菅立群 張翼飛 ，2 楊克軍 ，3 王玉鳳 ，2 陳天宇 張繼衛(wèi) 張津松 李 慶 劉天昊 肖珊珊 彭 程 王寶生

（1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，163319，黑龍江大慶；2黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，163319，黑龍江大慶；3北大荒現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)省級培育協(xié)同創(chuàng)新中心，163319，黑龍江大慶；4黑龍江省七星泡農(nóng)場，161435，黑龍江黑河；5黑龍江省鶴山農(nóng)場，161443，黑龍江黑河）

東北地區(qū)是我國最大的玉米產(chǎn)區(qū)，在國家糧食安全保障戰(zhàn)略中占有重要地位。在未來氣候變暖背景下，雖然東北地區(qū)熱量條件總體上有利于玉米生產(chǎn)，但低溫冷害仍是影響東北地區(qū)特別是黑龍江和吉林北部玉米生產(chǎn)最重要的農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害之一[1-2]，且以生育早期（播種－七葉）和生育后期（乳熟－成熟）為主要發(fā)生階段[3-4]，現(xiàn)已成為寒地玉米全程機(jī)械化高效生產(chǎn)的關(guān)鍵瓶頸之一，制約著區(qū)域玉米產(chǎn)業(yè)持續(xù)增效與可持續(xù)發(fā)展。

已有大量研究表明，播種至萌發(fā)期低溫冷害會引起玉米種子內(nèi)各種淀粉分解酶活性下降，導(dǎo)致種子發(fā)芽率顯著降低、出苗時間延遲、出苗率下降，不利于高產(chǎn)群體的建成[5]，且幼苗生長活力及葉片光合作用性能隨之減弱[6-7]。同時，在玉米苗期，低溫脅迫會抑制植株生長發(fā)育進(jìn)程，影響生物量積累與分配發(fā)生變化，且幼苗素質(zhì)明顯下降[8-9]。此外，遭遇低溫冷害后，玉米植株可通過改變體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，促進(jìn)細(xì)胞液濃度提高與降低滲透勢，緩解細(xì)胞因失水過多造成的損傷[10]。

玉米播種后的田間溫度環(huán)境是動態(tài)變化的，而針對低溫冷害對玉米萌發(fā)與幼苗生長影響的報(bào)道大多是在恒定的適宜溫度條件下開展的，難以準(zhǔn)確解析玉米幼苗生長及群體建成對田間階段性低溫冷害的響應(yīng)機(jī)制。鑒于此，本研究基于寒地典型玉米種植生態(tài)區(qū)的氣象條件，在播種至苗期分階段進(jìn)行人工模擬低溫脅迫環(huán)境，通過探討玉米出苗進(jìn)程、主要農(nóng)藝性狀及相關(guān)抗性生理指標(biāo)的變化差異，明確播種至苗期階段性低溫和低溫持續(xù)時間對玉米幼苗建成的影響規(guī)律，為不斷創(chuàng)新寒地玉米全程機(jī)械化豐產(chǎn)增效關(guān)鍵技術(shù)、改善農(nóng)田管理措施及防災(zāi)避災(zāi)能力、科學(xué)合理應(yīng)對氣候變化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試玉米品種為先玉335（由鐵嶺先鋒種子研究有限公司選育），供試土壤取自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)試驗(yàn)實(shí)習(xí)基地（大慶）農(nóng)田0～20cm耕層，土壤類型為草甸土，基本理化性質(zhì)為：堿解氮104.46mg/kg，速效磷11.47mg/kg，速效鉀113.73mg/kg，有機(jī)質(zhì)26.59g/kg，pH值8.06。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年在黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，選取長勢飽滿、大小均勻一致的玉米種子，播于裝有1 600g風(fēng)干土的PVC培養(yǎng)缽（長×寬×高：13.5cm×13.5cm×12.0cm）中，每缽播種16粒，播深4cm。播后采用稱重法進(jìn)行統(tǒng)一均勻灌溉，然后置于溫度（-10～45）±0.5℃、濕度（10%～95%）±3%、光量子密度450μmol/(m2·s)的人工氣候箱中進(jìn)行低溫模擬試驗(yàn)。根據(jù)黑龍江省典型玉米種植生態(tài)區(qū)2008-2017年的氣象資料數(shù)據(jù)所擬合的春季耕層0～5cm土壤溫度日變化趨勢（圖1），動態(tài)模擬播后至苗期玉米生長溫度環(huán)境，采用二因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，分別設(shè)置低溫處理階段和低溫持續(xù)時間處理。低溫處理階段設(shè)置播后第 1～5（P1）、6～10（P2）、11～15（P3）、16～20（P4）、21～25（P5）、26～30（P6）天 6個階段，低溫持續(xù)時間分別設(shè)置4℃低溫處理0（D0）、1（D1）、2（D2）、3（D3）、4（D4）、5d（D5）6個水平，以0d（常規(guī)溫度）培養(yǎng)為對照（D0），總計(jì)31個處理組合，且均為4次重復(fù)，每個培養(yǎng)缽作為1次重復(fù)。試驗(yàn)過程中，控制人工氣候箱濕度為（60±5）%，光照強(qiáng)度為 450μmol/(m2·s)，光照時間為12h/d，每隔1d進(jìn)行統(tǒng)一補(bǔ)水。播種后，每天記錄各處理組合幼苗的破土和出苗情況，于播后第35天選取各培養(yǎng)缽具代表性植株6株，檢測功能葉片葉綠素含量與葉綠素?zé)晒鈪?shù)，并對幼苗形態(tài)和抗性生理指標(biāo)進(jìn)行測定。

