寧亞維，付浴男，何建卓，蘇 丹，侯琳琳，王志新，賈英民*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048)

單核細(xì)胞增生李斯特菌是一種革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，廣泛存在于熟食肉類、軟奶酪、牛奶和其他乳制品中[1]，能引發(fā)食源性疾病，包括敗血癥、流產(chǎn)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙和胃腸炎等[2]。例如在美國(guó)，單核細(xì)胞增生李斯特菌每年導(dǎo)致約1 600 例疾病[3]；僅2015年歐洲28 個(gè)成員國(guó)由單核細(xì)胞增生李斯特菌導(dǎo)致的疾病就有2 206 例[4]。此外，單核細(xì)胞增生李斯特菌能夠在食品加工環(huán)境如冷藏、高鹽、高pH值環(huán)境中長(zhǎng)期存在[5-7]，甚至黏附在食品加工設(shè)備的表面，形成難以去除的生物膜[8]。因此，有必要研究抑制食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長(zhǎng)以提高食品的安全性。

苯乳酸是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型抑菌物質(zhì)[9]，具有廣譜抑菌活性，不僅對(duì)金黃色葡萄球菌[10]、腸道沙門氏菌[11]、埃希氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌[12]等多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有抑制作用，對(duì)青霉、黑曲霉、黃曲霉等真菌以及滑念珠菌、膠紅酵母等酵母同樣有良好的抑制作用[13-14]。此外，苯乳酸對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物無(wú)毒[15-16]。因此，苯乳酸具有較高的應(yīng)用潛力。

苯乳酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌具有較好的抑菌特性，其相關(guān)抑菌特性研究主要針對(duì)苯乳酸單獨(dú)使用的抑菌機(jī)理。Dieuleveux等[10,17]率先報(bào)道了苯乳酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌活性，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁為苯乳酸的抑菌靶位；本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)苯乳酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的細(xì)胞膜和DNA均產(chǎn)生破壞作用[12]；Sorrentino等[18]發(fā)現(xiàn)苯乳酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌靶位主要在細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)膜中，從而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破裂。本課題組前期通過(guò)研究苯乳酸與防腐劑聯(lián)用的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)苯乳酸與苯甲酸鈉、山梨酸鉀等常用防腐劑聯(lián)用對(duì)大腸桿菌具有協(xié)同抑菌效應(yīng)，然而其與苯甲酸鈉、山梨酸鉀、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、乳酸鏈球菌素、聚賴氨酸等多種防腐劑聯(lián)用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌均不產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)[19]。后續(xù)本課題組經(jīng)過(guò)擴(kuò)大聯(lián)合抑菌劑篩選范圍，發(fā)現(xiàn)醋酸與苯乳酸聯(lián)用可以增強(qiáng)其抑菌活性，該發(fā)現(xiàn)與Rodríguez等[11]報(bào)道的苯乳酸與有機(jī)酸共存時(shí)能增強(qiáng)其抑菌活性的結(jié)果一致。然而具體的聯(lián)合抑菌效應(yīng)及機(jī)制尚鮮有報(bào)道。由于醋酸來(lái)源廣泛、經(jīng)濟(jì)易得，不僅可以作為酸度調(diào)節(jié)劑使用，還可作為防腐劑添加到食品中，在食品體系中具有較好的應(yīng)用價(jià)值。因此，本研究考察了苯乳酸和醋酸聯(lián)用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌機(jī)制，以期為苯乳酸在食品防腐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

單核細(xì)胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes10403S由河北科技大學(xué)食品與生物技術(shù)安全實(shí)驗(yàn)室保藏；苯乳酸、DiSC3(5) 美國(guó)Sigma公司；LIVE/DEAD試劑盒美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Minibest細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 日本Takara公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000-FL 220熒光分光光度計(jì)、S-4800-I掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；Accuri C6 plus流式細(xì)胞儀 美國(guó)Becton Dickinson公司；BX53熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會(huì)社；Evolution 220紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Gel DocTMXR＋凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度及聯(lián)合抑菌指數(shù)的測(cè)定

