李 玉, 李剛強(qiáng), 趙建國*, 張 珂, 金寶丹, 陳秀榮

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院， 環(huán)境污染治理與生態(tài)修復(fù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心， 河南 鄭州 450001

2.鄭州航空港區(qū)明港水務(wù)有限公司， 河南 鄭州 450001

3.華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院， 上海 200237

氯酚類化合物被廣泛用作殺蟲劑、殺菌劑、木材防腐劑和除草劑等的前驅(qū)物或中間體，結(jié)果在一些市政廢水和污染水體中檢測(cè)到其濃度在μgL到mgL的范圍內(nèi)波動(dòng)[1-2]. 另外，焦化廢水和造紙廢水等典型行業(yè)廢水中也存在不同類型的氯酚類污染物，其濃度達(dá)到幾十甚至上百mgL[3-4]. 氯酚類化合物對(duì)微生物、水生生物和植物以及人體等均會(huì)產(chǎn)生明顯的危害，且隨著苯環(huán)上氯代原子數(shù)量和分子體積的增加，氯酚類化合物越難以被微生物降解和毒性愈強(qiáng)[5-6]. 基于氯酚類化合物顯著的毒性，抗生物降解特性和可能的“三致”效應(yīng)，氯酚廢水的處理受到廣泛關(guān)注.

微生物代謝過程產(chǎn)生的不同酶類在降解氯酚類污染物和維持微生物活性等方面起到了關(guān)鍵作用，如加氧酶、脫氯酶和脫氫酶可實(shí)現(xiàn)氯酚類污染物的開環(huán)、脫氯和降解[1,14]，ATP酶可為氯酚類污染物的降解去除提供能量，超氧化物歧化酶(SODb)和脫氫酶可清除氯酚類污染物降解過程產(chǎn)生的自由基，具有保護(hù)微生物免于傷害的作用[15]，細(xì)胞色素p450可起到脫毒的作用，同時(shí)也是電子傳遞鏈上的關(guān)鍵酶[16]. 然而，在利用活性污泥工藝處理氯酚廢水時(shí)，降解氯酚類污染物的優(yōu)勢(shì)菌群編碼上述酶的功能基因表達(dá)鮮見報(bào)道. 考慮到Pseudomonas是一類廣泛存在于不同環(huán)境的菌屬，對(duì)廢水中氯酚類污染物具有極強(qiáng)的降解能力[17-18]，因此探討Pseudomonas代謝過程特定酶功能基因的表達(dá)具有重要的意義，可加強(qiáng)對(duì)不同微生物降解污染物機(jī)理的認(rèn)識(shí).

基于此，該研究以甲醇為共代謝碳源，利用HRT (水力停留時(shí)間)為8 h、SBR (間歇曝氣的序批式生物反應(yīng)器)處理進(jìn)水濃度為2 mgL的PCP (五氯苯酚)廢水，并與處理不含PCP的廢水作對(duì)比分析，探討PCP對(duì)污染物去除和微生物菌群的影響，并分析PCP誘導(dǎo)下污泥中Pseudomonas功能基因的表達(dá)水平，以期為難降解工業(yè)廢水的深度處理提供科學(xué)指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方案

接種污泥取自當(dāng)時(shí)市政污水處理廠好氧池，所取污泥用自來水清洗3次，曝氣24 h后接種到2個(gè)SBR中. SBR的外徑和高度分別為20和25 cm，有效體積為5 L. 初始污泥濃度(MLSS)為 3 200 mgL，通過排泥方式維持SBR運(yùn)行過程的MLSS為(3 000±200)mgL. 試驗(yàn)所需廢水為模擬廢水，控制進(jìn)水ρ(CODCr)為(300±20)mgL(由甲醇提供)，并補(bǔ)充微生物生長所需的N、P及微量元素(見表1).

