劉雪松，陳 亮，馮萬宇，張 蕾，沈思思，蘭世捷，李 丹，苗 艷，黃寶銀，史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005)

硫酸頭孢喹肟(Cefquinome sulfate)，分子式為C23H24N6O5S2H2SO4，CAS號(hào)為118443-89-3，又稱為硫酸頭孢喹諾和硫酸頭孢喹咪。硫酸頭孢喹肟是動(dòng)物專用第4代頭孢菌素類藥物，相比較于前3代頭孢菌素類藥物，具有更廣的抗菌譜，更強(qiáng)的抗菌效果，以及對(duì)β-內(nèi)酰胺酶具有更高的穩(wěn)定性[1]。硫酸頭孢喹肟?jī)?yōu)良的抗菌活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有著極大的關(guān)系。硫酸頭孢喹肟帶一個(gè)正電荷的四價(jià)季銨離子基團(tuán)，而母核帶負(fù)電荷，這種結(jié)果與前3代頭孢菌素的結(jié)構(gòu)不同。這一結(jié)構(gòu)可以幫助硫酸頭孢喹肟迅速穿過細(xì)胞膜，并且保證了其對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的高度穩(wěn)定性[2]。許多報(bào)道表明，硫酸頭孢喹肟對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌、致病性大腸桿菌以及多殺性巴氏桿菌等具有良好的敏感性。對(duì)治療細(xì)菌引起的敗血癥、乳房炎以及子宮內(nèi)膜炎等具有良好的效果[3]。硫酸頭孢喹肟在多種動(dòng)物上進(jìn)行過藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，但是在安格斯牛體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究未見報(bào)道。試驗(yàn)為首次在安格斯牛體內(nèi)進(jìn)行的硫酸頭孢喹肟藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 硫酸頭孢喹肟注射液，批號(hào)：DLD210401，購(gòu)自河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司。硫酸頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)：G130285，購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。色譜級(jí)乙腈，批號(hào)：R141437，購(gòu)自北京迪科馬科技有限公司。分析級(jí)甲酸，批號(hào)：20171018，購(gòu)自遼寧泉瑞試劑有限公司。

1.1.2 儀器 島津LC 20-AT液相色譜儀、二級(jí)陣列管檢測(cè)器、InertSustainC18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，購(gòu)自日本島津公司。TGL-16G高速離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠。MD200-1氮吹儀，購(gòu)自杭州奧盛儀器有限公司。渦旋振蕩器，購(gòu)自海門市其林貝爾儀器有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 安格斯牛6頭，170～220 kg，雌性各半，7～8月齡，購(gòu)自黑龍江省齊齊哈爾市周邊肉牛養(yǎng)殖廠。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 根據(jù)相應(yīng)參考文獻(xiàn)，確定流動(dòng)相為0.05%甲酸水和乙腈，體積比為90∶10。流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm[4]。

1.2.2 樣品前處理 將300 μL血漿，加入300 μL的1%甲酸乙腈，混合均勻后，用渦旋震蕩1 min后，14000 r/min離心15 min，吸取上清，進(jìn)行氮?dú)獯蹈桑瑴囟葹?0 ℃。用300 μL流動(dòng)相對(duì)吹干物質(zhì)進(jìn)行溶解，過膜后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 對(duì)不含有任何藥物的安格斯牛血漿進(jìn)行處理，獲得不含有任何藥物的血漿基質(zhì)，在80 μL無藥物的血漿基質(zhì)中添加20 μL相應(yīng)濃度的硫酸頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)品溶液，均勻混合，使最終藥物濃度分別為5、10、50、200、500、1000 ng/mL。分別將添加藥物的樣品進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 方法學(xué)專屬性 向80 μL不含有任何藥物的血漿中添加20 μL相應(yīng)濃度的硫酸頭孢喹肟的標(biāo)準(zhǔn)液，使得藥物最終濃度分別為50、500、1000 ng/mL。進(jìn)行前處理后進(jìn)行高效液相色譜藥物濃度檢測(cè)。將經(jīng)過前處理的藥物峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線中的藥物峰面積進(jìn)行比較。做3個(gè)重復(fù)，3個(gè)批次，計(jì)算回收率、批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差以及批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)信噪比S/N≥3時(shí)添加到無藥血漿基質(zhì)中的硫酸頭孢喹肟的濃度作為檢測(cè)限(LOD)，S/N≥10時(shí)添加到無藥血漿基質(zhì)中的硫酸頭孢喹肟的濃度為定量限(LOQ)。

