曹 秀，劉秀娟，馮慧慧，楊亞琴，余明霞，董小海，鐘紅艦

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，鄭州 450002)

目前，國(guó)內(nèi)獸藥市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)激烈，獸藥制劑中非法添加化學(xué)藥物的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，添加藥物種類多樣，如禁用藥物、人用藥物；添加手段隱蔽，如同類藥物代替標(biāo)稱藥物，使得獸藥檢測(cè)與監(jiān)管的難度越來(lái)越大[1-2]。為進(jìn)一步嚴(yán)格獸藥生產(chǎn)與管理，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部近年來(lái)連續(xù)發(fā)布了關(guān)于《獸藥中非特定非法添加物質(zhì)檢查方法》的公告作為獸藥非法添加的法定標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。獸藥非特定非法添加物質(zhì)的檢查方法主要有顯微鏡檢查法[5]、薄層色譜法[6]、高效液相色譜法[7-10]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[11-14]等。顯微鏡檢查法適用性范圍窄；薄層色譜法是初篩的常見(jiàn)手段，但存在假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)。高效液相色譜配二極管陣列檢測(cè)法(HPLC-PDA)應(yīng)用范圍廣泛，適合于不同種類獸藥制劑的非法藥物添加檢測(cè)，能準(zhǔn)確定性和定量。該方法日益成熟，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布諸多公告多為該方法。然而，HPLC-PDA在獸藥非法添加物質(zhì)檢查中存在局限性，如無(wú)法鑒別PDA光譜圖庫(kù)以外的化合物；部分化合物在不同色譜條件下光譜圖差異大，難溯源；無(wú)法檢測(cè)無(wú)紫外吸收的化合物，造成漏篩等[15]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于其高特異性、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測(cè)違禁添加藥物的重要手段。該方法對(duì)添加物的檢測(cè)無(wú)歧視，在合適的質(zhì)譜條件下，可以獲得其分子離子及碎片的信息，對(duì)推斷未知物很有尤為重要，LC-MS/MS通過(guò)定性離子與定量離子能對(duì)未知物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。近年來(lái)，LC-MS/MS技術(shù)在獸藥制劑中氯霉素、硝基呋喃類藥物、磺胺類藥物、硝基咪唑類藥物及喹諾酮類藥物的檢測(cè)均有報(bào)道[11-14]。

喹諾酮類及磺胺類藥物是水產(chǎn)和畜牧養(yǎng)殖中常用的廣譜抗菌藥物，也是常見(jiàn)的非法添加藥物；孔雀石綠、金剛烷胺與金剛乙胺屬于禁用藥物，這些藥物在動(dòng)物體內(nèi)殘留及代謝，會(huì)對(duì)人類健康造成一定傷害。獸藥制劑基質(zhì)種類多，如預(yù)混劑、可溶性粉劑、獸藥散劑、注射液等，不能直接采用常規(guī)的飼料或動(dòng)物源中獸藥殘留檢測(cè)分析技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，因此建立一套有效的獸藥制劑中多種獸藥殘留分析方法非常重要。

研究建立了獸藥制劑中喹諾酮類、磺胺類、孔雀石綠、金剛烷胺等26種藥物的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法簡(jiǎn)單快捷，靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可滿足市場(chǎng)獸藥制劑中多種藥物的篩查需求，為獸藥監(jiān)管提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器 LC MS-8050 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源及LabSolution LC MS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(日本Shimadzu公司)；快速混勻器SK-1(金壇市中大儀器廠)；高速冷凍離心機(jī)GL-21B(上海安亭科學(xué)儀器廠)；氮吹儀QGC-36T(上海全島公司)。

