冉學文，李 寧，熊曉莉 (重慶工商大學環(huán)境與資源學院，重慶 400067)

聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織將集約化畜禽養(yǎng)殖列為世界三大環(huán)境污染源之一[1]。按照1只蛋雞年排糞45 kg計算，我國年產鮮雞糞1.4億t左右[2]。雞糞中大量的氮、病菌、重金屬、獸藥抗生素等物質直接進入環(huán)境后，會帶來嚴重的環(huán)境污染。雞糞潛在的高污染風險是由于雞的腸道較短，飼料消化不完全，能量利用率低導致的。目前雞糞資源化利用的主要方式為能源化、肥料化、飼料化[3-4]。雞糞能源化需要額外設備投入，成本高，適合大型養(yǎng)殖場，而肥料化雖然是各國普遍采用的技術，但缺乏有關定量使用標準，導致其利用率不高。雞糞飼料化是一種理想的處理方法，可用于養(yǎng)殖豬、牛、羊、魚類和黃粉蟲，但因飼料化后可能導致適口性差、能量低、有害物質超標等問題，限制了其大規(guī)模應用[4-6]。針對現階段雞糞資源化存在的一些問題，人們提出雞糞養(yǎng)殖蚯蚓的想法。除了能處理雞糞，蚯蚓還可用于制藥、飼料、化妝品，蚓糞也是優(yōu)質的有機肥料[7-8]。目前雞糞養(yǎng)殖蚯蚓的研究集中在蚯蚓生長繁殖方面，忽略了推廣到實際生產時面臨的一系列潛在問題，如蚯蚓對雞糞生長基料的適應性、重金屬污染風險、雞糞殘留抗生素的危害等。

筆者采用不同C/N比發(fā)酵雞糞飼喂蚯蚓，考察蚯蚓生長情況，分析蚯蚓和雞糞中重金屬含量變化，探究獸藥抗生素對蚯蚓的毒性，探討了養(yǎng)殖產物利用的安全性，旨在探索腐熟雞糞養(yǎng)殖蚯蚓的可行性，為實際應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

表1 試驗材料性質

1.2 試驗方法

1.2.1雞糞發(fā)酵與蚯蚓飼喂試驗設計

試驗設計見表2。A、B、C 3組各100 kg純雞糞，參考有關雞糞發(fā)酵研究，加鋸末調節(jié)C/N比至20、25、30，初始含水率均為60%[9]。添加發(fā)酵菌劑混勻后堆積發(fā)酵，用木棒在堆體表面扎孔，促進空氣流通，達到最高溫度后，每降低10 ℃翻堆1次，直至溫度不再上升。

表2 雞糞發(fā)酵和飼喂試驗設計

取發(fā)酵后的雞糞(A、B、C)、未經處理純雞糞(D)、鋸末(E)各1 kg(干重)，鋪撒于塑料盒中(長×寬×高為18 cm×27 cm×14 cm)，以花園泥土(F)作為對照，每組重復3次。每組投放100條蚯蚓，每條(500±50) mg，于恒溫培養(yǎng)箱中飼喂，溫度為(25±1) ℃，培養(yǎng)箱濕度為80%，每天加適量去離子水，保持基料含水率為60%～70%，[光]照度為400～800 lx。7 d測定1次存活率和體重增長率，共21 d。

1.2.2蚯蚓適應性研究處理設計

適應性是指生物體與環(huán)境表現相適合的現象，該研究中適應性決定了蚯蚓能否處理雞糞。當蚯蚓對生長環(huán)境表現出不適應性時，會出現蚯蚓掙扎、逃逸的現象。剛投加時，根據蚯蚓的表現對適應性進行分級：不逃逸，鉆入基料(Ⅰ)；掙扎，有逃逸傾向(Ⅱ)；大量逃逸(Ⅲ)。蚯蚓對不適環(huán)境也表現出一定的耐受性，超過極限蚯蚓就會死亡。為防止飼喂過程中蚯蚓逃逸，影響試驗結果，利用蚯蚓的趨光性，對試驗組設置光照。蚯蚓長期處于不適條件下，會表現出活力降低、對外部刺激反應減弱的現象，根據蚯蚓活躍程度和針刺反應的表現對適應性分級?；钴S程度：非?；钴S(Ⅰ)、活躍(Ⅱ)、不活躍(Ⅲ)；針刺反應表現：劇烈反應(Ⅰ)、輕微反應(Ⅱ)、無反應(Ⅲ)。級數越高，適應性越差。

