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度是30～35 ℃或者20～25 ℃，對(duì)于含汞類防腐劑的獸用生物制品，用TG替代TSB置于20～25 ℃培養(yǎng)。三種方法版本的無菌檢驗(yàn)用培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度見表1。

表1 無菌檢驗(yàn)用培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度Tab 1 Culture media and culture temperature of sterility test

3 無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基質(zhì)量控制

國內(nèi)外無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基質(zhì)量控制的要點(diǎn)均為無菌檢驗(yàn)和微生物促生長能力。

3.1 無菌檢驗(yàn) 《中國獸藥典》要求將三種培養(yǎng)基均分別置于35～37 ℃及23～25 ℃培養(yǎng)7 d，《歐洲藥典》及9CFR要求將TG和TSB分別置于30～35 ℃及23～25 ℃培養(yǎng)14 d，未發(fā)現(xiàn)有菌生長后方可使用。對(duì)于抽檢比例，《中國獸藥典》規(guī)定每批培養(yǎng)基隨機(jī)抽取10支(瓶)，《歐洲藥典》及9CFR僅要求抽取部分培養(yǎng)基進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，具體數(shù)量未做要求。

3.2 微生物促生長能力 《歐洲藥典》及9CFR使用6株質(zhì)控菌種控制培養(yǎng)基質(zhì)量，菌種代次不得超過5代；《中國獸藥典》使用5株質(zhì)控菌種，與《歐洲藥典》及9CFR相比少一株枯草芽孢桿菌，質(zhì)控菌種代次無具體要求?！稓W洲藥典》及9CFR具體規(guī)定如下：取不超過100 CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌菌種懸液分別接種TG培養(yǎng)基，于30～35 ℃培養(yǎng)不超過3 d；取不超過100 CFU的白色念珠菌、巴西曲霉、枯草芽孢桿菌菌種懸液分別接種TSB培養(yǎng)基，于20～25 ℃培養(yǎng)不超過5 d；若有菌生長，則培養(yǎng)基微生物促生長能力符合要求。《中國獸藥典》中規(guī)定，取不超過50 CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌菌種懸液分別接種TG培養(yǎng)基，于35～37 ℃培養(yǎng)3 d；取不超過50 CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌菌種懸液分別接種GA培養(yǎng)基，于35～37 ℃培養(yǎng)3 d；取不超過50 CFU的白色念珠菌、巴西曲霉菌種懸液分別接種TSB培養(yǎng)基，于23～25 ℃培養(yǎng)5 d；若有菌生長，則培養(yǎng)基微生物促生長能力符合要求。質(zhì)控菌種信息見表2。

表2 微生物促生長能力試驗(yàn)質(zhì)控菌種表Tab 2 Strains of the test micro-organisms suitable for use in the growth promotion test and the method suitability test

其他常規(guī)質(zhì)量控制參數(shù)中，《歐洲藥典》關(guān)于TG培養(yǎng)基裝量有特殊要求。TG培養(yǎng)基由于分為氧化層和厭氧層，要求儲(chǔ)存于密閉無菌容器內(nèi)，且培養(yǎng)基的上層表面積和深度之間需要遵循一定比例，保證在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，培養(yǎng)基氧化層在培養(yǎng)基高度的一半以內(nèi)?！吨袊F藥典》與9CFR無上述要求。

4 無菌檢驗(yàn)方法適用性檢測

《歐洲藥典》要求，對(duì)新制品進(jìn)行無菌檢驗(yàn)時(shí)或者檢驗(yàn)方法有更改時(shí)，需進(jìn)行方法適用性檢測(與檢品的無菌檢驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行)。

4.1 膜過濾法適用性檢測 在將待檢樣品轉(zhuǎn)移至濾膜過濾后，在用于洗滌濾器的無菌稀釋液中加入不超過100 CFU的質(zhì)控菌種。

4.2 直接接種法適用性檢測 在將待檢樣品接入培養(yǎng)基后，在培養(yǎng)基內(nèi)加入不超過100 CFU的質(zhì)控菌種。兩種方法適用性檢測均需用表2中所列的6種菌種分別進(jìn)行。將所有的樣品在適宜溫度培養(yǎng)不超過5 d。如果待檢樣品管內(nèi)質(zhì)控菌種生長狀態(tài)與陽性對(duì)照一致，則說明該樣品在當(dāng)前檢驗(yàn)方法下無抗菌活性或者其抗菌活性已經(jīng)被中和且符合要求，該方法可以直接應(yīng)用；如果與陽性對(duì)照相比，待檢樣品管內(nèi)質(zhì)控菌種未見明顯生長，則說明該樣品的抗菌活性在當(dāng)前方法下未被成功中和，當(dāng)前方法需要進(jìn)行修改并重新進(jìn)行適用性檢測。