1.2 藥品與試劑 氧氟沙星、諾氟沙星、甲磺酸培氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、洛美沙星、甲磺酸達(dá)氟沙星、恩諾沙星、鹽酸沙拉沙星、氟甲喹、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺二甲異噁唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、甲氧芐啶、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、金剛烷胺、金剛乙胺，26種化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司，純度均大于99.0%。甲醇、乙腈、甲酸，色譜純，購(gòu)自德國(guó)Mecrk公司。實(shí)驗(yàn)所用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)制備的超純水。試驗(yàn)所用獸藥制劑樣品均為市售合格樣品，分別為20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉、10%恩諾沙星可溶性粉、25%維生素C可溶性粉。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱CAPCELL PAK C18(100 mm×2.0 mm，3 μm)；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A相為5 mmol/L甲酸-甲酸銨，B相為甲醇-乙腈(1∶1,V∶V)；線性梯度洗脫程序：0～2 min，90% A；2～3 min，85% A；3～13 min，85% A；13～20 min，15%A；20～25 min，15% A；25.10 min恢復(fù)初始比例，90% A，保持至28 min；流速為0.200 mL/min；進(jìn)樣體積為1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜測(cè)定條件 電噴霧離子源，正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；離子源接口電壓4.5 kV；霧化氣流速3 L/min；干燥氣流速10 L/min；加熱器流速10 L/min；脫溶劑管溫度250 ℃；加熱模塊溫度400 ℃；接口溫度300 ℃；碰撞誘導(dǎo)電離氣體壓力270 kPa，各化合物質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.4.1 單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 分別精密稱取5 mg(精確至0.01 mg)26種化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于各自的5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1 mg/mL的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃以下避光冷凍保存。

1.4.2 26種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 分別精密稱取5 mg(精確至0.01 mg)26種化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1 mg/mL的26種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃以下避光冷凍保存。

1.4.3 26種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 準(zhǔn)確移取0.1 mL 26種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL)至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成 10 μg/mL的26種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃避光冷藏保存。

1.4.4 26種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 精密移取適量26種化合物10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇水(1∶1，V∶V)溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、1、2、10 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.5 獸藥制劑前處理 準(zhǔn)確稱取1.00 g(精確至0.01 g)獸藥制劑于50 mL塑料離心管中，加10 mL 0.2%甲酸乙腈超聲提取10 min，置于振蕩器振蕩30 min，8000 r/min離心5 min，移取2 mL上清液于氮?dú)獯蹈蓛x中濃縮至干，用1 mL甲醇溶解殘?jiān)? mL 0.2% 甲酸水溶液，渦旋混勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜得到預(yù)備液。為避免獸藥原藥對(duì)質(zhì)譜的污染，預(yù)備液經(jīng)甲醇:水溶液(1∶1,V∶V)稀釋10000倍后，經(jīng)LC-MS/MS測(cè)定。

1.6 檢出限與定量限 選取20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉作為空白樣品，在空白樣品添加適量的26種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按1.5方法處理樣品，經(jīng)1.3方法儀器條件進(jìn)行測(cè)定。依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S /N≥3 的濃度為方法檢出限(LOD)，S /N≥10 的濃度為方法定量限(LOQ)。

1.7 精密度與準(zhǔn)確度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。分別在20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉樣品中添加LOD、LOQ及5倍LOQ三個(gè)濃度水平的26種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，添加濃度見(jiàn)表3。按1.5方法處理樣品，經(jīng)1.3方法儀器條件進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)添加濃度進(jìn)行5個(gè)樣品的平行試驗(yàn)，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.8 實(shí)際樣品的測(cè)定方法 選取市售合格的獸藥制劑樣品，分別為20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉、10%恩諾沙星可溶性粉、25%維生素C可溶性粉按照1.5方法處理，經(jīng)1.3方法儀器條件進(jìn)行測(cè)定。

表1 26種化合物質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間Tab 1 Retention time and main mass spectrometry parameters of 26 compounds

