趙炳佳，梁曉春

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院，北京100730

國際糖尿病聯(lián)盟最新流行病學數(shù)據(jù)表明，2019年全球糖尿病患者達4.63億，我國患者最多，高達1.164億[1]。糖尿病一系列并發(fā)癥中以神經(jīng)病變最為常見，至少50%的患者最終會罹患糖尿病神經(jīng)病變，其致殘率和病死率均較高[2]。目前，研究人員從晚期糖基化終產(chǎn)物、多元醇通路、蛋白激酶C通路、氧化應激、自噬等方面對糖尿病神經(jīng)病變的病理機制進行了大量研究，但臨床治療效果并不理想[3]。近年來，越來越多的研究表明，外泌體有望成為糖尿病神經(jīng)病變診治研究的新方向。外泌體是一種納米級細胞外囊泡，直徑30～150 nm，具有脂質(zhì)雙分子層外膜結(jié)構，攜帶著豐富的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)，廣泛存在于各種組織、血清、尿液中[4～6]。外泌體信號傳遞不同于其他經(jīng)典的細胞間信號通訊方式。在高糖病理狀態(tài)下，神經(jīng)元及其膠質(zhì)細胞外泌體的合成、釋放和轉(zhuǎn)運會發(fā)生質(zhì)和量的變化，從而影響靶細胞的生長和發(fā)育[7]?，F(xiàn)就外泌體在糖尿病神經(jīng)病變中的作用及應用研究進展綜述如下。

1 外泌體參與糖尿病神經(jīng)病變進程的分子基礎

外泌體是由胞膜內(nèi)吞形成管腔囊泡，經(jīng)過內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復合體和神經(jīng)酰胺相互作用后包裹脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等“貨物”形成多囊泡體，最后與胞膜融合并向外釋放的囊泡小體[5,8]。合成的外泌體能夠通過血液、組織液等方式進入到全身各個組織細胞中，釋放出內(nèi)容物，傳遞來源細胞的信號，調(diào)節(jié)靶細胞相應的生理活動。糖尿病來源的外泌體本身攜帶致病信息，游走在心肌、內(nèi)皮等組織中則會造成不同程度的病變[9]。有研究證實，外泌體能夠透過血腦屏障進到腦組織中[10]。這表明糖尿病來源的外泌體也很有可能由此進入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，造成進一步代謝損傷。

多項研究顯示，外泌體中的脂質(zhì)分子數(shù)量和種類豐富，含有鞘磷脂、磷脂酰膽堿、神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂等，并有著豐富的生理功能[11]。如神經(jīng)節(jié)苷脂能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)的生長發(fā)育，研究證實其能改善糖尿病周圍神經(jīng)病患者的癥狀[12]。同時，外泌體為雙層膜結(jié)構，對其在血液和神經(jīng)組織中的流動和轉(zhuǎn)運具有重要意義。研究表明，外泌體膜外的鞘磷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂含量比值對外泌體的流動性有顯著影響[13]。這對進一步研究外泌體在全身各組織的轉(zhuǎn)移能力和流動性非常有意義。

外泌體普遍含有跨膜蛋白、GPI錨蛋白、熱休克蛋白等。不同組織細胞來源的外泌體有著特異性的膜蛋白，如神經(jīng)元外泌體中含有乙酰膽堿酯酶或β淀粉樣蛋白等。這種特異性膜蛋白可作為鑒別和純化神經(jīng)元來源外泌體的陽性標志物，而且，外泌體攜帶的功能性蛋白質(zhì)能夠進入不同組織中發(fā)揮作用。如有些外泌體中攜帶細胞因子、生長因子、纖維連接蛋白、膠原等，而這些蛋白與糖尿病狀態(tài)下神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的炎癥反應、修復、再生以及微環(huán)境的形成密切相關[5]。