5 無菌檢驗(yàn)操作方法

《中國獸藥典》和9CFR中，獸用生物制品無菌檢驗(yàn)只有直接培養(yǎng)法，樣品的最小抽檢量和最小取樣量均需遵循表3規(guī)定。

《歐洲藥典》中，無菌檢驗(yàn)用到的方法分別為膜過濾法和直接培養(yǎng)法。對(duì)于具體方法的選擇，《歐洲藥典》規(guī)定如下：只要檢品性質(zhì)允許，在當(dāng)前使用方法下無抗菌活性，均使用膜過濾法[5]。不論選擇哪種方法，樣品的最小抽檢量和最小取樣量均需遵循表4和表5規(guī)定。

表4 《歐洲藥典》樣品最小抽檢量Tab 4 Minimum number of items to be tested in EP

表5 《歐洲藥典》樣品最小取樣量Tab 5 Minimum quantity to be used for each medium in EP

5.1 膜過濾法 選擇濾膜孔徑不超過0.45 μm、截留微生物能力被驗(yàn)證過的、濾膜直徑大小為50 mm的膜式過濾器。水溶性制品、油性制品以及稀醇制品選擇硝酸纖維素濾膜；濃醇制品選擇醋酸纖維素濾膜。如果改變?yōu)V膜直徑，稀釋液以及洗液的體積也需相應(yīng)調(diào)整。過濾裝置和濾膜須保證自身無菌，且樣品在無菌條件下通過過濾裝置過濾，膜需要在無菌條件下取出并且放置于培養(yǎng)基內(nèi)，或者可直接在無菌條件下將培養(yǎng)基加入到過濾裝置中并培養(yǎng)。

5.2 直接培養(yǎng)法 《中國獸藥典》《歐洲藥典》及9CFR中無菌檢驗(yàn)均涉及直接培養(yǎng)法，但具體操作有所差別，此部分主要闡述各標(biāo)準(zhǔn)中培養(yǎng)法的差異。

5.2.1 《中國獸藥典》直接培養(yǎng)法 樣品按表3進(jìn)行抽樣后，半成品直接接種TG、TSB、GA小管培養(yǎng)3～7 d后判定結(jié)果。成品樣品經(jīng)過50 mL TG小瓶增菌3 d，再移植至TG、TSB、GA小管繼續(xù)培養(yǎng)7 d后判定結(jié)果。

5.2.2 《歐洲藥典》直接培養(yǎng)法 按照表4及表5進(jìn)行抽樣，取適量的樣品直接接種于培養(yǎng)基，除非有特殊規(guī)定，樣品接種量不低于培養(yǎng)基體積的10%。如果待檢樣品有抗菌活性，需用適宜中和劑中和其抗菌活性或者將樣品接入足夠量的培養(yǎng)基中以達(dá)到稀釋的作用。如果樣品的量大，則使用經(jīng)過濃縮的、后續(xù)需稀釋的培養(yǎng)基就更為合適。如果有必要，可以直接將濃縮的培養(yǎng)基加到樣品的容器中。將接種樣品后的培養(yǎng)基培養(yǎng)不少于14 d。在培養(yǎng)期間觀察培養(yǎng)基。油苗需每天輕輕搖晃，但是需要注意為了保證硫鹽培養(yǎng)基的厭氧環(huán)境，搖晃培養(yǎng)基的頻率和振幅需控制在最小。

5.2.3 9CFR直接培養(yǎng)法 含0.5%牛肉膏的TG培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基用于含梭菌類毒素、菌苗、以及菌苗-類毒素制品的無菌檢驗(yàn)；含或者不含0.5%牛肉膏的TG培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基用于其他滅活苗、細(xì)胞系、原代細(xì)胞及動(dòng)物源材料的無菌檢驗(yàn)。

病毒類活苗、原始毒種的無菌檢驗(yàn)選用TSB培養(yǎng)基(檢測細(xì)菌和真菌生長均用TSB，培養(yǎng)溫度上進(jìn)行區(qū)分)。需要保證樣品可能帶有的抑菌或者抑真菌活性被中和。

細(xì)菌類活苗、原始菌種的無菌檢驗(yàn)選用TG(檢測細(xì)菌)和TSB(檢測真菌)培養(yǎng)基。凍干制品需按照瓶簽注明的頭份/羽份數(shù)用隨樣品攜帶的稀釋液或者無菌純水復(fù)溶。推薦每1000 頭份/羽份疫苗用30 mL水復(fù)溶。

