李 玉, 李剛強(qiáng), 趙建國(guó)*, 張 珂, 金寶丹, 陳秀榮

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院， 環(huán)境污染治理與生態(tài)修復(fù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心， 河南 鄭州 450001

2.鄭州航空港區(qū)明港水務(wù)有限公司， 河南 鄭州 450001

3.華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院， 上海 200237

氯酚類(lèi)化合物被廣泛用作殺蟲(chóng)劑、殺菌劑、木材防腐劑和除草劑等的前驅(qū)物或中間體，結(jié)果在一些市政廢水和污染水體中檢測(cè)到其濃度在μgL到mgL的范圍內(nèi)波動(dòng)[1-2]. 另外，焦化廢水和造紙廢水等典型行業(yè)廢水中也存在不同類(lèi)型的氯酚類(lèi)污染物，其濃度達(dá)到幾十甚至上百mgL[3-4]. 氯酚類(lèi)化合物對(duì)微生物、水生生物和植物以及人體等均會(huì)產(chǎn)生明顯的危害，且隨著苯環(huán)上氯代原子數(shù)量和分子體積的增加，氯酚類(lèi)化合物越難以被微生物降解和毒性愈強(qiáng)[5-6]. 基于氯酚類(lèi)化合物顯著的毒性，抗生物降解特性和可能的“三致”效應(yīng)，氯酚廢水的處理受到廣泛關(guān)注.

微生物代謝過(guò)程產(chǎn)生的不同酶類(lèi)在降解氯酚類(lèi)污染物和維持微生物活性等方面起到了關(guān)鍵作用，如加氧酶、脫氯酶和脫氫酶可實(shí)現(xiàn)氯酚類(lèi)污染物的開(kāi)環(huán)、脫氯和降解[1,14]，ATP酶可為氯酚類(lèi)污染物的降解去除提供能量，超氧化物歧化酶(SODb)和脫氫酶可清除氯酚類(lèi)污染物降解過(guò)程產(chǎn)生的自由基，具有保護(hù)微生物免于傷害的作用[15]，細(xì)胞色素p450可起到脫毒的作用，同時(shí)也是電子傳遞鏈上的關(guān)鍵酶[16]. 然而，在利用活性污泥工藝處理氯酚廢水時(shí)，降解氯酚類(lèi)污染物的優(yōu)勢(shì)菌群編碼上述酶的功能基因表達(dá)鮮見(jiàn)報(bào)道. 考慮到Pseudomonas是一類(lèi)廣泛存在于不同環(huán)境的菌屬，對(duì)廢水中氯酚類(lèi)污染物具有極強(qiáng)的降解能力[17-18]，因此探討Pseudomonas代謝過(guò)程特定酶功能基因的表達(dá)具有重要的意義，可加強(qiáng)對(duì)不同微生物降解污染物機(jī)理的認(rèn)識(shí).

基于此，該研究以甲醇為共代謝碳源，利用HRT (水力停留時(shí)間)為8 h、SBR (間歇曝氣的序批式生物反應(yīng)器)處理進(jìn)水濃度為2 mgL的PCP (五氯苯酚)廢水，并與處理不含PCP的廢水作對(duì)比分析，探討PCP對(duì)污染物去除和微生物菌群的影響，并分析PCP誘導(dǎo)下污泥中Pseudomonas功能基因的表達(dá)水平，以期為難降解工業(yè)廢水的深度處理提供科學(xué)指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方案

接種污泥取自當(dāng)時(shí)市政污水處理廠(chǎng)好氧池，所取污泥用自來(lái)水清洗3次，曝氣24 h后接種到2個(gè)SBR中. SBR的外徑和高度分別為20和25 cm，有效體積為5 L. 初始污泥濃度(MLSS)為 3 200 mgL，通過(guò)排泥方式維持SBR運(yùn)行過(guò)程的MLSS為(3 000±200)mgL. 試驗(yàn)所需廢水為模擬廢水，控制進(jìn)水ρ(CODCr)為(300±20)mgL(由甲醇提供)，并補(bǔ)充微生物生長(zhǎng)所需的N、P及微量元素(見(jiàn)表1).

