戴祥宇，李相安，何增國

中草藥靈丹草抗弧菌及其用于發(fā)酵飼料添加劑的研究

戴祥宇1，李相安2*，何增國3

（1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200000 ；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院生物科技系，山東 萊陽；3.青島海洋生物醫(yī)藥研究院海洋微生物工程研發(fā)中心，山東 青島）

通過篩選產(chǎn)酶有益微生物菌株，對藥用植物靈丹草進行發(fā)酵，并進行了發(fā)酵條件的摸索和優(yōu)化。結(jié)果表明，從9種不同產(chǎn)地的靈丹草中篩選出了對弧菌抑制效果較好的樣品，對副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌的最低抑菌濃度（MIC）均為0.133 g/ml。篩選出了一株枯草芽孢桿菌和一株地衣芽孢桿菌作為產(chǎn)酶發(fā)酵菌株，可使對副溶血弧菌的最低抑菌濃度降低50 %。驗證了靈丹草對斑馬魚的安全性，以及抗弧菌的初步應(yīng)用效果。

中草藥；靈丹草；發(fā)酵；弧菌

中草藥富含豐富的營養(yǎng)成分及藥用成分，如：有機酸類、酶、多糖等。然而由于植物細胞壁的阻礙作用，有效成分難以釋放出來。傳統(tǒng)炮制加工技術(shù)并不能使有效成分充分釋出，而微生物豐富的酶系統(tǒng)使之成為可能。微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各種酶類不僅能降解難溶的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等基質(zhì)，還能將藥用植物中難利用的大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)。

靈丹草Laggera pterodonta（DC.）Benth.為菊科六棱菊屬，又名臭靈丹，主要分布于我國的長江流域以南及西南部。該草藥的民間應(yīng)用廣泛，主要用在治療上呼吸道感染、扁桃體炎、咽喉炎、支氣管炎、瘧疾等病。

本文就靈丹草抗弧菌性能及其作為飼料添加劑進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中草藥

表1 不同產(chǎn)地靈丹草及其代碼

1.1.2 試驗菌種

表2 指示菌菌種及其染色

1.2 試驗方法

1.2.1 靈丹草抑菌譜 選用取自昆明、麗江、西雙版納、梅州、亳州、贛州的9種靈丹草，粉碎后過30目篩，烘干，分別取20 g靈丹草粉末，加入150 ml無菌水在121 °C下滅菌20 min，制得0.133 g/ml的藥液，取上清對表2中的指示菌進行抑菌試驗，以牛津杯法觀察抑菌圈，測量抑菌圈直徑。

1.2.2 菌株篩選、鑒定及菌株產(chǎn)酶特性研究 從20份海水、土壤樣品以及其他樣品中分離產(chǎn)酶菌，分別用產(chǎn)酶的平板進行初篩和復(fù)篩，選出產(chǎn)酶性能高的菌株，進行鑒定，及菌種的溶血性測定。將所選菌株活化后，用移液器取10 μl菌液滴到血瓊脂平板上，在37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，觀察菌落生長情況和溶血圈大小。

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化 將靈丹草用粉碎機粉碎后，過30目篩待用。將發(fā)酵液上清做抑菌實驗，以副溶血弧菌作為指示菌，以牛津杯法觀察抑菌圈。（1）靈丹草對發(fā)酵菌種抑制作用試驗：在500 ml錐形瓶中分別加入5 g、10 g、15 g、20 g、30 g靈丹草粉末，加入150 ml無菌水在121 °C下滅菌20 min。分別將10 μl藥液涂在3種產(chǎn)酶菌的平板上，觀察是否有抑菌圈。（2）菌液添加量試驗：在500 ml錐形瓶中分別加入20 g靈丹草粉末，加入150 ml無菌水在121 °C下滅菌20 min。分別加入10 ml、20 ml、30 ml的B.subtilis LS7菌液，發(fā)酵96 h。用發(fā)酵液上清進行抑菌試驗。（3）中草藥添加量試驗：在500 ml錐形瓶中分別加入10 g、15 g、20 g、25 g靈丹草粉末，加入150 ml無菌水分別在121°C下滅菌20 min。加入20 ml的菌液發(fā)酵72 h。用發(fā)酵液上清進行抑菌實驗。（4）pH穩(wěn)定性試驗：將滅菌的靈丹草調(diào)至pH5，pH7和pH9，分別發(fā)酵。用發(fā)酵液上清進行抑菌實驗。（5）發(fā)酵前后活性對比：在500 ml錐形瓶中分別加入20 g靈丹草粉末，加入150 ml無菌水在121 °C下滅菌20 min，加入20 ml菌液；將滅菌后的靈丹草加入170 ml無菌水作為對照，共同發(fā)酵72 h。發(fā)酵完成后取上清離心過濾，文火煎至100 ml，得到0.2 g/ml的靈丹草藥液，用二倍稀釋法進行抑菌試驗。