除注射外其他給藥方式的雞胚源活疫苗，未檢測或者按照常規(guī)活苗檢驗(yàn)方法檢測有菌生長時(shí)，選擇每毫升含500 Kinetic (Kersey)單位青霉素的腦心浸液瓊脂平皿進(jìn)行檢驗(yàn)。

6 討 論

6.1 無菌檢驗(yàn)的依據(jù) 無外源細(xì)菌和真菌污染，是獸用生物制品安全應(yīng)用的重要保障。無菌檢驗(yàn)作為檢測制品是否污染外源細(xì)菌和真菌的檢驗(yàn)參數(shù)，存在于所有獸用生物制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中(《中國獸藥典》細(xì)菌類活苗中為純粹檢驗(yàn))[6]。無菌檢驗(yàn)方法敏感性的高低，直接決定結(jié)果的準(zhǔn)確性。中國和美國對(duì)于獸用生物制品的無菌檢驗(yàn)均有單獨(dú)的規(guī)定且區(qū)分于人用藥品，而歐盟國家對(duì)于獸藥和人藥的無菌檢驗(yàn)依據(jù)是一致的?？紤]到檢驗(yàn)成本、適用對(duì)象、產(chǎn)品工藝及劑型差別，適當(dāng)?shù)膮^(qū)分更有利于檢驗(yàn)技術(shù)的推廣和開展。

6.2 無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基的質(zhì)量控制 無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基的質(zhì)量直接影響無菌檢驗(yàn)結(jié)果。培養(yǎng)基質(zhì)量的關(guān)鍵在于微生物促生長能力，《中國獸藥典》中檢驗(yàn)方法與國外最大的區(qū)別在于用于TSB培養(yǎng)基質(zhì)量控制的質(zhì)控菌株只有白假絲酵母菌和巴西曲霉，少一株枯草芽孢桿菌。由于TSB培養(yǎng)基應(yīng)用目的是檢測需氧菌和真菌的生長，因此使用枯草芽孢桿菌作為檢測TSB培養(yǎng)基促進(jìn)需氧菌生長能力的質(zhì)控菌株是有必要的。對(duì)于微生物促生長能力的檢測限，國外為培養(yǎng)基需檢出100 CFU的質(zhì)控菌，而我國規(guī)定需能檢出50個(gè)CFU的質(zhì)控菌，從這個(gè)角度來說，我國對(duì)于培養(yǎng)基質(zhì)量要求相對(duì)更高。自身無菌也是控制無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基質(zhì)量的重點(diǎn)，國內(nèi)與國外方法在這方面的差別在于培養(yǎng)時(shí)長，《中國獸藥典》中規(guī)定培養(yǎng)7 d，國外方法要求14 d。《美國藥典》和《歐洲藥典》分別于2000年和1998年將培養(yǎng)基的無菌檢驗(yàn)周期從7 d修改為14 d，原因在于考慮到7 d的周期可能無法檢測到部分“生長緩慢”的微生物，這為我國無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基質(zhì)量控制提供了參考。此外，對(duì)于培養(yǎng)基的抽樣比例也有所區(qū)別?！吨袊F藥典》規(guī)定每批次培養(yǎng)基隨機(jī)抽取10 支(瓶)進(jìn)行檢驗(yàn)，《美國藥典》和《歐洲藥典》規(guī)定抽取部分培養(yǎng)基進(jìn)行檢驗(yàn)，未明確具體抽檢數(shù)量。