1.2.3雞糞性質測定

(1)氣味與外觀

氣味，按國際通行六級評價法進行氣味測試和評價，數值越大，氣味越刺鼻[10]；外觀，肉眼觀察發(fā)酵前后樣品的顏色。

(2)發(fā)芽指數(GI值)

取5.0 g樣品(干重)加入100 mL去離子水浸提1 h，移取10 mL上清液于墊有濾紙的直徑9 cm培養(yǎng)皿中，取20粒綠豆種子在(20±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，測定種子發(fā)芽率(G)和根長(l)，以10 mL去離子水作對照，GI值(IG)計算公式[11]為

(1)

式(1)中，G為浸提液發(fā)芽率，%；G0為對照組發(fā)芽率，%；l為根長，mm。

(3)理化性質

腐殖酸(HAC)含量按GB/T 34766—2017《礦物源總腐殖酸含量的測定》測定；含水率采用烘干法進行測定；用SIN-pH100型電導率筆(深圳)檢測pH值和電導率(EC)，按前文中方法浸提1 h后，參照SCIUBBA等[12]的方法測定；NH4+-N含量測定采用氯化鉀浸提-靛酚藍比色法[13]；NO3--N含量測定參考NY/T 1116—2014《肥料硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮含量的測定》中的方法；有機質含量按GB 18877—2009《有機-無機復混肥料》進行測定后換算成有機碳含量。樣品經海能SH420F型石墨消解爐(濟南)消解后用海能K1100F型全自動凱氏定氮儀(濟南)測定總氮含量；C/N比則根據有機碳含量與總氮含量計算比值。

1.2.4重金屬測定

根據1.2.1和1.2.2節(jié)試驗結果，取最適宜蚯蚓生長的腐熟前后雞糞和飼喂前后蚯蚓樣品冷凍后，于烘箱中120 ℃干燥24 h(雞糞干重減少31.38%，蚯蚓含水率w為49.10%)，取出研磨成粉，稱取1.000 g于聚四氟乙烯坩堝中，加王水和HClO4消解完全，加體積比1∶1的去離子水和王水，移至50 mL容量瓶，經0.45 μm孔徑濾膜過濾，用Spectro Genesis型ICP電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(德國)檢測Cr、Cd、Pb、Hg、As含量[14]。

富集系數(EF，FE)可用來描述蚯蚓對雞糞中重金屬的富集程度，計算公式[15]為

FE=C/C0。

(2)

式(2)中，C為蚯蚓中某重金屬含量，mg·kg-1；C0為雞糞中某重金屬含量，mg·kg-1。

1.2.5抗生素對蚯蚓的急性毒性試驗

1.2.6蚯蚓生長數據測定

蚯蚓的平均存活率(S)計算公式為

(3)

式(3)中，n為蚯蚓存活條數；n0為蚯蚓初始條數。

蚯蚓的平均增長率(I)計算公式為

(4)

式(4)中，m為蚯蚓測試時質量，g；m0為蚯蚓初始總質量，g。

2 結果與討論

2.1 溫度變化

雞糞發(fā)酵過程中，微生物利用有機物生長、繁殖并釋放出熱量。由圖1可知，3組試驗都經升溫、高溫、降溫3個階段。升溫階段，微生物呈指數型增長，新陳代謝加快，產生的熱量一部分用于升溫，另一部分被環(huán)境損耗。C/N比為20、25和30的3組試驗均在第3天達到50 ℃，最高溫度分別為55、59、63℃，50 ℃以上高溫持續(xù)時間分別為4、5、7 d。隨著有機物分解，微生物能利用的物質減少，第11天開始溫度逐漸降低進入后腐熟階段。每次翻堆后，表面未被利用的有機質進入堆體內部，原本坍縮的中心空氣流通性增加，微生物代謝增強，所以溫度會再次上升。C/N比高的試驗組加入的鋸末多，雞糞間的空隙大，空氣易進入發(fā)酵堆體中心，好氧微生物代謝快，產生熱量多，高溫持續(xù)時間長；C/N比低的試驗組加入鋸末量少，雞糞間空隙小，空氣進入發(fā)酵堆體中心少，微生物增長較慢，產熱少，高溫持續(xù)時間短。C/N比為30的試驗組發(fā)酵溫度維持在50 ℃以上的時間為7 d，滿足無害化處理規(guī)范[16]。