表1 試驗(yàn)廢水成分

調(diào)整SBR的HRT為8 h，單個(gè)SBR周期設(shè)置為0.25 h進(jìn)水、7 h運(yùn)行、0.5 h沉降、0.25 h排水，SBR運(yùn)行結(jié)束后的換水率為70%. 為節(jié)約能量和避免微生物發(fā)生內(nèi)源呼吸，利用定時(shí)開關(guān)控制SBR運(yùn)行過程為間歇曝氣模式，即曝氣時(shí)間∶不曝氣時(shí)間為2 h∶2 h，曝氣階段通過攪拌將污泥與DO充分混合，控制ρ(DO)為(1.5±0.5)mgL，不曝氣階段停止攪拌. 在整個(gè)SBR運(yùn)行階段，測(cè)得溫度為(25±3)℃，通過NaHCO3溶液和稀鹽酸調(diào)整進(jìn)水pH為7.2±0.4. 當(dāng)以甲醇為碳源的2個(gè)SBR出水ρ(CODCr)低于50 mgL時(shí)，其中1個(gè)SBR繼續(xù)運(yùn)行，為對(duì)照組. 另1個(gè)SBR投加進(jìn)水濃度為2 mgL的PCP，為試驗(yàn)組，探討PCP對(duì)污泥性能和功能基因表達(dá)水平的影響.

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

SBR運(yùn)行過程的pH和ρ(DO)分別采用實(shí)驗(yàn)室FiveEasyTM pH計(jì)(METTLER TOLEDO，瑞士)和便攜式DO計(jì)(YSI，美國)檢測(cè)；出水ρ(CODCr)按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，即在SBR運(yùn)行周期末，取上清液在 4 000 rmin下離心5 min，然后采用酸性重鉻酸鉀法測(cè)定；MLSS采用重量法測(cè)定，即將泥水混合液充分混勻后，取100 mL用已知質(zhì)量的濾紙過濾，在105 ℃下烘干至恒質(zhì)量，然后稱量、計(jì)算；水相和泥相PCP采用高效液相色譜儀(HPLC，LC-10ATVP，Kyoto，日本)測(cè)定，固定相為反相C-18柱(250 nm×4.6 nm, 5 μm)，流動(dòng)相為甲醇和超純水的混合液，體積比為8∶2，其中超純水中含體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸. 流動(dòng)相流速、測(cè)試波長、進(jìn)樣體積和柱溫分別為1 mLmin、280 nm、10 μL和40 ℃. 水相PCP通過0.45 μm濾膜過濾后直接測(cè)定，泥相PCP通過超聲萃取的方法提取，而后通過0.45 μm濾膜過濾測(cè)定. 通過多次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得泥相PCP的萃取回收率在73.2%～93.4%之間.

1.3 微生物菌群分析

待試驗(yàn)組SBR運(yùn)行至120 d后，污泥中基因組DNA利用溶酶菌-SDS-氯仿異戊醇法提取，細(xì)菌16S擴(kuò)增上游引物(357-F-GC)和下游引物(518r)序列分別為5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGGGCCTACGAGGCAGCAG-3′和5′-ATT ACCGCGGCTGCTGG-3′. PCR反應(yīng)和Reconditioning PCR反應(yīng)按照BioLinker公司提供的說明書進(jìn)行. 擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物通過變性梯度凝膠電泳(40%～60%)分離，電泳結(jié)束后對(duì)凝膠染色并拍照，利用Quantity One軟件對(duì)凝膠圖進(jìn)行分析，并用滅菌刀切割優(yōu)勢(shì)條帶.

采用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收切割條帶中的PCR產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物的二次擴(kuò)增引物去掉GC發(fā)夾結(jié)構(gòu). 利用BioLinker公司的pED-T載體試劑盒克隆PCR產(chǎn)物. 挑選平板上的克隆，用Amp抗性LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌液培養(yǎng)至OD600 nm值為2～3時(shí)，對(duì)菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海BioSune生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序. 為保證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個(gè)樣品做3個(gè)平行.

利用生物信息學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和篩選，去除T載體的引物. 將全部序列結(jié)果整理為FASTA格式的序列文件，在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì). 將同一DGGE膠條中的3個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果進(jìn)行alignment分析，檢測(cè)條帶的一致性，并將比對(duì)結(jié)果中相似性最高的物種信息進(jìn)行總結(jié).