圖1 春季日平均地溫變化趨勢及溫度人工模擬條件Fig.1 Variation trend for the daily average ground temperature in spring and the artificial simulated conditions of temperature

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 出苗進(jìn)程的觀察 自播種之日起每天觀察、記錄破土及出苗數(shù)，以幼苗出土2cm為出苗標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)出苗數(shù)量穩(wěn)定時所經(jīng)歷的天數(shù)，出苗速率=1/出苗持續(xù)天數(shù)[11]。以出苗后能繼續(xù)生長，并且在播種后35d仍存活的幼苗定義為成苗，成苗率=成苗數(shù)/播種數(shù)×100%[12]。

1.3.2 葉片葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定選定玉米幼苗最新完全展開功能葉片，將葉片暗適應(yīng)30min后，利用葉綠素脈沖制熒光分析儀OS-30p（Opti-Sciences，美國）分別測定葉片上、中、下3部分的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，分別讀取初始熒光Fo，待Fo穩(wěn)定后照射飽和脈沖光，獲得最大熒光Fm，并計(jì)算最大光化學(xué)效率（Fv/Fm），F(xiàn)v/Fm=（Fm-Fo）/Fm；于相同位置利用葉綠素儀SPAD-502 Plus（Konica Minolta Sensing，日本）同步測定相對葉綠素含量（SPAD值），最后取平均值[13]。

1.3.3 幼苗形態(tài)指標(biāo)的測定 首先使用自來水將幼苗根部土壤緩慢沖洗干凈，用吸水紙吸干表面水分，然后使用直尺測量具代表性植株的株高、初生胚根長、胚芽鞘長度、葉片長度和寬度，用游標(biāo)卡尺測量莖基部直徑；采用長寬系數(shù)法（長×寬×0.75）計(jì)算葉面積[14]。

1.3.4 植株鮮重、干重及貯藏物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)率的測定將取樣的植株分成地上部、地下部和殘留種子3部分，使用Presica LS120A萬分之一天平分別稱量鮮重后，置于牛皮紙袋中于105℃殺青30min，然后置于80℃下烘干至恒重后稱重，并計(jì)算貯藏物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)率，貯藏物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)率=幼苗干重/（幼苗干重+殘留種子干重）×100%[15]。

1.3.5 抗性生理指標(biāo)的測定 參照李合生[16]的方法，用0.05mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.8）研磨提取，采用硫代巴比妥酸顯色法測定葉片中丙二醛含量；采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量，在630nm波長下測定樣品的吸光度，利用蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算可溶性糖的含量；用3%的磺基水楊酸提取，酸性茚三酮顯色后加入甲苯萃取，采用分光光度法測定脯氨酸含量[17]；采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定可溶性蛋白含量，在595nm下比色測定吸光值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量mg/(g FW)[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，通過Duncan多重比較和t檢驗(yàn)分析不同處理的影響差異，利用多因素方差分析因素間的交互效應(yīng)，運(yùn)用Microsoft Excel 2003及Origin 2018繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 播后不同階段低溫與低溫處理時間對玉米出苗進(jìn)程的影響

