溫 淵，劉東慧，李兆才，譚書敏，梁 林，黃 勇，周繼章*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

衣原體(Chlamydia)是一類專性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，具有復(fù)雜的形態(tài)結(jié)構(gòu)，依賴宿主的能量合成自身的代謝物質(zhì)，是一種重要的人畜共患病原體[1]。衣原體科下只有一個(gè)衣原體屬，共有14個(gè)衣原體種[2]，其中的流產(chǎn)衣原體(Chlamydiaabortus,C.abortus)是導(dǎo)致綿羊衣原體病的主要原因。綿羊衣原體病是一種重要的人畜共患病，又稱綿羊地方性流產(chǎn)(Enzootic abortion of ewes, EAE)[3]。母羊感染流產(chǎn)衣原體后會(huì)導(dǎo)致化膿性胎盤炎、早產(chǎn)、產(chǎn)出死胎或虛弱的羊羔，并且母羊成為病原體攜帶者，在孕期通過(guò)胎盤、流產(chǎn)胎兒或陰道分泌物排出大量病原體，感染其他動(dòng)物或人類[4-5]。此外，孕婦可能在接觸感染動(dòng)物后患病，導(dǎo)致流產(chǎn)[6]。流產(chǎn)衣原體的主要宿主是家畜，但在全球各地的其他物種中也發(fā)現(xiàn)了零星病例，如馬和鹿等[7-8]，甚至野鴨中也有發(fā)現(xiàn)，感染宿主極其廣泛，其引起的大規(guī)模流產(chǎn)給全球大多數(shù)地區(qū)造成了不容忽視的經(jīng)濟(jì)損失[7]。

目前我國(guó)對(duì)流產(chǎn)衣原體大規(guī)模診斷的方法主要有IHA技術(shù)和常規(guī)PCR技術(shù)，但I(xiàn)HA技術(shù)操作繁瑣且靈敏度較低，常規(guī)PCR只能進(jìn)行定性檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好及操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在分子生物學(xué)診斷方面有廣泛應(yīng)用。國(guó)內(nèi)針對(duì)流產(chǎn)衣原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的研究相對(duì)較少，張志君和周丹娜等分別建立了針對(duì)流產(chǎn)衣原體的SYBR Green Ⅰ方法和分子信標(biāo)探針?lè)椒╗9-10]，但這些方法尚未在臨床檢測(cè)和動(dòng)物衣原體病的流行病學(xué)研究中大規(guī)模應(yīng)用。TaqMan探針?lè)ū萐YBR Green Ⅰ方法具有更強(qiáng)特異性和靈敏度，與分子信標(biāo)探針?lè)ū容^具有操作簡(jiǎn)便、成功率高等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究以衣原體蛋白酶樣活性因子(Chlamydial protein-like activity factor, CPAF)的基因組序列為靶基因設(shè)計(jì)針對(duì)流產(chǎn)衣原體的引物及TaqMan探針，旨在建立一種快速、特異的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，為流產(chǎn)衣原體的早期診斷提供可靠方法。

1 材料與方法

1.1 菌株及基因組 流產(chǎn)衣原體GN6菌株、沙眼衣原體基因組、大腸桿菌基因組、沙門氏菌基因組均在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所畜禽重要人獸共患病團(tuán)隊(duì)細(xì)菌病組保存。布魯氏菌基因組由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所草食動(dòng)物細(xì)菌病團(tuán)隊(duì)提供。剛地弓形蟲(chóng)基因組由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所畜禽重要人獸共患病團(tuán)隊(duì)寄生蟲(chóng)組提供。

1.2 主要試劑 2×Premix Ex TaqTM、pMD19-T載體、感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。質(zhì)粒小提試劑盒、小提膠回收試劑盒購(gòu)自杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司。DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。QuantiNova Probe PCR Kit購(gòu)自深圳凱杰生物工程有限公司。

1.3 引物探針的設(shè)計(jì) 比對(duì)了GenBank中不同衣原體種CPAF的編碼基因序列，包括ChlamydiaabortusLLG(GenBank NZ_CP018296.1)、Chlamydiamuridarumstr.Nigg(GenBank NC_002620.2)、Chlamydiapsittaci6BC(GenBank NC_017287.1)、ChlamydiapneumoniaeTW-183(GenBank NC_005043.1)、ChlamydiapecorumPV3056/3(GenBank NC_022439.1)、Chlamydiasuis(GenBank NZ_LS398098.1)，設(shè)計(jì)多對(duì)針對(duì)流產(chǎn)衣原體CPAF的基因引物及TaqMan探針。

1.4 引物探針的篩選 以布魯氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、弓形蟲(chóng)及沙眼衣原體的基因組作為模板，以流產(chǎn)衣原體基因組為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O為空白對(duì)照進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)，對(duì)初步設(shè)計(jì)的多對(duì)引物探針進(jìn)行特異性篩選。