1.4 功能基因表達(dá)的分析

待試驗(yàn)組SBR運(yùn)行至120 d后，采用Primer軟件設(shè)計(jì)Pseudomonas的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)引物(見表2)，由生工生物科技有限公司合成. 通過qPCR技術(shù)檢測(cè)SBR運(yùn)行周期末污泥中所屬Pseudomonas特定酶的功能基因表達(dá)水平，并與對(duì)照組作對(duì)比分析. 選取的酶為超氧化物歧化酶(SODb)、過氧化氫酶(CAT)、氨單加氧酶(AM)、細(xì)胞色素p450(CYP450)、ATP水解酶(ATPase)、甘油三磷酸脫氫酶(GAPDH)和脫氯水解酶(HDLH)，其對(duì)應(yīng)的mRNA功能基因分別為sodB、KatG、amoA、p450、ATPase、gap和hdlh.

表2 熒光定量PCR引物

試驗(yàn)前對(duì)所需試劑和耗材進(jìn)行去RNase處理，污泥總RNA的抽提利用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒，具體步驟按照說明書執(zhí)行. 用微量分光光度計(jì)NanoDrop(Thermo,美國)檢測(cè)提取的RNA濃度以及A260 nmA280 nm和A260 nmA230 nm，發(fā)現(xiàn)RNA純度符合試驗(yàn)要求. 按照北京全式金生物公司提供的First-Strand cDNA Synthesis SuperMix提示逐步進(jìn)行操作，根據(jù)提取的RNA濃度和純度，通過逆轉(zhuǎn)錄配置第一條鏈cDNA合成的反應(yīng)體系. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包含2 μL總RNA、1 μL隨機(jī)引物、10 μL 2×TS Reaction Mix、1 μL TransScript RTRI Enzyme Mix和6 μL無RNase水，將各樣品的模板按上述反應(yīng)體系配置后放入常規(guī)PCR儀，設(shè)定25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育30 min，最后85 ℃加熱5 min失活. 按照Bio-Rad公司提供的NltraSYBR Mixture說明，以各樣品的cDNA文庫為模板，配置反應(yīng)體系. qPCR反應(yīng)體系為10 μL 2×UltraSYBR Mixture、2 μL正向qPCR引物(終濃度為0.2 μmolL)、2 μL反向qPCR引物(終濃度0.2 μmolL)、1 μL cDNA和5 μL去RNase水，將各組反應(yīng)體系按照順序依次加入96孔熒光定量PCR板，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，用透明qPCR封口膜封閉，在有吊籃的離心機(jī)下離心 (2 000 rmin)2 min后放入熒光定量PCR儀(BioRad CFX96, 美國). 根據(jù)引物Tm值，調(diào)整qPCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、55 ℃退火10 s和72 ℃延伸20 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán).

求3個(gè)平行孔數(shù)值的平均值，利用ΔΔCT法計(jì)算,其中ΔCT為樣品平均值與內(nèi)參平均值之差，ΔΔCT為樣品與對(duì)照組所求得的ΔCT之差，計(jì)算出2-ΔΔCT值即是相應(yīng)基因mRNA上調(diào)或者下調(diào)的倍數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 進(jìn)水CODCr和PCP的去除

當(dāng)以甲醇為碳源的2個(gè)SBR出水ρ(CODCr)低于50 mgL時(shí)，試驗(yàn)組SBR投加進(jìn)水濃度為2 mgL的PCP，對(duì)照組SBR繼續(xù)運(yùn)行. 由圖1可見，對(duì)照組SBR出水ρ(CODCr)在31.6 mgL左右波動(dòng). 進(jìn)水濃度為2 mgL的PCP對(duì)污泥毒性有明顯的滯后效應(yīng)，表現(xiàn)在試驗(yàn)組SBR第1天的出水ρ(CODCr)和對(duì)照組一致，均為42 mgL. 然而，從第8天開始，PCP顯著抑制污泥活性，導(dǎo)致出水ρ(CODCr)超過100 mgL，直至運(yùn)行至第90天，試驗(yàn)組SBR出水ρ(CODCr)才明顯降低. 從第98天至SBR運(yùn)行結(jié)束，試驗(yàn)組SBR出水ρ(CODCr)穩(wěn)定在66.2 mgL左右，這說明進(jìn)水PCP逐漸被降解去除，但出水ρ(CODCr)仍舊比對(duì)照組平均高出34.6 mgL，這表明進(jìn)水PCP對(duì)活性污泥的毒性作用持續(xù)影響CODCr的去除.