6.3 無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基種類及培養(yǎng)條件的選擇 《中國獸藥典》對(duì)于無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基的選擇比較單一，而《歐洲藥典》和9CFR對(duì)于無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基均做過適當(dāng)調(diào)整，使培養(yǎng)基可以更適合于當(dāng)前樣品的培養(yǎng)?！稓W洲藥典》和9CFR中TG及TSB培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)溫度比《中國獸藥典》中規(guī)定的溫度略低，基于無菌檢驗(yàn)的目的主要是檢測生產(chǎn)過程中可能污染的環(huán)境雜菌，此類雜菌可適應(yīng)30～35 ℃以及20～25 ℃的培養(yǎng)條件，然而不同培養(yǎng)溫度對(duì)方法敏感性的影響還有待研究?！吨袊F藥典》內(nèi)無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基裝量恒定，《歐洲藥典》和9CFR內(nèi)無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基裝量根據(jù)檢品不同而不同。理論上來說，充足的培養(yǎng)基更有利于潛在污染菌的生長。考慮到TG培養(yǎng)基的特性，《歐洲藥典》特地對(duì)其裝量表面積和深度有所規(guī)定，是為了保證檢驗(yàn)結(jié)束時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)仍能保證需氧和厭氧兩個(gè)環(huán)境，對(duì)于潛在污染菌的檢出是值得借鑒的規(guī)定。9CFR中對(duì)于不同制品，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件均有差別。比如對(duì)于病毒類活疫苗，就不再選用TG培養(yǎng)基。這一點(diǎn)可能基于病毒活疫苗生產(chǎn)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式，不利于厭氧菌的生長，且有利于營養(yǎng)苛求需氧菌的生長，故選用TSB培養(yǎng)基在30～35 ℃培養(yǎng)以檢出樣品中潛在污染菌。對(duì)方法的細(xì)化有利于提高無菌檢驗(yàn)方法的敏感性和準(zhǔn)確性。近年來在檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，TSB培養(yǎng)基無法檢出組織源制品中污染營養(yǎng)苛求菌(如副豬嗜血桿菌、鏈球菌等)，導(dǎo)致制品出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果；或者因組織強(qiáng)毒污染導(dǎo)致無法客觀評(píng)價(jià)被檢疫苗的免疫效力。篩選出營養(yǎng)特性好的培養(yǎng)基用于特殊樣品的檢驗(yàn)非常值得深入研究。

6.4 無菌檢驗(yàn)方法 對(duì)于具體無菌檢驗(yàn)方法的選擇，除《歐洲藥典》中列出且首選膜過濾法外，《中國獸藥典》和9CFR對(duì)于獸用生物制品均選用直接培養(yǎng)法[7]。直接培養(yǎng)法從儀器設(shè)備、操作難度、經(jīng)濟(jì)成本方面來說都是優(yōu)于膜過濾法的選擇，推廣簡單上手容易，更利于獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于技術(shù)的掌握。然而，膜過濾法通過對(duì)樣品中潛在污染菌的濃縮、培養(yǎng)，從檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性來說更勝一籌。而對(duì)無菌檢驗(yàn)方法控制上，9CFR中要求檢驗(yàn)時(shí)需添加質(zhì)控菌作為陽性對(duì)照，還需同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。《歐洲藥典》除增加陰陽性對(duì)照外，在檢驗(yàn)方法或者檢驗(yàn)條件改變時(shí)還需進(jìn)行方法適用性檢測保證體系的適用性。對(duì)方法的控制可有力確保單次結(jié)果的準(zhǔn)確性，排除非樣品原因?qū)е碌臋z驗(yàn)結(jié)果異常。

《中國獸藥典》《歐洲藥典》及9CFR中對(duì)供試品的抽檢量各有規(guī)定，與本批制品的生產(chǎn)量直接相關(guān)，然而對(duì)于每一瓶樣品的接種量卻各有不同?！吨袊F藥典》和9CFR中，樣品的接種量是固定的，與樣品分類有關(guān)而與本身裝量基本無關(guān)?！稓W洲藥典》里，樣品的接種量和樣品裝量直接相關(guān)，且規(guī)定樣品接種量不能少于培養(yǎng)基裝量的10%。更為細(xì)致的接種量的選擇，對(duì)于保障結(jié)果準(zhǔn)確性，減少漏檢率是有意義的。

《中國獸藥典》中對(duì)于成品的無菌檢驗(yàn)均需按照接種-移植的步驟進(jìn)行，國外方法均為一步培養(yǎng)，僅在觀察過程中由于疫苗的性質(zhì)導(dǎo)致結(jié)果不易判定時(shí)才需進(jìn)一步移植。統(tǒng)一接種-移植的步驟可以稀釋防腐劑或抗生素、減少培養(yǎng)基用量，但是增加了操作程序且稀釋了樣品用量，對(duì)于某些對(duì)營養(yǎng)要求高的菌類，用TG小瓶培養(yǎng)3 d可能導(dǎo)致為數(shù)不多的菌死亡，從而造成漏檢。

6.5 小結(jié) 無菌檢驗(yàn)最早于1932年出現(xiàn)在《英國藥典》中，作為樣品安全性的重要指標(biāo)，幾十年來世界各國對(duì)于其方法的優(yōu)化和完善一直在進(jìn)行[8]。通過對(duì)《中國獸藥典》《歐洲藥典》和9CFR系統(tǒng)的比較發(fā)現(xiàn)，我國獸用生物制品無菌檢驗(yàn)方法仍然存在優(yōu)化和探討的空間。從培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、接種方式進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證，結(jié)合國情制定更為完善的無菌檢驗(yàn)方法，對(duì)我國獸用生物制品的生產(chǎn)和管理具有重要意義。