苯乳酸和醋酸的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）使用肉湯微量二倍稀釋法測(cè)定。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的單核細(xì)胞增生李斯特菌，調(diào)整細(xì)菌濃度為1×106CFU/mL備用。在96 孔板第一列分別加入20 mg/mL的苯乳酸和醋酸，再用營(yíng)養(yǎng)肉湯在第2～10列進(jìn)行系列梯度稀釋。然后在每個(gè)孔注入100 μL的菌液。第11列不加抑菌劑，只加100 μL營(yíng)養(yǎng)肉湯及100 μL菌液，第12列只加200 μL 營(yíng)養(yǎng)肉湯作陰性對(duì)照。之后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，以細(xì)菌被抑制的最低抑菌劑濃度作為MIC。

根據(jù)Fratini等[20]的方法測(cè)定苯乳酸與醋酸部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）。制備質(zhì)量濃度范圍為1/8～4 MIC的苯乳酸和醋酸二倍稀釋菌液備用。然后，將100 μL的苯乳酸以水平方向添加到96 孔板中，并將相同量的醋酸以垂直方向添加到96 孔板中。最后將每孔含有不同質(zhì)量濃度的試劑與100 μL細(xì)菌培養(yǎng)液（106CFU/mL）混合，并在37 ℃下培養(yǎng)24 h。按下式計(jì)算FICI。

1.3.2 時(shí)間-殺菌曲線的繪制

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的單核細(xì)胞增生李斯特菌接種到新鮮營(yíng)養(yǎng)肉湯中，使其濃度為106CFU/mL，然后加入不同質(zhì)量濃度的抑菌劑，分別為1/4 MIC、MIC的苯乳酸，1/2 MIC、MIC的醋酸，以及1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸，然后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)取樣并采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)活菌數(shù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制時(shí)間-殺菌曲線。

1.3.3 單核細(xì)胞增生李斯特菌Zeta電位的測(cè)定

采用馬爾文激光粒度儀考察了苯乳酸、醋酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌Zeta電位的影響。取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的單核細(xì)胞增生李斯特菌，4 700×g離心10 min，用無(wú)菌超純水清洗重懸，調(diào)節(jié)菌體濃度至2×108CFU/mL。取1 mL菌懸液分別與1 mL不同質(zhì)量濃度抑菌劑等體積混勻，用超純水作空白對(duì)照，以pH 3的HCl溶液作陽(yáng)性對(duì)照，在37 ℃下孵育1 h后用馬爾文激光粒度分析儀進(jìn)行電位檢測(cè)。

1.3.4 單核細(xì)胞增生李斯特菌膜電位的測(cè)定

采用DiSC3(5)考察苯乳酸、醋酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌膜電位的影響。收集對(duì)數(shù)期的細(xì)菌，清洗并用5 mmol/L HEPES緩沖液（pH 7.2～7.4，含10 mmol/L葡萄糖）重懸至2×108CFU/mL。然后，將DiSC3(5)加入到細(xì)胞懸液中，使其終濃度為1 μmol/L，于30 ℃黑暗條件下溫育15 min。之后清洗、重懸，并加入KCl，使其終濃度為100 mmol/L，以平衡細(xì)胞質(zhì)和外部鉀離子濃度。最后，用等體積的抑菌劑與菌懸液于比色皿中混勻，以纈氨霉素（18 mmol/L）處理組作為陽(yáng)性對(duì)照，尼日利亞菌素（2 mmol/L）處理組作為陰性對(duì)照，在激發(fā)波長(zhǎng)650 nm、發(fā)射波長(zhǎng)672 nm條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度變化。

1.3.5 單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞膜完整性的分析

采用熒光顯微鏡考察了苯乳酸與醋酸聯(lián)用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞膜完整性的影響。收集對(duì)數(shù)期的單核細(xì)胞增生李斯特菌，清洗、重懸，調(diào)整細(xì)菌濃度為2×108CFU/mL，將等體積的菌懸液與不同濃度抑菌劑混合，未用苯乳酸和醋酸處理的樣品作為陰性對(duì)照，用體積分?jǐn)?shù)70%異丙醇溶液處理的樣品作為陽(yáng)性對(duì)照，并在37 ℃孵育60 min。然后通過(guò)離心收集細(xì)胞，清洗、重懸以除去抑菌劑，并在黑暗條件下用2 μmol/L SYTO9和12 μmol/L碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色15 min。之后清洗、重懸，菌體采用熒光顯微鏡觀察和Accuri C6 Plus流式細(xì)胞儀分析。