圖1 2個(gè)SBR反應(yīng)器出水ρ(CODCr)的變化

1～20 d，水相、泥相PCP的殘留量隨運(yùn)行時(shí)間的延長而增加，分別由第1天的0.76和1.17 mgL增至第20天的1.35和2.32 mgL(見圖2)，單位時(shí)間內(nèi)污泥吸附的PCP增加量為0.058 mg(L·d)，水相PCP的去除以污泥吸附為主. 20～90 d，水相、泥相PCP的殘留量開始下降，第90天時(shí)分別降至0.43和0.52 mgL，這表明長時(shí)間的馴化誘使污泥降解PCP的優(yōu)勢(shì)菌群逐漸富集，吸附到泥相的PCP被降解去除，但積累到泥相的PCP仍舊抑制污泥活性，導(dǎo)致此期間出水ρ(CODCr)居高不下. 然而，隨著泥相PCP的降解去除，污泥活性逐漸恢復(fù)，伴隨著出水ρ(CODCr)的降低. 120 d時(shí)水相、泥相無PCP的殘留，出水ρ(CODCr)也處于穩(wěn)定水平.

圖2 試驗(yàn)組SBR運(yùn)行周期末水相和泥相PCP濃度的變化

2.2 降解PCP的污泥菌群結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)PCP馴化的試驗(yàn)組SBR運(yùn)行至120 d后，采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)污泥菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其圖譜如圖3所示，并與對(duì)照組作對(duì)比分析[18]. 對(duì)照組和試驗(yàn)組SBR的香農(nóng)維納指數(shù)(H)分別為2.19和2.71，即試驗(yàn)組污泥的微生物多樣性顯著高于對(duì)照組. 推斷認(rèn)為，對(duì)照組SBR進(jìn)水碳源比較單一，主要為易降解的甲醇，導(dǎo)致污泥中富集的微生物多樣性偏少，而試驗(yàn)組SBR進(jìn)水PCP的毒性作用誘導(dǎo)污泥中微生物分泌豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，同時(shí)PCP降解過程會(huì)產(chǎn)生多種代謝中間產(chǎn)物，結(jié)果不同類型碳源的降解過程會(huì)導(dǎo)致微生物多樣性的顯著增加. 前期的研究也證實(shí)相對(duì)于模擬廢水，處理市政廢水的微生物多樣性更加豐富[19].

注： 不同數(shù)字代表鑒定的優(yōu)勢(shì)菌群.

對(duì)試驗(yàn)組SBR污泥的優(yōu)勢(shì)條帶(見圖3)進(jìn)行鑒定分析，由表3可見，同一條帶鑒定出不屬于同一菌屬的情況(條帶2、4和8)，這可能是屬于不同菌屬的基因組DNA發(fā)生了共遷移現(xiàn)象或者是目的條帶附近包含肉眼難以發(fā)現(xiàn)的低亮度相鄰條帶. 污泥中的優(yōu)勢(shì)菌屬均屬于變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)，相關(guān)研究[20]也發(fā)現(xiàn)，屬于變形菌門和厚壁菌門的菌屬廣泛存在于廢水處理廠，在污染物去除方面起著重要作用. 對(duì)照組SBR污泥中的優(yōu)勢(shì)菌屬主要包括Methylobacillus、Pseudomonas、Chondromyces、Ignavibacterium、Leadbetterella、Anaerobacillus和Proteiniclasticum[18]，其中部分優(yōu)勢(shì)菌屬在試驗(yàn)組同樣存在，表明該類菌屬耐受PCP毒性的能力較強(qiáng)，如Chondromyces和Ignavibacterium，后者可將苯環(huán)降解開環(huán)[21]. 其他的優(yōu)勢(shì)菌屬，如Thauera、Pseudoxanthomonas、Bosea、Achromobacter、Comamonas和Salimesophilobacter，廣泛存在于降解氯酚及其他芳香烴污染物的活性污泥中，表明這些菌屬在PCP降解過程起著重要作用[2,22-25].