1.2.5 藥動(dòng)學(xué)設(shè)計(jì) 在給藥開始前，采集未注射任何藥物的安格斯牛血液，置于肝素鈉無菌采血管中。經(jīng)過離心后，獲得無藥物的空白血漿。將6頭牛分為A、B兩組。其中A組以2 mg/kg的劑量靜脈注射硫酸頭孢喹肟，B組以2 mg/kg的劑量皮下注射硫酸頭孢喹肟。在給藥后，兩組牛在0.083、0.167、0.5、1、3、6、9、12 h進(jìn)行頸靜脈采血。靜脈注射的牛在注射藥物的對(duì)側(cè)頸靜脈采血。采血量為4 mL，置于含有肝素鈉的無菌采血管中。采集的血液樣品在3500 r/min、4 ℃條件下離心15 min，取上清，獲得血漿樣品。6頭牛在經(jīng)過2周的休藥期后，隨機(jī)選取3頭牛以2 mg/kg的劑量進(jìn)行肌肉注射，并按上述操作進(jìn)行血漿樣品的獲取。

1.2.6 參數(shù)計(jì)算 藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)采用Winnonlin 5.2.1軟件進(jìn)行分析。采用非房室模型(Non-compartmental analysis,NCA)分析血漿中藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)。計(jì)算肌肉注射的絕對(duì)生物利用度，以及皮下注射的絕對(duì)生物利用度，公式如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)專屬性 硫酸頭孢喹肟的出峰時(shí)間為16.8～17.2 min。在硫酸頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸頭孢喹肟血漿添加樣品以及采集的血漿樣品中都無雜質(zhì)峰干擾。無藥物血漿色譜圖、硫酸頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖以及采集的血漿樣品色譜圖如圖1所示。

a. 無藥物血漿色譜圖；b. 硫酸頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；c. 給藥后采集血漿樣品色譜圖a. chromatogram of durg-free plasma sample; b. chromatogram of standard cefquinome sulfate sample. c. chromatogram of collected plasma sample after administration.圖1 樣品色譜圖Fig 1 Chromatograms of cefquinome sulate

在50、500、1000 ng/mL的濃度下，硫酸頭孢喹肟的回收率在82.35%～104.27%。批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.73%～6.87%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.69%～8.75%。根據(jù)信噪比S/N≥3時(shí)添加到無藥血漿基質(zhì)中的硫酸頭孢喹肟的濃度，檢測(cè)限(LOD)為10 ng/mL，根據(jù)信噪比S/N≥10時(shí)添加到無藥血漿基質(zhì)中的硫酸頭孢喹肟的濃度，定量限(LOQ)為20 ng/mL。試驗(yàn)采用的高效液相色譜方法具有良好的方法學(xué)專屬性。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，相關(guān)系數(shù)為0.9974，方程為Y=12960X+110486。說明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線可用。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 2 Standard curve

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算 藥物-時(shí)間數(shù)據(jù)如表1所示。藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表2及圖3所示。具體藥-時(shí)數(shù)據(jù)如表3所示。靜脈注射后硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下：消除半衰期(T1/2β)為(2.05±0.49) h，達(dá)峰時(shí)間(Tmax)為(0.75±0.25) h，藥時(shí)曲線下面積(AUC)為(24.72±5.31) μg·h/mL，達(dá)峰濃度(Cmax)為(7.31±1.98)μg/mL，平均滯留時(shí)間(MRT)為(2.83±0.61)h，清除率(CL)為(0.07±0.02)L/h·kg，表觀分布容積(Vd)為(0.23±0.06)L/kg。肌肉注射后硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下：消除半衰期(T1/2β)為(2.17±0.51)h，達(dá)峰時(shí)間(Tmax)為(0.87±0.25)h，藥時(shí)曲線下面積(AUC)為(19.97±3.11)μg·h/mL，達(dá)峰濃度(Cmax)為(5.34±1.21)μg/mL，平均滯留時(shí)間(MRT)為(3.02±0.71) h，清除率(CL)為(0.09±0.03) L/h·mLkg，表觀分布容積(Vd)為(0.31±0.08)L/kg。皮下注射后硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下；消除半衰期(T1/2β)為(2.37±0.47) h，達(dá)峰時(shí)間(Tmax)為(1±0.37) h，藥時(shí)曲線下面積(AUC)為(20.51±4.87) μg·mLh/mL，達(dá)峰濃度(Cmax)為(5.16±1.29) μg/mL，平均滯留時(shí)間(MRT)為(3.26±0.89) h，清除率(CL)為(0.09±0.04) L/h.kg，表觀容積(Vd)為(0.32±0.09) L/kg。肌肉注射的絕對(duì)生物利用度(F)為80.78%。肌肉注射的絕對(duì)生物利用度(F)為82.96%。