2.1.1 出苗速率 隨著播后不同階段低溫處理時間的延長，玉米的出苗速率逐漸下降，且各階段均在D5處理下達(dá)最低值（圖2）。從表1可以看出，低溫處理階段、低溫持續(xù)時間單因素對出苗速率的影響均達(dá)極顯著水平，但二者的交互效應(yīng)并不明顯，其中P4和P5處理下的出苗速率分別較P1、P2、P3和P6下降了5.01%～13.13%、2.73%～11.04%，D0、D1和D2處理下的出苗速率分別較D4和D5高出15.06%和15.88%、7.29%和8.06%、4.94%和5.69%，且均達(dá)顯著水平。從不同處理組合來看，P4D5處理的出苗速率最低，為0.038，除了與P2D5（0.0409）、P3D5（0.0418）、P4D2（0.0418）、P4D3（0.0400）、P4D4（0.0387）以及 P5D2（0.0418）、P5D3（0.0413）、P5D4（0.0396）、P5D5（0.0396）處理差異不明顯以外，較其他處理顯著降低了11.24%～22.34%。

圖2 各階段不同低溫持續(xù)時間對玉米出苗速率的影響Fig.2 Effects of different low temperature durations at different stages on seedling emergence rate of maize

表1 不同階段低溫處理、低溫持續(xù)時間對玉米幼苗出苗速率和成苗率的交互效應(yīng)Table 1 Interactive effects of low temperature treatment phases and durations on maize seedling emergence rate and survival rate

2.1.2 成苗率 如圖3所示，玉米成苗率僅在P3D5、P4D3、P4D4、P4D5和P5D5處理明顯低于對照處理，其他處理組合間無明顯差異。從播后不同階段低溫處理、低溫持續(xù)時間單因素影響方面來看，低溫持續(xù)時間對玉米成苗率影響達(dá)極顯著水平，隨著低溫持續(xù)天數(shù)的增加，玉米成苗率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，D4和D5分別較D0、D1和D2處理明顯降低了5.35%～10.06%和8.34%～12.91%（表1）。

圖3 各階段不同低溫持續(xù)時間對玉米成苗率的影響Fig.3 Effects of different low temperature durations at different stages on seedling survival rate of maize

2.2 播后不同階段低溫與低溫處理時間對玉米幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

如表2所示，低溫處理階段及低溫處理時間單因素對玉米幼苗株高、莖基部直徑、葉面積、胚芽鞘長和初生胚根長的影響均達(dá)顯著（P＜0.05）或極顯著水平（P＜0.01）。P1和P2階段隨著低溫處理天數(shù)的增加，幼苗株高、莖基部直徑變化幅度較小，而在P3～P6階段，株高和莖基部直徑總體上明顯受低溫處理影響，以P4D5處理的株高和莖基部直徑最小，比對照處理分別下降了26.89%和19.54%。同時，相比于對照處理，P1～P6階段低溫處理后的幼苗葉面積和初生胚根長均有所減小，葉面積降幅分別為12.40%～28.11%、17.69%～29.10%、18.94%～29.14%、31.96%～48.07%、22.57%～39.56%和16.29%～34.31%，初生胚根長降幅分別為10.73%～31.35%、18.37%～30.01%、18.65%～37.59%、26.86%～42.15%、21.32%～37.31%和23.07%～38.36%，且均達(dá)顯著水平；而胚芽鞘長僅在P3D5、P4D3、P4D4和P4D5處理組合下有明顯的增長趨勢。從兩因素互作方面來看，低溫處理階段與低溫處理時間僅對幼苗葉面積大小具有極顯著的交互效應(yīng)。

表2 不同階段低溫處理和低溫持續(xù)時間對玉米幼苗形態(tài)指標(biāo)及生物量積累的影響Table 2 Effects of low temperature treatment phases and durations on morphological parameters and biomass accumulations of maize seedlings