表1 試驗(yàn)廢水成分

調(diào)整SBR的HRT為8 h，單個(gè)SBR周期設(shè)置為0.25 h進(jìn)水、7 h運(yùn)行、0.5 h沉降、0.25 h排水，SBR運(yùn)行結(jié)束后的換水率為70%. 為節(jié)約能量和避免微生物發(fā)生內(nèi)源呼吸，利用定時(shí)開(kāi)關(guān)控制SBR運(yùn)行過(guò)程為間歇曝氣模式，即曝氣時(shí)間∶不曝氣時(shí)間為2 h∶2 h，曝氣階段通過(guò)攪拌將污泥與DO充分混合，控制ρ(DO)為(1.5±0.5)mgL，不曝氣階段停止攪拌. 在整個(gè)SBR運(yùn)行階段，測(cè)得溫度為(25±3)℃，通過(guò)NaHCO3溶液和稀鹽酸調(diào)整進(jìn)水pH為7.2±0.4. 當(dāng)以甲醇為碳源的2個(gè)SBR出水ρ(CODCr)低于50 mgL時(shí)，其中1個(gè)SBR繼續(xù)運(yùn)行，為對(duì)照組. 另1個(gè)SBR投加進(jìn)水濃度為2 mgL的PCP，為試驗(yàn)組，探討PCP對(duì)污泥性能和功能基因表達(dá)水平的影響.

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

SBR運(yùn)行過(guò)程的pH和ρ(DO)分別采用實(shí)驗(yàn)室FiveEasyTM pH計(jì)(METTLER TOLEDO，瑞士)和便攜式DO計(jì)(YSI，美國(guó))檢測(cè)；出水ρ(CODCr)按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，即在SBR運(yùn)行周期末，取上清液在 4 000 rmin下離心5 min，然后采用酸性重鉻酸鉀法測(cè)定；MLSS采用重量法測(cè)定，即將泥水混合液充分混勻后，取100 mL用已知質(zhì)量的濾紙過(guò)濾，在105 ℃下烘干至恒質(zhì)量，然后稱(chēng)量、計(jì)算；水相和泥相PCP采用高效液相色譜儀(HPLC，LC-10ATVP，Kyoto，日本)測(cè)定，固定相為反相C-18柱(250 nm×4.6 nm, 5 μm)，流動(dòng)相為甲醇和超純水的混合液，體積比為8∶2，其中超純水中含體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸. 流動(dòng)相流速、測(cè)試波長(zhǎng)、進(jìn)樣體積和柱溫分別為1 mLmin、280 nm、10 μL和40 ℃. 水相PCP通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾后直接測(cè)定，泥相PCP通過(guò)超聲萃取的方法提取，而后通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾測(cè)定. 通過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得泥相PCP的萃取回收率在73.2%～93.4%之間.

1.3 微生物菌群分析

待試驗(yàn)組SBR運(yùn)行至120 d后，污泥中基因組DNA利用溶酶菌-SDS-氯仿異戊醇法提取，細(xì)菌16S擴(kuò)增上游引物(357-F-GC)和下游引物(518r)序列分別為5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGGGCCTACGAGGCAGCAG-3′和5′-ATT ACCGCGGCTGCTGG-3′. PCR反應(yīng)和Reconditioning PCR反應(yīng)按照BioLinker公司提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行. 擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物通過(guò)變性梯度凝膠電泳(40%～60%)分離，電泳結(jié)束后對(duì)凝膠染色并拍照，利用Quantity One軟件對(duì)凝膠圖進(jìn)行分析，并用滅菌刀切割優(yōu)勢(shì)條帶.

采用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收切割條帶中的PCR產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物的二次擴(kuò)增引物去掉GC發(fā)夾結(jié)構(gòu). 利用BioLinker公司的pED-T載體試劑盒克隆PCR產(chǎn)物. 挑選平板上的克隆，用Amp抗性L(fǎng)B培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌液培養(yǎng)至OD600 nm值為2～3時(shí)，對(duì)菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海BioSune生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序. 為保證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個(gè)樣品做3個(gè)平行.

利用生物信息學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和篩選，去除T載體的引物. 將全部序列結(jié)果整理為FASTA格式的序列文件，在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì). 將同一DGGE膠條中的3個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果進(jìn)行alignment分析，檢測(cè)條帶的一致性，并將比對(duì)結(jié)果中相似性最高的物種信息進(jìn)行總結(jié).