表1 藥-時(shí)數(shù)據(jù)Tab 1 Concentration-time data

表2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab 2 Pharmacokinetic parameters

圖3 藥-時(shí)曲線圖Fig 3 Concentration-time curve

3 討論與結(jié)論

硫酸頭孢喹肟的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究在多種動(dòng)物上都有相關(guān)的報(bào)道。本次靜脈注射后的消除半衰期(T1/2β)為2.05 h，與Ahmad在牛體內(nèi)測(cè)定的2.1 h接近[5]，低于Dinakaran等在水牛體內(nèi)測(cè)定的3.56 h[6]，低于Dumka等在山羊體內(nèi)測(cè)定的5.76 h[7]，高于Cheng等在雛鴨體內(nèi)測(cè)定的0.97 h，以及在雛鵝體內(nèi)測(cè)定的1.73 h[8]。本次靜脈注射后，硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內(nèi)的表觀分布容積(Vd)為0.23 L/kg，略低于Ahmad在牛體內(nèi)測(cè)定的0.28 L/kg[5]，低于宋永強(qiáng)在山羊體內(nèi)測(cè)定的0.61 L/kg[9]，低于Cheng等在雛鵝體內(nèi)測(cè)定的0.43 L/kg，高于在雛鴨體內(nèi)測(cè)定的0.042 L/kg[8]。測(cè)得的血漿清除率(CL)為0.07 L/h·mLkg，與Dinakaran在水牛體內(nèi)測(cè)定的0.06 L/h·mLkg相近[6]，低于Ahmad在牛體內(nèi)的0.12 L/h·mLkg以及Zhao等在黑天鵝體內(nèi)測(cè)定的0.13 L/h·mLkg[5,10]。靜脈注射后的藥時(shí)曲線下面積(AUC)為24.72 μg·h/mL，低于Dumka在山羊體內(nèi)測(cè)定的33.83 μg·h/mL，高于Zhou等在比格犬體內(nèi)測(cè)定的8.51 μg·h/mL[7,11]。測(cè)定的靜脈注射后在安格斯牛體內(nèi)的平均滯留時(shí)間(MRT)為2.83 h，低于Dinakaran在水牛體內(nèi)測(cè)定的4.24 h[6]，低于Dumka在山羊體內(nèi)測(cè)定的6.09 h[7]，高于Ahmad在牛體內(nèi)測(cè)定的2.3 h[5]。研究中肌肉注射后的消除半衰期(T1/2β)為2.17 h，高于李沖在豬體內(nèi)測(cè)定的1.98 h[12]，低于Dumka在山羊體內(nèi)測(cè)定的5.86 h[7]，低于俞吉杰在肉鴨體內(nèi)測(cè)定的5.76 h[13]。測(cè)定肌肉注射后，硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內(nèi)的表觀分布容積(Vd)為0.31 L/kg，與Zhao等測(cè)定的靜脈注射后在黑天鵝體內(nèi)的0.32 L/kg相近，低于李沖在豬體內(nèi)測(cè)定的0.71 L/kg[10,12]。肌肉注射后，硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內(nèi)的達(dá)峰濃度(Cmax)為5.34 μg/mL，與Zhang等在黑天鵝體內(nèi)測(cè)定的5.71 μg/mL相近[10]，高于Dumka等在山羊體內(nèi)測(cè)定的4.84 μg/mL[7]，高于Zhou在比格犬體內(nèi)測(cè)定的4.84 μg/mL[11]。本次試驗(yàn)，肌肉注射的絕對(duì)生物利用度(F)達(dá)到了80.78%，高于Dumka等在山羊體內(nèi)測(cè)定的57.39%[7]，高于Zhao在黑天鵝體內(nèi)測(cè)定的74.2%[10]，低于Zhou等在比格犬體內(nèi)測(cè)定的97.8%[11]。皮下注射后測(cè)定消除半衰期(T1/2β)為2.37 h，低于Corum等在綿羊體內(nèi)測(cè)定的7.59 h[14]。達(dá)峰濃度(Cmax)為5.16 μg/mL，高于Zhou等在比格犬體內(nèi)測(cè)定的3.88 μg/mL以及Corum等在綿羊體內(nèi)測(cè)定的3.65 μg/mL[11,14]。根據(jù)歐盟藥敏試驗(yàn)(EUCAST)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，流行病學(xué)折點(diǎn)值(Epidemiological cut-off，ECOFF)是協(xié)助藥物臨床使用折點(diǎn)制定的重要依據(jù)之一[15]。目前為止，根據(jù)EUCAST官網(wǎng)上已經(jīng)公布的數(shù)據(jù)，頭孢喹肟對(duì)于溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)的ECOFF值為0.06 μg/mL。頭孢喹肟對(duì)于多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)的ECOFF值為0.125 μg/mL。頭孢喹肟對(duì)于275株大腸桿菌(Escherichiacoli)的MIC值皆為0.06 μg/mL。本次試驗(yàn)，無論哪種注射方式，安格斯牛血藥濃度高于不同細(xì)菌ECOFF值的時(shí)間占比都較高，表明在現(xiàn)階段頭孢喹肟可以有效治療相關(guān)疾病。