1.3.6 單核細(xì)胞增生李斯特菌微觀形態(tài)的觀察

采用掃描電子顯微鏡考察單核細(xì)胞增生李斯特菌外部形態(tài)的變化。將收集好的細(xì)胞用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液清洗后，在4 ℃下用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定過(guò)夜。然后用乙醇（體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、85%、90%、100%）進(jìn)行梯度脫水，每次15 min，無(wú)水乙醇脫水兩次。之后用乙酸異戊酯將乙醇置換兩次，冷凍干燥后通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.7 瓊脂糖凝膠阻滯電泳分析

采用瓊脂糖凝膠阻滯電泳考察苯乳酸和醋酸對(duì)細(xì)菌基因組DNA的影響。將單核細(xì)胞增生李斯特菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，然后用Minibest細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒按試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌基因組DNA，之后用Evolution 220紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度及純度。將純度合格（OD260nm/OD280nm＝1.98）的DNA與不同濃度的抑菌劑作用后，用1%瓊脂糖凝膠電泳考察DNA在瓊脂糖中的遷移率。電泳指示條帶在1×TAE緩沖液中遷移至整塊膠板4/5后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取其平均值，采用Origin Pro 8軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯乳酸和醋酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌活性

苯乳酸和醋酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的MIC分別為2.25、1.75 mg/mL，F(xiàn)ICI為0.5，表明苯乳酸和醋酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌具有協(xié)同效應(yīng)，同時(shí)表明醋酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌效果強(qiáng)于苯乳酸。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸聯(lián)用，并采用時(shí)間-殺菌曲線進(jìn)行抑菌性的驗(yàn)證。通過(guò)圖1中的時(shí)間-殺菌曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，用1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸處理單核細(xì)胞增生李斯特菌24 h后，菌落數(shù)分別增加了3.6（lg（CFU/mL））和2（lg（CFU/mL）），結(jié)果與空白組（增加了3.6（lg（CFU/mL）））相似。而MIC苯乳酸、MIC醋酸及二者聯(lián)用處理單核細(xì)胞增生李斯特菌后，24 h菌落數(shù)處于穩(wěn)定狀態(tài)，和初始值相比，分別下降了1.6、1.4、1.2（lg（CFU/mL））。此外，聯(lián)用組與1/4 MIC苯乳酸組相比，24 h后，其活菌數(shù)減少超過(guò)2（lg（CFU/mL）），根據(jù)Jacqueline等[21]的評(píng)估方法，1/4 MIC的苯乳酸與1/2 MIC的醋酸聯(lián)用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌呈現(xiàn)出協(xié)同抑菌效應(yīng)。多項(xiàng)報(bào)道顯示，有機(jī)酸與抑菌劑聯(lián)用可以發(fā)揮協(xié)同增效抑菌作用，如乙酸（0.10%，體積分?jǐn)?shù)）和百里酚（100 mg/L）或香芹酚（100 μL/L）聯(lián)用對(duì)鼠傷寒沙門氏菌呈現(xiàn)協(xié)同抑菌作用[22]；乳酸和抗壞血酸聯(lián)用對(duì)大腸桿菌O157:H7具有協(xié)同抑制效應(yīng)[23]。

圖1 苯乳酸、醋酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的時(shí)間-殺菌曲線Fig.1 Time-killing curve of L.monocytogenes when exposed to PLA and ACE

2.2 苯乳酸與醋酸聯(lián)用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌Zeta電位的影響

Zeta電位反映了細(xì)菌表面凈電荷分布情況，即細(xì)菌表面與周圍介質(zhì)的電位差。從圖2可以看出，未處理的細(xì)菌其Zeta電位為負(fù)值，這是由于存在羧基和磷酸鹽等陰離子基團(tuán)[24]。苯乳酸和醋酸單一處理組細(xì)胞表面的電荷發(fā)生較大的改變，電性甚至由負(fù)電變?yōu)檎?，可能是苯乳酸和醋酸電離產(chǎn)生大量的氫離子基團(tuán)導(dǎo)致電性改變。而苯乳酸和醋酸聯(lián)用組和陽(yáng)性對(duì)照組的電性表現(xiàn)結(jié)果一致，即細(xì)胞電荷發(fā)生改變，但電性仍然為陰性，說(shuō)明聯(lián)用對(duì)細(xì)胞表面電荷的影響受到苯乳酸和醋酸共同的作用但又不同于二者單獨(dú)作用。苯乳酸和醋酸及其聯(lián)用組的pH值在3.0±0.3范圍內(nèi)，但結(jié)果顯示3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組在誤差pH值范圍內(nèi)對(duì)電荷有不同的影響，說(shuō)明除了氫離子濃度（pH值）導(dǎo)致細(xì)菌表面電荷發(fā)生變化外，還可能由于苯乳酸及醋酸使菌體表面其他官能團(tuán)被電離從而導(dǎo)致細(xì)胞表面電荷發(fā)生變化而達(dá)到抑菌目的。Wang Chenjie等[25]發(fā)現(xiàn)乳酸處理單核細(xì)胞增生李斯特菌可導(dǎo)致其Zeta電位變?yōu)檩^小的負(fù)值，甚至轉(zhuǎn)變?yōu)檎?，即乳酸?huì)嚴(yán)重干擾單核細(xì)胞增生李斯特菌的表面電荷。表明苯乳酸、醋酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌表面電荷的影響與乳酸相似。此外，Young等[26]研究乙酸、乳酸和檸檬酸對(duì)單細(xì)胞增生李斯特菌生長(zhǎng)的抑制作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，等pH值的有機(jī)酸對(duì)單細(xì)胞增生李斯特菌的抑制強(qiáng)度不同，強(qiáng)度順序?yàn)橐宜幔救樗幔緳幟仕?，該研究同樣表明有機(jī)酸的抑菌活性不僅取決于pH值，還與未解離的有機(jī)酸分子特性有關(guān)。

圖2 苯乳酸、醋酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌Zeta電位的影響Fig.2 Effect of PLA and ACE on Zeta potential of L.monocytogenes

2.3 苯乳酸與醋酸聯(lián)用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌膜電位的影響

熒光探針DiSC3(5)能進(jìn)入正常細(xì)胞并自我猝滅，但如果細(xì)胞在抑菌物質(zhì)作用下發(fā)生去極化后，DiSC3(5)就會(huì)從細(xì)胞中釋放出來(lái)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的增加。由圖3可知，空白組和尼日利亞菌素處理的陰性對(duì)照組熒光強(qiáng)度幾乎一致。而用纈氨霉素處理的陽(yáng)性對(duì)照組熒光強(qiáng)度明顯增加至936.4，1/4 MIC苯乳酸、MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸、MIC醋酸及1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸聯(lián)用組處理后，熒光強(qiáng)度分別為817.1、1 643、885.4、1 588、1 458。表明苯乳酸和醋酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的跨膜電勢(shì)的消散程度隨著抑菌劑濃度的增加而增加，其中MIC苯乳酸和MIC醋酸組對(duì)膜電勢(shì)的消散作用極強(qiáng)，因?yàn)槠錈晒鈴?qiáng)度（1 643、1 588）遠(yuǎn)大于陽(yáng)性對(duì)照組（936.4），且MIC苯乳酸對(duì)膜電勢(shì)的消散作用強(qiáng)于MIC醋酸組。此外，1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸聯(lián)用組和1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸組相比，熒光強(qiáng)度明顯增加，幾乎達(dá)到MIC醋酸組處理后的熒光強(qiáng)度，破壞程度明顯增大。表明苯乳酸、醋酸及其聯(lián)用組能消散膜電勢(shì)，且1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸聯(lián)用組對(duì)膜電勢(shì)的消散具有協(xié)同性。

圖3 苯乳酸、醋酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌膜電位的影響Fig.3 Effect of PLA and ACE on membrane potential of L.monocytogenes