2.3 播后不同階段低溫與低溫處理時間對玉米幼苗生物量的影響

低溫處理階段、低溫處理時間單因素對玉米幼苗植株鮮重和貯藏物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率的影響達(dá)極顯著水平（P＜0.01），植株干重僅受低溫處理時間的顯著影響（P＜0.05）（表2）。盡管播后不同階段植株鮮重、干重和貯藏物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率總體表現(xiàn)為D0＞D1＞D2＞D3＞D4＞D5，但各階段不同低溫處理時間的影響程度存在差異，其中植株鮮重在P2階段D4～D5處理、P3階段D3～D5處理、P4階段D2～D5處理、P5階段D3～D5處理、P6階段D4～D5處理比對照處理分別顯著（P＜0.05）降低了0.291～0.316、0.271～0.349、0.420～0.680、0.296～0.547和 0.322～0.354g，植株干重分別顯著降低了0.042～0.056g、0.034～0.041g、0.039～0.078g、0.040～0.064g 和0.044～0.049g；此外，種子貯藏物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率以P4D5處理最低，除與P4D3、P4D4、P5D4和P5D5差異不明顯外，顯著低于其他處理19.88%～33.72%。

2.4 播后不同階段低溫與低溫處理時間對葉片相對葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

從圖4和表3可以看出，低溫處理階段及低溫持續(xù)時間單因素對玉米幼苗葉片SPAD值和Fv/Fm均具有極顯著（P＜0.01）影響，且低溫處理階段與低溫持續(xù)時間處理對葉片SPAD值的影響存在顯著（P＜0.05）的交互效應(yīng)。隨著低溫處理時間的延長，葉片SPAD值和Fv/Fm表現(xiàn)為逐漸下降的趨勢，而低溫處理階段單因素影響總體表現(xiàn)為P1＞P2＞P3＞P6＞P5＞P4，其中在P1和P2階段D3～D5處理、P3階段D2～D5處理下葉片SPAD值明顯低于對照處理，而P4～P6階段各低溫持續(xù)時間處理均顯著下降，其中P4D4和P4D5處理組合的SPAD值相對較低，分別為26.79和25.79。而在P4～P6階段低溫處理影響下的Fv/Fm降幅為4.17%～6.65%。

圖4 不同階段低溫處理及低溫持續(xù)時間條件下葉片葉綠素含量及最大光化學(xué)效率Fig.4 Leaf chlorophyll content and maximum photochemical efficiency of maize seedlings effected by low temperature with different phases and various durations

2.5 播后不同階段低溫與低溫處理時間對玉米幼苗抗性生理指標(biāo)的影響

隨著玉米播后至苗期低溫處理階段的推遲，以及低溫持續(xù)時間的延長，葉片可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量呈逐漸增加趨勢（圖5），且可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量均受低溫處理階段、低溫處理天數(shù)單因素的極顯著（P＜0.01）影響，同時兩因素的互作效應(yīng)亦達(dá)極顯著水平（表3）。其中，葉片可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量在D5處理時達(dá)到峰值，分別較D0處理高57.99%、149.44%、65.32%和62.97%；低溫處理階段單因素的影響總體表現(xiàn)為P4＞P5＞P6＞P3＞P2＞P1，P4和 P5階段的葉片可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量較其他處理分別增加了0.17～0.47mg/g、0.02～0.31mg/g、0.36～5.61μg/g 和 0.21～1.10μmol/g，且均達(dá)顯著水平。

3 討論

東北地區(qū)，特別是黑龍江省玉米生產(chǎn)中常發(fā)生春季低溫冷害，影響玉米高產(chǎn)群體建成和產(chǎn)量穩(wěn)步提升。玉米種子的萌發(fā)不僅需要足夠的水分和充足的氧氣環(huán)境，適宜的溫度條件也至關(guān)重要。低溫逆境除了抑制玉米種子的萌發(fā)進(jìn)程，還會影響出苗整齊度，降低成苗率[19]。本試驗(yàn)中，P1階段1～4d的低溫處理對出苗速率影響不顯著，說明在種子物理吸漲過程中遇到低溫逆境對玉米出苗速率影響較小，但在破土前后的P3和P4階段，低溫對出苗速率的影響非常明顯，而P6階段由于已完成出苗，出苗速率未受到低溫處理的影響。同時，本試驗(yàn)中玉米成苗率主要隨低溫持續(xù)時間的增加呈顯著下降趨勢，且僅在P3～P4階段經(jīng)歷長時間（3～5d）的持續(xù)低溫處理后成苗率顯著降低，這可能是由于長期低溫處理導(dǎo)致植物體內(nèi)能量的虧缺導(dǎo)致植株的死亡[20]，同時張海艷[21]研究發(fā)現(xiàn)植株地上部比地下部對溫度響應(yīng)更為敏感，嚴(yán)重抑制了破土至出苗臨界期玉米胚根和胚芽的快速生長，甚至導(dǎo)致植株生長停滯和死亡。此外，隨著玉米幼苗生育進(jìn)程的推進(jìn)，盡管P5和P6階段耐冷性有所提高，但在長時間持續(xù)低溫條件下成苗率也會有小幅度下降的趨勢。