1.4 功能基因表達(dá)的分析

待試驗(yàn)組SBR運(yùn)行至120 d后，采用Primer軟件設(shè)計(jì)Pseudomonas的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)引物(見(jiàn)表2)，由生工生物科技有限公司合成. 通過(guò)qPCR技術(shù)檢測(cè)SBR運(yùn)行周期末污泥中所屬Pseudomonas特定酶的功能基因表達(dá)水平，并與對(duì)照組作對(duì)比分析. 選取的酶為超氧化物歧化酶(SODb)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、氨單加氧酶(AM)、細(xì)胞色素p450(CYP450)、ATP水解酶(ATPase)、甘油三磷酸脫氫酶(GAPDH)和脫氯水解酶(HDLH)，其對(duì)應(yīng)的mRNA功能基因分別為sodB、KatG、amoA、p450、ATPase、gap和hdlh.

表2 熒光定量PCR引物

試驗(yàn)前對(duì)所需試劑和耗材進(jìn)行去RNase處理，污泥總RNA的抽提利用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒，具體步驟按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行. 用微量分光光度計(jì)NanoDrop(Thermo,美國(guó))檢測(cè)提取的RNA濃度以及A260 nmA280 nm和A260 nmA230 nm，發(fā)現(xiàn)RNA純度符合試驗(yàn)要求. 按照北京全式金生物公司提供的First-Strand cDNA Synthesis SuperMix提示逐步進(jìn)行操作，根據(jù)提取的RNA濃度和純度，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄配置第一條鏈cDNA合成的反應(yīng)體系. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包含2 μL總RNA、1 μL隨機(jī)引物、10 μL 2×TS Reaction Mix、1 μL TransScript RTRI Enzyme Mix和6 μL無(wú)RNase水，將各樣品的模板按上述反應(yīng)體系配置后放入常規(guī)PCR儀，設(shè)定25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育30 min，最后85 ℃加熱5 min失活. 按照Bio-Rad公司提供的NltraSYBR Mixture說(shuō)明，以各樣品的cDNA文庫(kù)為模板，配置反應(yīng)體系. qPCR反應(yīng)體系為10 μL 2×UltraSYBR Mixture、2 μL正向qPCR引物(終濃度為0.2 μmolL)、2 μL反向qPCR引物(終濃度0.2 μmolL)、1 μL cDNA和5 μL去RNase水，將各組反應(yīng)體系按照順序依次加入96孔熒光定量PCR板，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，用透明qPCR封口膜封閉，在有吊籃的離心機(jī)下離心 (2 000 rmin)2 min后放入熒光定量PCR儀(BioRad CFX96, 美國(guó)). 根據(jù)引物Tm值，調(diào)整qPCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、55 ℃退火10 s和72 ℃延伸20 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán).

求3個(gè)平行孔數(shù)值的平均值，利用ΔΔCT法計(jì)算,其中ΔCT為樣品平均值與內(nèi)參平均值之差，ΔΔCT為樣品與對(duì)照組所求得的ΔCT之差，計(jì)算出2-ΔΔCT值即是相應(yīng)基因mRNA上調(diào)或者下調(diào)的倍數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 進(jìn)水CODCr和PCP的去除

當(dāng)以甲醇為碳源的2個(gè)SBR出水ρ(CODCr)低于50 mgL時(shí)，試驗(yàn)組SBR投加進(jìn)水濃度為2 mgL的PCP，對(duì)照組SBR繼續(xù)運(yùn)行. 由圖1可見(jiàn)，對(duì)照組SBR出水ρ(CODCr)在31.6 mgL左右波動(dòng). 進(jìn)水濃度為2 mgL的PCP對(duì)污泥毒性有明顯的滯后效應(yīng)，表現(xiàn)在試驗(yàn)組SBR第1天的出水ρ(CODCr)和對(duì)照組一致，均為42 mgL. 然而，從第8天開(kāi)始，PCP顯著抑制污泥活性，導(dǎo)致出水ρ(CODCr)超過(guò)100 mgL，直至運(yùn)行至第90天，試驗(yàn)組SBR出水ρ(CODCr)才明顯降低. 從第98天至SBR運(yùn)行結(jié)束，試驗(yàn)組SBR出水ρ(CODCr)穩(wěn)定在66.2 mgL左右，這說(shuō)明進(jìn)水PCP逐漸被降解去除，但出水ρ(CODCr)仍舊比對(duì)照組平均高出34.6 mgL，這表明進(jìn)水PCP對(duì)活性污泥的毒性作用持續(xù)影響CODCr的去除.