2.4 苯乳酸與醋酸聯(lián)用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞膜完整性的影響

采用SYTO9和PI兩種熒光染料對(duì)細(xì)胞染色觀察苯乳酸與醋酸對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響[27]。SYTO9能將所有細(xì)胞染色并發(fā)出綠色熒光，PI只能穿透細(xì)胞膜受損的細(xì)胞與核酸結(jié)合發(fā)出紅色熒光，因此可以用來(lái)觀察受損傷的細(xì)胞。從圖4可以看到，未經(jīng)處理的單核細(xì)胞增生李斯特菌發(fā)出綠色熒光（圖4A），表明細(xì)胞膜完整。經(jīng)過(guò)1/4 MIC苯乳酸處理后，細(xì)胞發(fā)出黃綠色熒光（圖4B），經(jīng)過(guò)1/2 MIC醋酸處理后的大部分菌體發(fā)出黃色熒光（圖4D），表明細(xì)胞膜受到損壞，而經(jīng)過(guò)MIC苯乳酸、MIC醋酸、1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸處理后的菌體發(fā)出橙色或者橙紅色（圖4C、E、F），表明細(xì)胞膜受到嚴(yán)重破壞。

為了明確苯乳酸和醋酸對(duì)細(xì)胞膜完整性的破壞程度，進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)定量考察細(xì)胞膜完整性的破壞程度。從圖5可以看出，空白組僅有3.4%的細(xì)菌膜遭到破壞，經(jīng)過(guò)MIC的苯乳酸、醋酸處理后，細(xì)胞膜破損率分別為97.1%，97.2%，可以看出兩種抑菌劑對(duì)細(xì)胞膜完整性的破壞作用很強(qiáng)，且隨著質(zhì)量濃度的增加而增大。此外，經(jīng)過(guò)1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸處理后，細(xì)胞膜破壞率分別為77.7%和91.4%，而1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸對(duì)細(xì)胞膜完整性的完全破壞率為98.4%，顯示出較好的抑菌活性。該結(jié)果與上述熒光顯微鏡的結(jié)果一致，均表明苯乳酸和醋酸對(duì)細(xì)胞膜完整性具有破壞性，且MIC苯乳酸、MIC醋酸、1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸對(duì)細(xì)胞膜完整性破壞比較嚴(yán)重，同時(shí)1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸對(duì)細(xì)胞膜還顯示出協(xié)同破壞性。Liu Fang等[28]發(fā)現(xiàn)1%的苯乳酸即可破壞大腸桿菌細(xì)胞膜的完整性。

圖4 熒光顯微鏡分析苯乳酸與醋酸聯(lián)用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig.4 Effect of combination of PLA and ACE on cell membrane integrity of L.monocytogenes evaluated by fluorescence microscopy

圖5 流式細(xì)胞術(shù)分析苯乳酸與醋酸聯(lián)用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig.5 Effect of combination of PLA and ACE on cell membrane integrity of L.monocytogenes evaluated by flow cytometry

2.5 苯乳酸與醋酸聯(lián)用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

圖6 苯乳酸與醋酸聯(lián)用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effect of combination of PLA and ACE on cell microstructure of L.monocytogenes evaluated by scanning electron microscope