表3 PCR-DGGE優(yōu)勢(shì)條帶的BLAST比對(duì)結(jié)果

2.3 PCP誘導(dǎo)下污泥中菌屬Pseudomonas功能基因的表達(dá)水平

廢水中污染物的降解由微生物代謝過程產(chǎn)生的酶實(shí)現(xiàn)，而酶的編碼和調(diào)控需通過功能基因來完成[26]. 因此，分析降解PCP的菌屬中調(diào)控關(guān)鍵酶的mRNA表達(dá)水平具有重要的意義，可間接地反饋活性污泥系統(tǒng)不同酶的含量. 待試驗(yàn)組SBR運(yùn)行至120 d后且處于穩(wěn)定運(yùn)行階段時(shí)，SBR運(yùn)行周期末污泥中菌屬Pseudomonas的mRNA表達(dá)水平通過qPCR定量，并與對(duì)照組作對(duì)比分析，結(jié)果如圖4所示. 試驗(yàn)組污泥中基因KatG、ATPase和p450的表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)，分別為對(duì)照組的1.59、1.75和1.48倍，而基因sodB、amoA、hdlh和gap的表達(dá)則出現(xiàn)顯著下調(diào)，分別為對(duì)照組的0.58、0.53、0.28和0.20倍，這表明微生物代謝過程的不同基因表達(dá)可受到PCP的抑制或激活.

圖4 Pseudomonas功能基因表達(dá)的倍數(shù)變化

微生物代謝過程需要較多的能量抵抗PCP的毒性并將其降解去除，而基因ATPase的表達(dá)上調(diào)可合成更多的ATPase，為PCP的降解去除提供能量[27]. PCP降解過程會(huì)誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生大量的氧自由基，進(jìn)而導(dǎo)致微生物出現(xiàn)蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過氧化和DNA損傷等問題，而基因KatG和p450的表達(dá)上調(diào)可合成更多的CAT和CYP450，清除微生物體內(nèi)的自由基，維持其活性[28]. 基因sodB、amoA、hdlh和gap的表達(dá)下調(diào)意味著合成SODb、AM、HDLH和GAPDH的含量下降，推斷這與PCP毒性抑制相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)，而穩(wěn)定運(yùn)行階段的試驗(yàn)組SBR出水ρ(CODCr)顯著高于對(duì)照組也表明PCP抑制部分基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)酶的合成量下降. 相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)低濃度污染物會(huì)誘導(dǎo)微生物部分酶的活性升高，而濃度過高則抑制酶的活性[29-30]，這與該研究結(jié)果一致. 后續(xù)需深入研究降解PCP的優(yōu)勢(shì)菌屬相關(guān)功能基因表達(dá)被激活或抑制的機(jī)理，進(jìn)而加強(qiáng)對(duì)不同微生物降解污染物機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為如何利用不同微生物菌群高效處理氯酚廢水及其他工業(yè)廢水提供科學(xué)指導(dǎo).

3 結(jié)論

a) HRT為8 h時(shí)，SBR污泥活性受進(jìn)水濃度為2 mgL的PCP抑制顯著，出水ρ(CODCr)升高，PCP難以被降解去除(1～90 d). 然而，經(jīng)長時(shí)間馴化的污泥降解PCP的優(yōu)勢(shì)菌屬逐漸富集，進(jìn)水CODCr和PCP被降解去除(90 d后). 但PCP的毒性作用導(dǎo)致其出水ρ(CODCr)顯著高于對(duì)照組.

b) 經(jīng)PCP成功馴化的污泥中富集的優(yōu)勢(shì)菌屬主要為Chondromyces、Ignavibacterium、Thauera、Pseudoxanthomonas、Bosea、Achromobacter、Comamonas和Salimesophilobacter，均歸屬于變形菌門和厚壁菌門，在降解去除氯酚過程中起到重要作用.

c) 當(dāng)降解PCP的SBR處于穩(wěn)定運(yùn)行階段時(shí)，進(jìn)水PCP可抑制或激活污泥中菌屬Pseudomonas不同功能基因的表達(dá)水平，后續(xù)需深入研究降解PCP的優(yōu)勢(shì)菌屬相關(guān)功能基因表達(dá)被激活或抑制的機(jī)理，進(jìn)而加強(qiáng)對(duì)不同微生物降解污染物機(jī)理的認(rèn)識(shí).