1.5 DNA的提取 本試驗(yàn)菌株DNA的提取參考北京天根生化科技有限公司的DNA提取試劑盒步驟操作。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建 以篩選出的引物作為擴(kuò)增引物，以流產(chǎn)衣原體GN6菌株的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物膠回收后克隆到pMD19-T載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB Amp平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆，LB培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定并送至西安擎科生物科技有限公司測(cè)序，提取陽(yáng)性菌液的質(zhì)粒。利用分光光度計(jì)測(cè)定陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD19T-CPAF的濃度并換算拷貝數(shù)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的優(yōu)化 采用矩陣法對(duì)引物濃度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 μmol/L)、探針濃度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 μmol/L)和退火溫度(55 ℃～65 ℃)分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，最終篩選出最佳引物探針濃度及退火溫度。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以10倍倍比稀釋后的重組質(zhì)粒pMD19T-CPAF為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，構(gòu)建該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.9 特異性試驗(yàn) 以布魯氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、弓形蟲(chóng)、沙眼衣原體基因組為模板，流產(chǎn)衣原體的基因組為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)立空白對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。

1.10 靈敏度試驗(yàn) 以稀釋后的重組質(zhì)粒為模板，設(shè)立空白對(duì)照，分別進(jìn)行普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)，得到兩種方法可以檢出重組質(zhì)粒的最低拷貝數(shù)。

1.11 重復(fù)性試驗(yàn) 以濃度為2.6×107～2.6×104copies/μL的重組質(zhì)粒作為模板，作3個(gè)平行對(duì)照，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，再重復(fù)3次組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算不同梯度的Ct平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)(%)，評(píng)估組內(nèi)及組間差異。

1.12 臨床樣本檢測(cè) 從甘肅省某流產(chǎn)綿羊飼養(yǎng)場(chǎng)采集生殖道拭子共156份。為了鑒定導(dǎo)致該羊場(chǎng)流產(chǎn)的病原體，分別對(duì)采集的樣本進(jìn)行流產(chǎn)衣原體、布魯氏菌、貝納柯克斯體(Coxiellaburneti)、Waddliachondrophila、李斯特氏菌(Listeriamono￣cytogenes)及弓形蟲(chóng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。合成Waddliachondrophila、李斯特氏菌[11]及貝納柯克斯體[12]的特異性引物及探針，弓形蟲(chóng)、布魯氏菌引物及探針由本實(shí)驗(yàn)室保存。使用本研究建立的方法和OIE參考推薦的方法分別檢測(cè)該批臨床樣本，通過(guò)統(tǒng)計(jì)流產(chǎn)衣原體的檢出率，比較兩種方法的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針的設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)了8對(duì)針對(duì)流產(chǎn)衣原體CPAF基因的特異性引物及探針(表1)。

2.2 引物探針的篩選 篩選結(jié)果顯示，只有Cab-CPAF8引物探針與其它病原物無(wú)交叉反應(yīng)，證明其特異性良好(表2)。

2.3 重組質(zhì)粒pMD19T-CPAF的鑒定 重組質(zhì)粒pMD19T-CPAF經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后使用瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果并拍照。pMD19T-CPAF片段大小約為113 bp(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相同，菌液送西安擎科生物科技有限公司測(cè)序，結(jié)果顯示目的基因成功插入重組質(zhì)粒。大量提取陽(yáng)性質(zhì)粒，在紫外分光光度計(jì)下測(cè)定其濃度為79 ng/μL，拷貝數(shù)為2.6×1010copies/μL。

表1 Cab-CPAF1～Cab-CPAF8引物探針序列Tab 1 Sequences of Cab-CPAF1～Cab-CPAF8 primers and probes

表2 Cab-CPAF8引物和探針的序列Tab 2 Sequence of Cab-CPAF8 primers and probe

M：DL2000 Marker；1：pMD19T-CPAF擴(kuò)增產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照M: DL2000 Marker; 1: Amplification of pMD19T-CPAF; 2: Negative control圖1 重組質(zhì)粒pMD19T-CPAF PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig 1 The result of pMD19T-CPAF by PCR

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及優(yōu)化 經(jīng)過(guò)優(yōu)化，最終確定反應(yīng)體系：2×Premix Ex Taq 10 μL，Cab-F 0.5 μL，Cab-R 0.5 μL，Cab-P 0.5 μL，DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性；95 ℃變性 10 s，57 ℃退火 10 s，44個(gè)循環(huán)。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 當(dāng)重組質(zhì)粒濃度在2.6×107～2.6×102copies/μL時(shí)，其標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值(x)與Cq值(y)存在良好的線性關(guān)系，線性方程y=-3.209x+40.773，R2=0.995，擴(kuò)增效率E=105%(圖2)。

2.6 特異性試驗(yàn) 結(jié)果顯示，除流產(chǎn)衣原體的基因組DNA有特異性擴(kuò)增外，其他菌株基因組DNA均未檢測(cè)到(圖3)，表明該方法特異性良好。

2.7 靈敏度試驗(yàn) 普通PCR可檢出重組質(zhì)粒最低濃度為2.6×102copies/μL(圖4)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可檢出最低濃度為2.6×101copies/μL(圖5)，靈敏度是普通PCR的10倍。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 組內(nèi)變異系數(shù)為0.199%、0.445%、0.634%和0.969%，組間變異系數(shù)為1.45%、1.8%、2.33%和2.62%，均小于3%，證明本方法具有良好的重復(fù)性(表3和圖6)。