除了豐富的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子，外泌體中還存在著數(shù)量可觀又復雜的核酸分子，在細胞間信息傳遞和調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要功能[14]。Krishnan等[15]通過對糖尿病患者胰島組織來源的外泌體中所有RNA進行高通量測序分析，發(fā)現(xiàn)一共有72條RNA(包括mRNA、miRNA、piRNA、IncRNA、snoRNA、tRNA)表達水平具有統(tǒng)計學差異，并且通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，這些RNA與胰島素分泌、鈣離子信號通路及細胞凋亡等密切關聯(lián)，但具體分子機制有待進一步闡明。還有研究表明，病理狀態(tài)下的RNAs亦能夠通過外泌體轉(zhuǎn)運到神經(jīng)組織細胞中，如神經(jīng)元、雪旺細胞等，在其中釋放后影響細胞中的基因表達和蛋白合成[4]。

2 外泌體在糖尿病神經(jīng)病變中的調(diào)節(jié)作用

在神經(jīng)系統(tǒng)中，外泌體可來源于神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞以及雪旺細胞[16]。高糖狀態(tài)容易造成神經(jīng)軸突萎縮、神經(jīng)纖維功能喪失、髓鞘脫落、神經(jīng)元凋亡等，病理細胞來源的外泌體則會導致病變程度進一步惡化。這表明在糖尿病神經(jīng)病變中，外泌體可能參與了病理活動的進程。

2.1 外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用 研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)神經(jīng)元的外周細胞外泌體攜帶蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)進入神經(jīng)元后提高了神經(jīng)的再生能力、氧化應激能力，起到修復高糖代謝損傷神經(jīng)元、促進神經(jīng)認知功能恢復的良性調(diào)節(jié)作用。如Venkat等[17]發(fā)現(xiàn)小鼠腦內(nèi)皮細胞來源的外泌體能夠在腦缺血區(qū)域通過增加神經(jīng)軸突、血管密度及上調(diào)miRNA-126誘導巨噬細胞聚集等發(fā)揮作用，促進2型糖尿病中風小鼠神經(jīng)修復，顯著改善認知功能。而且，外泌體還具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元抗氧化應激的能力。Frohlich等[18]發(fā)現(xiàn)，少突膠質(zhì)細胞外泌體能夠攜帶具有抗氧化應激能力的超氧化物歧化酶和過氧化物歧化酶進入神經(jīng)元。隨著抗氧化應激能力的增強，神經(jīng)元能夠維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，減少凋亡，發(fā)揮正常的神經(jīng)功能。

2.2 外泌體在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用 目前關于雪旺細胞外泌體與神經(jīng)元之間相互作用的眾多研究發(fā)現(xiàn)，健康細胞來源的外泌體能夠調(diào)節(jié)病理神經(jīng)細胞狀態(tài)，促進其恢復正常生理功能；相反，高糖病理狀態(tài)下的雪旺細胞來源外泌體則會對神經(jīng)元造成損傷，導致病情惡化。Zhou等[19]發(fā)現(xiàn)，來自RSC96雪旺細胞的外泌體對受到機械損傷的背根神經(jīng)元細胞具有促進增殖、延緩衰老、抑制凋亡的作用。Simeoli等[20]進一步研究發(fā)現(xiàn)，當背根神經(jīng)元受到損傷時，其miRNA表達失調(diào)，并且釋放出miR-21-5p表達上調(diào)的外泌體，該外泌體能夠募集巨噬細胞，進一步誘發(fā)炎癥反應，修復受損神經(jīng)元。但是，有學者發(fā)現(xiàn)，把高糖狀態(tài)下生長的雪旺細胞來源外泌體注射進小鼠坐骨神經(jīng)后，會加重糖尿病小鼠的周圍神經(jīng)病變程度。隨后，該研究發(fā)現(xiàn)，與正常雪旺細胞外泌體對比，高糖狀態(tài)下生長的雪旺細胞來源外泌體中miR-28、31a、130a高表達；在培養(yǎng)背根神經(jīng)元時加入該外泌體后發(fā)現(xiàn)，其神經(jīng)軸突生長受到抑制，并且軸突中相應的靶蛋白如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a、內(nèi)吞銜接蛋白、突觸小體相關蛋白25、生長相關蛋白43表達均下降。后續(xù)實驗中，研究者發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了miR-28、31a、130a的背根神經(jīng)元生長受到抑制，這進一步證實了高糖狀態(tài)下雪旺細胞外泌體及其表達的miRNA均加重了糖尿病周圍神經(jīng)病變過程[21]。