采用掃描電子顯微鏡考察了苯乳酸和醋酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌形態(tài)的影響，從圖6可以看出，未經(jīng)處理的單核細(xì)胞增生李斯特菌表面圓潤(rùn)光滑、形態(tài)完好（圖6A）。經(jīng)1/4 MIC苯乳酸處理后菌體出現(xiàn)抱團(tuán)、表面皺縮（圖6B）；經(jīng)MIC苯乳酸處理后，菌體出現(xiàn)黏連、內(nèi)容物泄出（圖6C）。經(jīng)1/2 MIC醋酸處理后，菌體表面出現(xiàn)皺縮，發(fā)生輕微的黏連現(xiàn)象（圖6D）；經(jīng)MIC醋酸處理后，菌體出現(xiàn)黏連、內(nèi)容物泄出、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化（圖6E）。經(jīng)1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸處理后，菌體表面變得粗糙，發(fā)生黏連且內(nèi)容物泄出（圖6F）。上述結(jié)果表明，隨著苯乳酸和醋酸質(zhì)量濃度的增加，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的破壞作用增大，1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸對(duì)細(xì)胞的破壞程度顯著高于單獨(dú)使用1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸，能達(dá)到MIC苯乳酸、MIC醋酸對(duì)細(xì)胞的破壞程度，顯示出1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸對(duì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的協(xié)同破壞性。結(jié)合圖3和圖4推斷苯乳酸、醋酸破壞細(xì)胞膜膜電勢(shì)后，造成細(xì)胞膜通透性增加，完整性遭到破壞，進(jìn)而影響細(xì)胞功能和形態(tài)，導(dǎo)致菌體死亡。有機(jī)酸可對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，如Wang Chenjie等[29]用透射電子顯微鏡觀察乳酸對(duì)單細(xì)胞增生李斯特菌超微結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果顯示乳酸使細(xì)胞膜發(fā)生凹陷、質(zhì)壁分離、細(xì)胞質(zhì)密度降低等現(xiàn)象，從而使細(xì)胞失活。Dieuleveux等[10]報(bào)道，苯乳酸處理單核細(xì)胞增生李斯特菌后，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察到菌體細(xì)胞壁失去剛性，細(xì)胞發(fā)生膨脹，最后完全崩解。

2.6 苯乳酸與醋酸聯(lián)用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組DNA的影響

圖7 苯乳酸與醋酸聯(lián)用后單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組DNA的凝膠電泳圖Fig.7 Gel electrophoresis images showing the effect of combination of PLA and ACE on genomic DNA of L.monocytogenes

采用瓊脂糖凝膠電泳法考察了苯乳酸和醋酸對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組DNA的影響。游離的核酸凝膠染料4S Red Plus的熒光微弱，當(dāng)其與DNA結(jié)合后，會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。從圖7可以看出，與對(duì)照組比較，1/4 MIC苯乳酸及1/2 MIC醋酸處理的DNA條帶亮度發(fā)生不同程度的減弱，可能是1/4 MIC苯乳酸和1/2 MIC醋酸破壞了DNA。此外，1/2 MIC醋酸還出現(xiàn)了DNA滯留在進(jìn)樣口的情況，表明1/2 MIC醋酸與DNA發(fā)生電中性而部分停留在上樣孔。而MIC苯乳酸、MIC醋酸及1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸聯(lián)用組均出現(xiàn)條帶消失，表明它們對(duì)DNA的作用比單一的1/4 MIC苯乳酸或1/2 MIC醋酸強(qiáng)，可能將DNA降解成小碎片。上述凝膠電泳結(jié)果表明苯乳酸和醋酸可通過(guò)降解DNA，從而影響DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等一系列過(guò)程，達(dá)到抑菌目的。本研究結(jié)果與乳酸鏈球菌素等細(xì)菌素對(duì)菌體DNA的作用方式類似，均可以導(dǎo)致DNA降解從而發(fā)揮抑菌活性[30]；此外，1/2 MIC醋酸與殼聚糖對(duì)菌體DNA的影響類似，均出現(xiàn)DNA滯留在進(jìn)樣口，且條帶亮度減弱的現(xiàn)象，推測(cè)1/2 MIC醋酸可以通過(guò)與DNA結(jié)合，改變DNA電荷特性而發(fā)揮抑菌活性[31]。

3 結(jié) 論

苯乳酸和醋酸聯(lián)用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌具有協(xié)同抑菌性，抑菌位點(diǎn)包括細(xì)胞膜、DNA。苯乳酸和醋酸聯(lián)用通過(guò)影響細(xì)胞表面電荷、破壞細(xì)胞膜（包括細(xì)胞膜電勢(shì)及細(xì)胞膜完整性）引起細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)入細(xì)胞后與DNA發(fā)生相互作用，從而擾亂細(xì)胞內(nèi)正常的生理代謝活動(dòng)，使細(xì)胞死亡發(fā)揮抑菌作用。苯乳酸和醋酸聯(lián)用對(duì)菌體各抑菌靶位的破壞作用顯著高于各抑菌劑單獨(dú)作用的破壞程度。本研究表明苯乳酸與醋酸復(fù)配能降低苯乳酸的使用量，為苯乳酸在食品防腐中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。