表3 不同階段低溫、低溫持續(xù)天數(shù)對玉米幼苗光合作用與抗性生理特性的交互效應(yīng)Table 3 Interactive effects of low temperature treatment phases and durations on characteristics of maize seedling leaf photosynthesis and physiological indexes for resistance

圖5 不同階段低溫處理及低溫持續(xù)時間條件下葉片抗性生理指標(biāo)的變化Fig.5 Changes of leaf physiological indexes for resistance effected by low temperature with different phases and various durations

已有研究表明，低溫脅迫后玉米幼苗生長將受到明顯抑制，初生胚根長、株高、莖基部直徑、地上部鮮重、根系鮮重及葉面積出現(xiàn)明顯的下降趨勢[22]，胚芽鞘的相對生長率也顯著高于正常生長植株[23]。本研究結(jié)果表明，播后各階段隨著低溫處理時間的延遲，玉米幼苗的株高、莖基部直徑、葉面積、初生胚根長、生物量積累呈逐漸降低趨勢，相對而言，以P3～P6階段受低溫處理的影響較為明顯；盡管胚芽鞘長隨低溫持續(xù)時間的增加呈逐漸增長趨勢，但僅在P3D5、P4D3、P4D4和P4D5處理組合下影響達(dá)顯著水平。劉禹辰等[24]認(rèn)為種子萌發(fā)的過程是淀粉等貯藏物質(zhì)水解為小分子物質(zhì)的過程，水通過促進(jìn)種子吸脹，引起種子內(nèi)各種酶活性增強(qiáng)，降解種子貯藏物質(zhì)，促進(jìn)種子萌發(fā)。本研究中，相比于對照處理，P2和P3階段4～5d、P4階段2～5d、P5階段3～5d和P6階段5d的低溫處理明顯抑制了貯藏物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率，這可能是持續(xù)低溫影響種子呼吸代謝途徑及幼苗碳源與能量供應(yīng)的結(jié)果[25]。

植物細(xì)胞中可溶性蛋白、脯氨酸以及可溶性糖是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對維持細(xì)胞膨壓、緩解低溫脅迫對細(xì)胞造成的損傷具有重要作用[26]，而丙二醛是植物在逆境脅迫下膜脂過氧化的分解產(chǎn)物，其含量的高低可以有效反映細(xì)胞受傷害的程度[27]。Hendrickson等[28]和田禮欣等[29]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫可降低光合色素的合成速率，加速葉綠素的降解，引起膜脂過氧化，抑制光能的吸收與傳遞，最終致使光合速率降低。本試驗(yàn)條件下，隨低溫持續(xù)時間的延長，幼苗葉片可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸與丙二醛含量在各階段均呈增加趨勢，而SPAD值和Fv/Fm逐漸降低；隨著低溫處理階段的延后，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與丙二醛含量呈先增加后下降的趨勢，而SPAD值和Fv/Fm呈先降低后升高趨勢，分別在P4階段達(dá)極值，這進(jìn)一步說明，盡管播種后至苗期各階段的低溫處理均會引起幼苗光合作用效率及抗性生理特征的響應(yīng)，但這種低溫脅迫的影響程度因低溫處理時期的不同而有所差異，以P3～P5階段受到影響較為明顯，特別是長時間持續(xù)低溫將對植株造成一系列不可逆的生理損傷，從而引起成苗率的顯著下降。

4 結(jié)論

播種后至苗期不同階段的低溫脅迫，可不同程度地延長玉米出苗時間，降低成苗率，抑制玉米幼苗的生長及生物量積累，引起玉米幼苗葉片SPAD值和Fv/Fm的降低，進(jìn)而引進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增加與膜脂過氧化程度的加劇，促使幼苗素質(zhì)降低，弱苗比例增加，難以構(gòu)建高產(chǎn)群體；這些不利影響的程度隨低溫持續(xù)時間的延長而不斷加劇，且以播種后11～25d，特別是16～20d，即處于破土至出苗臨界期的玉米植株對低溫脅迫最為敏感。