3 外泌體在糖尿病神經(jīng)病變治療中的應用探索

多項研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病神經(jīng)病變與炎癥反應、氧化應激、脫髓鞘、突觸可塑性損傷、神經(jīng)萎縮等密切相關，而目前研究證實外泌體具有加強抗炎、抗氧化應激、促進髓鞘再生、突觸重塑、神經(jīng)再生和修復等作用，這表明外泌體能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長與發(fā)育，對糖尿病神經(jīng)病變具有潛在的治療效果。

3.1 外泌體減輕炎癥反應 在抗炎作用方面，有研究證實，來自骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體可通過抑制促炎基因表達等治療糖尿病小鼠神經(jīng)病變，促進其神經(jīng)功能恢復。Kubota等[22]發(fā)現(xiàn)，大鼠骨髓間質(zhì)干細胞來源外泌體攜帶的miRNA-146a能夠預防糖尿病引起的海馬神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞損傷，最終促進神經(jīng)認知功能的恢復，而其具體機制則與抗炎作用有關。進一步地，F(xiàn)an等[23]將小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞來源外泌體注射入糖尿病周圍神經(jīng)病變小鼠模型，結(jié)果顯示，小鼠熱痛閾值、感覺和運動神經(jīng)傳導速度等周圍神經(jīng)功能明顯改善；研究人員通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，該外泌體中高度表達Let-7a、miR-17、miR-23等，而這些miRNA與Toll樣受體(TLR)4/NF-κB信號通路密切相關，并且通過Western blotting實驗證實了注射該外泌體的糖尿病小鼠相比對照組，其坐骨神經(jīng)中TLR4、IRAK1、NF-κB p65的表達明顯降低。

3.2 外泌體抗氧化應激 研究表明，干細胞外泌體增強了高糖下神經(jīng)元的抗氧化應激能力，而且神經(jīng)元自身的外泌體能夠?qū)⒓毎麅?nèi)的過氧化物轉(zhuǎn)移出細胞，減輕了對神經(jīng)元的氧化損傷。Nakano等[24]發(fā)現(xiàn)，大鼠骨髓間質(zhì)干細胞來源外泌體具有抗氧化應激能力，能夠增加神經(jīng)元突觸生長密度，改善糖尿病誘發(fā)的神經(jīng)細胞超微結(jié)構異常，從而修復受損的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，減輕糖尿病大鼠的神經(jīng)認知功能障礙。另外，還有研究者證實，外泌體能夠?qū)碓醇毎麚p壞的染色體DNA片段運出細胞外，減輕細胞內(nèi)氧化應激反應和DNA損傷，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[25]。這一點，對于減輕高糖狀態(tài)下的神經(jīng)元及其膠質(zhì)細胞的氧化應激引起的DNA損傷尤其重要。

3.3 外泌體促進神經(jīng)修復 無論是神經(jīng)元還是干細胞來源的外泌體都攜帶著大量保護神經(jīng)和營養(yǎng)神經(jīng)的蛋白質(zhì)和核酸，可調(diào)節(jié)相關分子通路，起到保護髓鞘、重塑突觸、修復受損神經(jīng)元等作用，促進神經(jīng)元的生長與功能恢復，展示了潛在的治療前景。