以往的研究認(rèn)為，硫酸頭孢喹肟的抗菌機(jī)制與其他頭孢菌素類抗生素一樣，都是通過競(jìng)爭(zhēng)青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin binding proteins，PBPs)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[16]。一些研究表明，除了以上的抗菌機(jī)制以外，頭孢喹肟也可以干預(yù)細(xì)菌生物被膜的形成，從而減少細(xì)菌極端抗性的產(chǎn)生。生物被膜(Biofilm)附著在生物或者非生物表面上，是由細(xì)菌及其分泌的多種基質(zhì)組成的細(xì)菌群落，是造成致病性細(xì)菌持續(xù)感染的重要原因之一，是維持細(xì)菌毒力及其耐藥性的重要因素之一[17]。Zhou等建立了金黃色葡萄球菌生物被膜小鼠體內(nèi)感染模型，并運(yùn)用PK/PD同步模型得出了頭孢喹肟達(dá)到不同生物被膜減少效果的所需的PK/PD指數(shù)值，得出頭孢喹肟可以有效減少金黃色葡萄球菌生物被膜的形成[18]。周永輝證明了低于最小抑菌濃度(Minimal inhibit concentration，MIC)的頭孢喹肟可以對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜的形成起到干預(yù)作用。低于MIC的頭孢喹肟可以降低咪唑甘油磷酸酯脫水酶(IGPD)的活性及組氨酸的生物合成，而且還可以與IGPD的組氨酸36、組氨酸63相結(jié)合，達(dá)到干預(yù)生物被膜的作用[19]。

除了經(jīng)常使用的注射劑和粉針劑以外，許多新的硫酸頭孢喹肟劑型被研制出來。杜新旋[20]研制出了納米化硫酸頭孢喹肟透皮劑，提高了硫酸頭孢喹肟的滲透性，更加易于吸收，可以更加有效地在靶部位干預(yù)細(xì)菌生物被膜的形成，達(dá)到優(yōu)良的抗菌效果。李德謙[21]研制出了硫酸頭孢喹肟的長(zhǎng)效注射劑型，具有良好的緩釋作用，可以長(zhǎng)效地抑制細(xì)菌生物被膜的形成。付強(qiáng)[22]研制出了硫酸頭孢喹肟的脂質(zhì)體制劑，有效提高了硫酸頭孢喹肟的緩釋作用，抗菌有效性以及肺靶向性。李輝[23]研制成功了硫酸頭孢喹肟的乳膏劑，使硫酸頭孢喹肟給藥方式較為方便[23]。除此之外，乳房注入劑、微球以及微乳等劑型也已經(jīng)研制成功。這些新劑型各具優(yōu)勢(shì)，可以有效提高硫酸頭孢喹肟的利用率，并且可以有效提升硫酸頭孢喹肟在靶部位對(duì)于細(xì)菌生物被膜形成的干預(yù)作用。目前，作為動(dòng)物專用的頭孢菌素類藥物，硫酸頭孢喹肟在臨床上使用率較高。試驗(yàn)得出了硫酸頭孢喹肟在安格斯牛體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，為硫酸頭孢喹肟在安格斯牛的合理使用提供了數(shù)據(jù)，也為減少細(xì)菌對(duì)硫酸頭孢喹肟的耐藥性提供了試驗(yàn)依據(jù)。