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍 按1.4.4方法配制的26種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線在1.3方法儀器條件下測(cè)定。26種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 ng/mL)總離子流圖見(jiàn)圖1，26種化合物出峰順序及保留時(shí)間見(jiàn)表1，26種化合物分離度良好，響應(yīng)靈敏。以各化合物定量離子色譜峰面積A為縱坐標(biāo)，各化合物質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，繪制26種化合物的線性回歸方程。結(jié)果表明：26種化合物在0.1～10 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.99，26種化合物的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

2.2 檢出限與定量限 20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉作為空白樣品經(jīng)1.5方法處理后，測(cè)定結(jié)果表明：在相應(yīng)的保留時(shí)間，空白樣品及試劑空白對(duì)26種目標(biāo)化合物無(wú)干擾，空白樣品圖譜及試劑空白圖譜見(jiàn)圖2。依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S /N≥3 的濃度為方法檢出限，該方法檢出限為0.01 mg/g，特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S /N≥10 的濃度為方法定量限，方法定量限為0.02 mg/g。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度 依據(jù)1.7方法制備添加濃度分別為0.01 mg/g、0.02 mg/g、0.1 mg/g的陽(yáng)性樣品，每個(gè)濃度水平下平行測(cè)定5次，外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，26種化合物的平均回收率為70.0%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.9%～8.8%，結(jié)果見(jiàn)表3。圖3為添加濃度為0.1 mg/g獸藥制劑陽(yáng)性樣品圖譜。

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定 對(duì)市售的20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉、10%恩諾沙星可溶性粉、25%維生素C可溶性粉分別進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè)。結(jié)果表明：20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉、25%維生素C可溶性粉均未檢出26種化合物。10%恩諾沙星可溶性粉獸藥制劑除標(biāo)稱“恩諾沙星”檢出外，其余25種化合物未檢出。經(jīng)測(cè)定，10%恩諾沙星可溶性粉獸藥制劑中恩諾沙星含量為105 mg/g(有效含量為10.5%)，與產(chǎn)品標(biāo)識(shí)含量(10%恩諾沙星)一致。圖4為10%恩諾沙星可溶性粉圖譜。

表2 26種化合物線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Tab 2 Regression equation,correlation coefficients(r2)，LODs and LOQs of 26 compounds

表3 26種化合物在陽(yáng)性樣品中的回收率(n=5)Table3 Recoveries of 26 compounds in different positive samples (n=5)

續(xù)表3

圖1 26種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 ng/mL)總離子流圖Fig 1 Total ion flow chromatograms of 26 compounds (10 ng/mL)

圖2 (A)20%氟苯尼考粉樣品空白(B)30%氟苯尼考可溶性粉樣品空白(C)溶劑空白圖譜Fig 2 Chromatograms of blank samples (A) 20% florfenicol powder (B) 30% florfenicol soluble powder)and(C) solvent blank

圖3 獸藥制劑陽(yáng)性樣品(添加量為0.1 mg/g)圖譜Fig 3 Chromatograms of spiked sample(0.1 mg/g)

圖4 實(shí)際樣品檢測(cè)(10%恩諾沙星可溶性粉)圖譜Fig 4 Actual sample test (10% enrofloxacin soluble powder)