圖1 2個(gè)SBR反應(yīng)器出水ρ(CODCr)的變化

1～20 d，水相、泥相PCP的殘留量隨運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，分別由第1天的0.76和1.17 mgL增至第20天的1.35和2.32 mgL(見(jiàn)圖2)，單位時(shí)間內(nèi)污泥吸附的PCP增加量為0.058 mg(L·d)，水相PCP的去除以污泥吸附為主. 20～90 d，水相、泥相PCP的殘留量開(kāi)始下降，第90天時(shí)分別降至0.43和0.52 mgL，這表明長(zhǎng)時(shí)間的馴化誘使污泥降解PCP的優(yōu)勢(shì)菌群逐漸富集，吸附到泥相的PCP被降解去除，但積累到泥相的PCP仍舊抑制污泥活性，導(dǎo)致此期間出水ρ(CODCr)居高不下. 然而，隨著泥相PCP的降解去除，污泥活性逐漸恢復(fù)，伴隨著出水ρ(CODCr)的降低. 120 d時(shí)水相、泥相無(wú)PCP的殘留，出水ρ(CODCr)也處于穩(wěn)定水平.

圖2 試驗(yàn)組SBR運(yùn)行周期末水相和泥相PCP濃度的變化

2.2 降解PCP的污泥菌群結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)PCP馴化的試驗(yàn)組SBR運(yùn)行至120 d后，采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)污泥菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其圖譜如圖3所示，并與對(duì)照組作對(duì)比分析[18]. 對(duì)照組和試驗(yàn)組SBR的香農(nóng)維納指數(shù)(H)分別為2.19和2.71，即試驗(yàn)組污泥的微生物多樣性顯著高于對(duì)照組. 推斷認(rèn)為，對(duì)照組SBR進(jìn)水碳源比較單一，主要為易降解的甲醇，導(dǎo)致污泥中富集的微生物多樣性偏少，而試驗(yàn)組SBR進(jìn)水PCP的毒性作用誘導(dǎo)污泥中微生物分泌豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，同時(shí)PCP降解過(guò)程會(huì)產(chǎn)生多種代謝中間產(chǎn)物，結(jié)果不同類(lèi)型碳源的降解過(guò)程會(huì)導(dǎo)致微生物多樣性的顯著增加. 前期的研究也證實(shí)相對(duì)于模擬廢水，處理市政廢水的微生物多樣性更加豐富[19].

注： 不同數(shù)字代表鑒定的優(yōu)勢(shì)菌群.

對(duì)試驗(yàn)組SBR污泥的優(yōu)勢(shì)條帶(見(jiàn)圖3)進(jìn)行鑒定分析，由表3可見(jiàn)，同一條帶鑒定出不屬于同一菌屬的情況(條帶2、4和8)，這可能是屬于不同菌屬的基因組DNA發(fā)生了共遷移現(xiàn)象或者是目的條帶附近包含肉眼難以發(fā)現(xiàn)的低亮度相鄰條帶. 污泥中的優(yōu)勢(shì)菌屬均屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，相關(guān)研究[20]也發(fā)現(xiàn)，屬于變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)的菌屬?gòu)V泛存在于廢水處理廠(chǎng)，在污染物去除方面起著重要作用. 對(duì)照組SBR污泥中的優(yōu)勢(shì)菌屬主要包括Methylobacillus、Pseudomonas、Chondromyces、Ignavibacterium、Leadbetterella、Anaerobacillus和Proteiniclasticum[18]，其中部分優(yōu)勢(shì)菌屬在試驗(yàn)組同樣存在，表明該類(lèi)菌屬耐受PCP毒性的能力較強(qiáng)，如Chondromyces和Ignavibacterium，后者可將苯環(huán)降解開(kāi)環(huán)[21]. 其他的優(yōu)勢(shì)菌屬，如Thauera、Pseudoxanthomonas、Bosea、Achromobacter、Comamonas和Salimesophilobacter，廣泛存在于降解氯酚及其他芳香烴污染物的活性污泥中，表明這些菌屬在PCP降解過(guò)程起著重要作用[2,22-25].