1.2.4 動物試驗 （1）動物安全試驗：分別取靈丹草滅菌后和發(fā)酵72 h后的藥液，稀釋到0.2 g?ml-1、0.1 g?ml-1、0.05 g?ml-1，浸泡飼料投喂斑馬魚，以正常飼料投喂的斑馬魚作為對照。添加量約為每缸150 μl，每缸10條，三組平行，觀察15 d后斑馬魚的生長狀態(tài)和存活情況。（2）動物功效試驗：分別將魚缸里加入1 ml弧菌培養(yǎng)液使水中弧菌濃度在1 000 CFU/ml左右，分別以發(fā)酵前、發(fā)酵后不同濃度的靈丹草處理飼料飼喂斑馬魚。每缸10條，3組平行，15 d后測量水中弧菌數(shù)量的變化，生長狀態(tài)、體重變化及存活情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈丹草抑菌活性篩選

從表3可以看出，K1、K3、K4、X1樣品對于三種病原弧菌都有明顯的抑制租用。其中K4樣品最為明顯。

表3 不同產(chǎn)地靈丹草的抑菌圈直徑 （mm）

注：NA: 無抑菌效果或抑菌圈小于8mm

測試K4的抑菌譜，結(jié)果如表4，發(fā)現(xiàn)其除對弧菌有抑制作用外，對金黃色葡萄球菌也有抑制作用。

表4 K4樣品靈丹草最低抑菌濃度

2.2 發(fā)酵菌種篩選

從20份海水、土壤樣品以及其他樣品中，一共分離得到了86株菌，初篩得到25株菌，復(fù)篩得到3株產(chǎn)酶性較高的菌株。分別為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。3種均為益生菌，在國家農(nóng)業(yè)部可允許添加的飼料菌種目錄中，且均無溶血性。產(chǎn)酶特性如表5：

表5 產(chǎn)酶菌的產(chǎn)酶直徑比

注：表中數(shù)值為菌液在產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基上點10 μl培養(yǎng)24 h的透明圈直徑與菌落直徑比

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 靈丹草對發(fā)酵菌種抑制作用 在500 ml錐形瓶中分別加入5 g、10 g、15 g、20 g、30 g靈丹草粉末，加入150 ml無菌水在121°C下滅菌20 min。分別將10 μl藥液涂在3種產(chǎn)酶菌的平板上，觀察是否有抑菌圈。如表6，B. subtilis LS7對于靈丹草藥液耐受濃度較高，可用于發(fā)酵。

表6 靈丹草對發(fā)酵菌種的抑制試驗

注：+為有抑菌圈；-為沒有抑菌圈

2.3.2 菌液添加量試驗 菌落變化見表7。雖然發(fā)酵液在發(fā)酵48 h時菌活數(shù)達到最大，但發(fā)酵72 h的發(fā)酵液上清比發(fā)酵48 h的發(fā)酵液上清抑菌圈大，說明菌產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物復(fù)合酶需要一定的時間。

表7 發(fā)酵過程中的菌落變化及抑菌效果

2.3.3 中草藥添加量 抑菌結(jié)果見表8，得到20 g發(fā)酵組抑菌效果最好；25 g添加組可能過于粘稠，不利于液體發(fā)酵。

表8 不同靈丹草添加量發(fā)酵的抑菌效果

2.3.4 pH穩(wěn)定性 不調(diào)節(jié)pH發(fā)酵時，發(fā)酵液始終保持在5.5左右。3種pH發(fā)酵組抑菌圈結(jié)果相同，證明pH對發(fā)酵影響不大。

2.3.5 發(fā)酵前后活性對比 發(fā)酵前最低抑菌濃度（MIC）為0.1 g/ml，發(fā)酵后的最低抑菌濃度為0.05 g/ml，抑菌效果提升一倍。

2.4 動物試驗

2.4.1 動物安全性 15 d后斑馬魚的生長狀態(tài)和存活情況見表9和表10。斑馬魚的生長狀態(tài)和存活情況均為良好，無呆滯、厭食或者死亡現(xiàn)象。

表9 未發(fā)酵靈丹草安全性

表10 發(fā)酵后靈丹草安全性

2.4.2 動物功效性 在魚缸里加入1 ml弧菌培養(yǎng)液使水中弧菌濃度在1 000 CFU/ml左右之后，記錄斑馬魚的存活數(shù)量（見表11）。在有靈丹草的情況下，斑馬魚的成活率高于不添加靈丹草。濃度高的實驗組存活率高于濃度低的實驗組。添加發(fā)酵靈丹草的斑馬魚存活率高于添加未發(fā)酵靈丹草的斑馬魚7 %。

表11 動物功效試驗

3 結(jié)論

本研究從9種不同產(chǎn)地的靈丹草中篩選出了對弧菌抑制效果較好靈丹草樣品；篩選出了產(chǎn)酶效果良好的一株枯草芽孢桿菌，對藥用植物靈丹草進行了發(fā)酵，使靈丹草有效成分充分釋放，使對副溶血弧菌的最低抑菌濃度降低了50 %。同時與所用生產(chǎn)菌一起，形成復(fù)合微生物添加劑，在斑馬魚上驗證了靈丹草的安全性，以及抗弧菌的初步應(yīng)用效果。這也為后續(xù)在水產(chǎn)業(yè)中取得應(yīng)用，抑制弧菌，用于替代抗生素的使用，減少耐藥菌的產(chǎn)生，并為減少抗生素在水產(chǎn)中的殘留打下基礎(chǔ)。

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（2020–10–02）

S853.92

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1007-1733（2020）12-0011-03