2.9 臨床樣本檢測(cè) 表4結(jié)果顯示，該羊場(chǎng)大部分綿羊流產(chǎn)是由于流產(chǎn)衣原體和貝納柯克斯體混合感染導(dǎo)致；通過(guò)本次156份臨床樣本檢測(cè)比較了本研究建立方法和OIE參考推薦方法的靈敏度，兩種方法檢出的流產(chǎn)衣原體總陽(yáng)性率分別為78.21%和73.72%，表明本研究建立的方法靈敏度更高。

圖2 流產(chǎn)衣原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 Standard curve of real-time fluorescence quantitative PCR for C.abortus

1：陽(yáng)性對(duì)照；2～6：布魯氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、沙眼衣原體、弓形蟲(chóng)；7：陰性對(duì)照1: Positive control; 2～6: Brucella, Escherichia coli, salmonella, Chlamydia trachomatis,Toxoplasma gondii; 7: Negative control圖3 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig 3 The result of the specificity assay

M：DL2000 Marker；1～8：濃度為2.6×108～2.6×101 copies/μL的陽(yáng)性重組質(zhì)粒；9：陰性對(duì)照M: DL2000 Marker; 1～8: The positive recombinant plasmid at 2.6×108～2.6×101 copies/μL;9: Negative control圖4 普通PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Fig 4 Sensitivity result of PCR

1～7：2.6×107～2.6×101copies/μL陽(yáng)性重組質(zhì)粒1～7: The positive recombinant plasmid at 2.6×107～2.6×101 copies/μL圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Fig 5 Sensitivity result of real-time fluorescence quantitative PCR

1:第一次試驗(yàn)；2：第二次實(shí)驗(yàn)；3：第三次實(shí)驗(yàn)1: First test; 2: Second test; 3: Third test圖6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig 6 The result of the repeated test

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Intra-group and inter-group reproducibility test results of real-time fluorescence quantitative PCR

表4 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果Tab 4 Results of clinical sample test

3 討論與結(jié)論

隨著流產(chǎn)衣原體的流行范圍不斷擴(kuò)大，其對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展的危害愈發(fā)嚴(yán)重，已經(jīng)引起了獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注。近些年的研究顯示，流產(chǎn)衣原體可感染的宿主越來(lái)越廣泛，不僅可以感染牛、羊等陸地上的反芻動(dòng)物，而且還會(huì)感染海洋中的哺乳動(dòng)物，一項(xiàng)研究報(bào)告指出，地中海擱淺的斑紋海豚中通過(guò)PCR僅檢測(cè)到流產(chǎn)衣原體，可能是斑紋海豚擱淺和死亡的原因，這是首次在海洋哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)衣原體的病例[13]。受感染的動(dòng)物可能會(huì)成為感染源而感染人類，導(dǎo)致患者全身感染或流產(chǎn)[14]。

目前，流產(chǎn)衣原體病的防控主要采用疫苗接種防治，但最近研究表明流產(chǎn)衣原體1B型疫苗未能對(duì)流產(chǎn)衣原體感染動(dòng)物產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，反而可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物流產(chǎn)[15]。流產(chǎn)衣原體病的防控不僅需要疫苗的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，也需要早期的及時(shí)診斷，其嚴(yán)重程度也離不開(kāi)流行病學(xué)的調(diào)查。我國(guó)針對(duì)流產(chǎn)衣原體病的檢測(cè)技術(shù)主要依靠IHA，但該方法檢測(cè)結(jié)果需要通過(guò)肉眼判定，存在人為主觀性，并且敏感性較低，同時(shí)，針對(duì)流產(chǎn)衣原體主要外膜蛋白的套式PCR技術(shù)雖然簡(jiǎn)便、快速，但是特異性及靈敏度不高，易產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的診斷技術(shù)，可以快速且準(zhǔn)確定量樣本中的病原體數(shù)量，無(wú)需電泳步驟，大大提高了檢測(cè)效率。

本研究通過(guò)對(duì)某羊場(chǎng)流產(chǎn)原因的檢測(cè)分析，比較了本研究建立的方法與OIE參考推薦方法的靈敏度，結(jié)果顯示，本研究建立的方法靈敏度要高于OIE參考推薦的方法，表明了該方法不僅適用于臨床樣品的大規(guī)模檢測(cè)且具有較高的靈敏度。

綜上，本研究基于CPAF基因序列，設(shè)計(jì)了一組針對(duì)流產(chǎn)衣原體的特異性引物探針，通過(guò)優(yōu)化該方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立了一種操作簡(jiǎn)便且具有良好的靈敏度、特異性和重復(fù)性的流產(chǎn)衣原體TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷方法。該方法具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，為流產(chǎn)衣原體病的流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)手段，為流產(chǎn)衣原體病的防控奠定了基礎(chǔ)。