表3 PCR-DGGE優(yōu)勢(shì)條帶的BLAST比對(duì)結(jié)果

2.3 PCP誘導(dǎo)下污泥中菌屬Pseudomonas功能基因的表達(dá)水平

廢水中污染物的降解由微生物代謝過(guò)程產(chǎn)生的酶實(shí)現(xiàn)，而酶的編碼和調(diào)控需通過(guò)功能基因來(lái)完成[26]. 因此，分析降解PCP的菌屬中調(diào)控關(guān)鍵酶的mRNA表達(dá)水平具有重要的意義，可間接地反饋活性污泥系統(tǒng)不同酶的含量. 待試驗(yàn)組SBR運(yùn)行至120 d后且處于穩(wěn)定運(yùn)行階段時(shí)，SBR運(yùn)行周期末污泥中菌屬Pseudomonas的mRNA表達(dá)水平通過(guò)qPCR定量，并與對(duì)照組作對(duì)比分析，結(jié)果如圖4所示. 試驗(yàn)組污泥中基因KatG、ATPase和p450的表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)，分別為對(duì)照組的1.59、1.75和1.48倍，而基因sodB、amoA、hdlh和gap的表達(dá)則出現(xiàn)顯著下調(diào)，分別為對(duì)照組的0.58、0.53、0.28和0.20倍，這表明微生物代謝過(guò)程的不同基因表達(dá)可受到PCP的抑制或激活.

圖4 Pseudomonas功能基因表達(dá)的倍數(shù)變化

微生物代謝過(guò)程需要較多的能量抵抗PCP的毒性并將其降解去除，而基因ATPase的表達(dá)上調(diào)可合成更多的ATPase，為PCP的降解去除提供能量[27]. PCP降解過(guò)程會(huì)誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生大量的氧自由基，進(jìn)而導(dǎo)致微生物出現(xiàn)蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA損傷等問(wèn)題，而基因KatG和p450的表達(dá)上調(diào)可合成更多的CAT和CYP450，清除微生物體內(nèi)的自由基，維持其活性[28]. 基因sodB、amoA、hdlh和gap的表達(dá)下調(diào)意味著合成SODb、AM、HDLH和GAPDH的含量下降，推斷這與PCP毒性抑制相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)，而穩(wěn)定運(yùn)行階段的試驗(yàn)組SBR出水ρ(CODCr)顯著高于對(duì)照組也表明PCP抑制部分基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)酶的合成量下降. 相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)低濃度污染物會(huì)誘導(dǎo)微生物部分酶的活性升高，而濃度過(guò)高則抑制酶的活性[29-30]，這與該研究結(jié)果一致. 后續(xù)需深入研究降解PCP的優(yōu)勢(shì)菌屬相關(guān)功能基因表達(dá)被激活或抑制的機(jī)理，進(jìn)而加強(qiáng)對(duì)不同微生物降解污染物機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為如何利用不同微生物菌群高效處理氯酚廢水及其他工業(yè)廢水提供科學(xué)指導(dǎo).

3 結(jié)論

a) HRT為8 h時(shí)，SBR污泥活性受進(jìn)水濃度為2 mgL的PCP抑制顯著，出水ρ(CODCr)升高，PCP難以被降解去除(1～90 d). 然而，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間馴化的污泥降解PCP的優(yōu)勢(shì)菌屬逐漸富集，進(jìn)水CODCr和PCP被降解去除(90 d后). 但PCP的毒性作用導(dǎo)致其出水ρ(CODCr)顯著高于對(duì)照組.

b) 經(jīng)PCP成功馴化的污泥中富集的優(yōu)勢(shì)菌屬主要為Chondromyces、Ignavibacterium、Thauera、Pseudoxanthomonas、Bosea、Achromobacter、Comamonas和Salimesophilobacter，均歸屬于變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，在降解去除氯酚過(guò)程中起到重要作用.

c) 當(dāng)降解PCP的SBR處于穩(wěn)定運(yùn)行階段時(shí)，進(jìn)水PCP可抑制或激活污泥中菌屬Pseudomonas不同功能基因的表達(dá)水平，后續(xù)需深入研究降解PCP的優(yōu)勢(shì)菌屬相關(guān)功能基因表達(dá)被激活或抑制的機(jī)理，進(jìn)而加強(qiáng)對(duì)不同微生物降解污染物機(jī)理的認(rèn)識(shí).