在髓鞘保護方面，有研究發(fā)現(xiàn)，少突膠質(zhì)細胞外泌體中攜帶大量的髓磷蛋白磷脂蛋白、2030-環(huán)核苷酸-磷酸二酯酶、髓鞘堿性蛋白等，而這些成分有利于形成神經(jīng)髓鞘，包裹神經(jīng)，形成保護作用和營養(yǎng)支持[26]。Pusic等[27]將提取自健康大鼠血清的外泌體加入大鼠海馬神經(jīng)組織中一起培養(yǎng)，結(jié)果顯示該外泌體能促進海馬中髓磷脂的表達、促進少突膠質(zhì)前體細胞和神經(jīng)干細胞的生長，且該外泌體富含miR-219。miR-219能夠明顯促進髓鞘再生，保護軸突，改善脫髓鞘病變，促進神經(jīng)功能恢復[28]。

在突觸重塑方面，去極化神經(jīng)元釋放出的外泌體中富含突觸可塑性微管相關蛋白1B及其miRNA，而這對于神經(jīng)突觸重塑非常有意義[29,30]。同時，Xin等[31]發(fā)現(xiàn)，來自多功能性間充質(zhì)基質(zhì)細胞的外泌體能夠介導miR-133b轉(zhuǎn)移至星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，從而調(diào)節(jié)基因表達，有益于神經(jīng)突觸的重塑和功能恢復。另一方面，有學者證明，來自小鼠小膠質(zhì)細胞的外泌體能夠選擇性清除PC12神經(jīng)細胞的病理性突觸連接，保證正常的神經(jīng)突觸功能[32]。

在神經(jīng)生長方面，有學者發(fā)現(xiàn)，在體外環(huán)境下間充質(zhì)基質(zhì)細胞來源外泌體能夠促進皮層神經(jīng)元軸突的生長和延長，而減少外泌體中RNA誘導沉默蛋白Ago2表達后，神經(jīng)軸突的生長則受到抑制；增加外泌體中miR-17-92表達后，其對神經(jīng)的促生長作用更強，該miRNA可能通過PTEN/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮作用[33]。另外，還有學者分別提取1型糖尿病大鼠骨髓基質(zhì)細胞和正常大鼠骨髓基質(zhì)細胞來源的外泌體，并分別注射進1型糖尿病腦卒中大鼠顱腦中，發(fā)現(xiàn)前者具有重塑腦血管和腦白質(zhì)的作用，檢測結(jié)果顯示前者血清miR-145表達下降，而miR-145靶基因腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白1和胰島素樣生長因子1受體的表達上升。研究進一步證實，轉(zhuǎn)染和敲除miR-145的外泌體影響了神經(jīng)的生長程度，表明miR-145在神經(jīng)保護中起到重要調(diào)節(jié)作用[34]。而在外周神經(jīng)系統(tǒng)方面，有學者發(fā)現(xiàn)雪旺細胞來源的外泌體能夠促進神經(jīng)軸突再生，修復坐骨神經(jīng)元損傷[35]。

綜上所述，外泌體在糖尿病神經(jīng)病變中介導多種信號通路，在各個細胞間傳遞著不同訊息，調(diào)節(jié)著病理活動、生理功能。無論是髓鞘退化或形成，還是神經(jīng)細胞的凋亡和再生，外泌體均扮演著至關重要的作用。由于不同生理或病理狀態(tài)下，外泌體及其內(nèi)容物會發(fā)生相應的差異性改變，若在其中尋找到生物標志物，體液外泌體檢測或?qū)⒊蔀樘悄虿∩窠?jīng)病變早期有效的診療手段。而且，外泌體為自身分泌，能夠游走全身甚至透過血腦屏障，若將相應藥物等包裹進外泌體，再被細胞靶向吸收，將會成為精準治療的有效手段。然而，外泌體的具體調(diào)節(jié)機制如高糖狀態(tài)如何影響外泌體的形成與傳播等仍有待進一步研究探索。