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 研究選用CAPCELL PAK C18(100 mm×2.0 mm，3 μm)色譜柱對(duì)26種化合物進(jìn)行分離，依據(jù)目標(biāo)化合物的性質(zhì)，流動(dòng)相均選用酸性溶液，如0.1%甲酸水，乙酸銨溶液、甲酸-甲酸銨復(fù)配溶液。本研究考察了甲醇-乙腈(1∶1,V∶V)作為有機(jī)相時(shí)，選取0.1%甲酸水、5 mmol/L乙酸銨及5 mmol/L甲酸-甲酸銨作為水相，采用梯度洗脫的方式對(duì)26種化合物進(jìn)行分離。研究結(jié)果表明，當(dāng)選用5 mmol/L甲酸-甲酸銨作為水相時(shí)，26種化合物的分離度及峰形優(yōu)于0.1%甲酸水和5 mmol/L 乙酸銨溶液。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 方法采用不接分析柱的方式向質(zhì)譜系統(tǒng)注入 1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量為1 μL。確定各化合物的最佳質(zhì)譜條件，包括離子源溫度、毛細(xì)管溫度、加熱模塊溫度、加熱氣流速、干燥氣流速、氮?dú)饬魉?、選擇特征離子對(duì)、Q1和Q3的電壓、碰撞能量等質(zhì)譜分析條件。各化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)高效液相色譜流動(dòng)相混合后注入ESI電離源，進(jìn)行一級(jí)全掃描質(zhì)譜分析。在正離子模式下對(duì)[M+H]+進(jìn)行子離子掃描，得到主要的子離子，并選擇響應(yīng)值高的子離子進(jìn)行碰撞能量?jī)?yōu)化，最終確定了多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的離子對(duì)及碰撞能量，建立的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

3.3 提取溶劑的選擇 獸藥制劑基體復(fù)雜，含有大量的鹽及表面活性劑。試驗(yàn)為避免獸藥粉劑中有機(jī)鹽份的干擾，選用甲醇、乙腈、0.2%甲酸乙腈3種提取溶劑對(duì)30%氟苯尼考可溶性粉陽(yáng)性樣品(添加濃度為0.1 mg/g)進(jìn)行提取試驗(yàn)。選用甲醇和乙腈作為提取溶劑時(shí)，甲氧芐啶與磺胺類藥物的平均回收率較高，為80.2%～99.4%，喹諾酮類藥物的平均回收率為60.5%～80.2%，金剛烷胺與金剛乙胺的平均回收率為58.9%～70.6%，孔雀石綠與隱色孔雀石綠的平均回收率為66.2%～81.6%；選用0.2%甲酸乙腈作為提取溶劑時(shí)，甲氧芐啶與磺胺類藥物的平均回收率為78.2%～95.2%，喹諾酮類藥物的平均回收率為90.6%～101%，金剛烷胺、金剛乙胺、孔雀石綠與隱色孔雀石綠的平均回收率為83.5%～97.6%。因此本試驗(yàn)選用0.2%甲酸乙腈作為獸藥制劑的提取溶劑。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用于獸藥非特定非法添加物質(zhì)的檢查，其檢出限能達(dá)到1 μg/kg(十億分之一)，甚至更低。然而，同一車間同一流水線生產(chǎn)不同品種的獸藥，盡管經(jīng)過(guò)清場(chǎng)及清洗設(shè)備，還是會(huì)有少量的藥物殘留，一般這種殘留是極低且不均勻。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用于獸藥非特定非法添加物質(zhì)的檢查時(shí)更要注意選取的提取溶劑對(duì)獸藥原藥的提取效率，防止獸藥原藥對(duì)質(zhì)譜造成污染，因此，經(jīng)LC-MS/MS測(cè)定前用適當(dāng)溶劑稀釋后再上機(jī)測(cè)定。

目前，我國(guó)獸藥非法添加物質(zhì)檢查的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)暫無(wú)判定限，僅要求給出檢測(cè)方法的檢出限或定量限。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布諸多公告多為高效液相色譜配二極管陣列檢測(cè)法(HPLC-PDA)，其檢出限在1 mg/g左右。研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)快速測(cè)定獸藥制劑中喹諾酮類、磺胺類、孔雀石綠及金剛烷胺26種藥物的方法，且檢出限低(0.01 mg/g)。26種藥物在較寬的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，該方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，方法靈敏度高，能對(duì)獸藥粉劑中常規(guī)添加藥物及禁用藥物進(jìn)行快速篩查和準(zhǔn)確定量。研究為獸藥制劑中多種非特定添加藥物快速篩查和定量提供了參考，為行政監(jiān)管部門(mén)提供了可靠的技術(shù)支撐。