圖1 發(fā)酵溫度變化

2.2 腐熟后雞糞性質

雞糞發(fā)酵后的性質見表3。C組氣味分值最低，刺激氣味最小，A組氣味最明顯。發(fā)酵雞糞的味道主要是NH3所致，其產生與雞糞中NH4+-N濃度有關。有研究者指出，腐熟時NH4+-N含量應該低于0.4 g·kg-1，A、B、C組均低于此值[17]。C組發(fā)酵后為灰褐色，B組為淺褐色，A組顏色接近鋸末，呈黃色。參考NY 525—2012《有機肥料》中規(guī)定，無明顯氣味和灰褐色表示腐熟程度較高。

微生物越活躍，產熱越多，水分散失也越多，因此含水率變化和溫度變化關系密切。C組高溫持續(xù)時間長，腐熟后含水率最低(31.32%)。雞糞發(fā)酵后有機質含量仍較高，但不會自發(fā)升溫。這與加入鋸末后微生物并不能完全將其降解有關，避免了處理過程升溫導致蚯蚓死亡[18]。3組試驗C/N比均表現為降低，有研究以初始C/N比與結束C/N比的比值小于0.6作為腐熟標志[19]，C組滿足此要求。GI值也是判斷腐熟的重要指標，在實際應用中GI值達到80%～85%表明堆肥腐熟[20]。由表3可知，3組試驗GI值分別為90.21%、100.32%、130.43%，僅從GI值判斷，3組試驗腐熟度都較高。目前暫無判斷腐熟度的pH值具體規(guī)定，參考NY 525—2012，pH值應在5.5～8.5范圍內，B、C試驗組pH值在此范圍內。EC值低于1.5 mS·cm-1可認為達到腐熟標準，3組試驗均滿足此條件[14]。腐殖酸是腐殖質的一部分，此成分含量高可以從一定程度上反映腐殖化程度較高[21]。

表3 雞糞發(fā)酵后的性質

判斷腐熟度的指標較多，滿足判斷條件的指數越多腐熟度也就越高。綜合以上分析，C組符合腐熟判斷的指標最多，A組最少。可以初步判斷3組試驗的腐熟程度為A

2.3 蚯蚓處理雞糞

2.3.1蚯蚓的適應性

蚯蚓的適應性試驗結果如表4所示，級別越低，蚯蚓的適應性越強。剛投放時，蚯蚓對C、E、F組適應性較強，鉆入基料中。A、B、D組蚯蚓有逃逸現象，表現出不適性。其中D組蚯蚓劇烈掙扎，所有蚯蚓均逃逸，在恒溫培養(yǎng)箱中飼喂時，無法利用趨光性阻止D組蚯蚓逃逸，且剩余蚯蚓死亡。據此分析，純雞糞無法直接飼喂蚯蚓。第7天，C組雞糞中的蚯蚓在基料淺層采食，活躍程度、針刺反應表現出的適應性最強。A組蚯蚓極不活躍，在盒底部停留。相較于其余組，蚯蚓對A、B組的不適性導致其對針刺的反應較弱。第14和21天，各組蚯蚓表現相似，E、F組對針刺反應的表現與C組相似，但活躍程度比C組低，可能是鋸末(E)和花園泥土(F)無法提供營養(yǎng)所致。

表4 蚯蚓的適應性

蚯蚓適宜生長在溫度5～35 ℃、濕度60%～80%、pH值為5～9的環(huán)境中[15,22]。B、C都滿足此條件，但蚯蚓的飼喂效果差異較大。除了物化指標，氣味也是影響蚯蚓生存的重要因素。雞糞中主要釋放的是NH3，NH4+-N是影響NH3釋放的因素，雖然從數值上來說3組處理NH4+-N含量都在腐熟范圍內，但是仍對蚯蚓存活有較大影響。有研究發(fā)現，NH4+-N含量過高會對蚯蚓生長產生抑制作用，腐熟雞糞NH4+-N含量為165.8 mg·kg-1，不會影響蚯蚓正常生長，具體含量上限還有待進一步研究[23]。結合2.2節(jié)分析可知，雞糞腐熟程度越高，刺激氣味越小，蚯蚓適應性越強。

2.3.2蚯蚓存活率

“大平二號”蚯蚓的生長周期為30 d，由于在實驗室已經飼喂過一定時間，所以選用21 d作為試驗的總天數。蚯蚓存活率見圖2。

A、B、C分別表示初始C/N比為20、25、30的試驗組； D、E、F分別表示純雞糞、鋸末、花園泥土。

到第21天，A、B 2組蚯蚓的存活率逐漸降低，其中第14天(A：28.00%，B：28.00%)和第21天(A：50.00%，B：49.33%)變化不大(P>0.05)，說明蚯蚓對惡劣環(huán)境有一定適應性；C組存活率最高，可達99.66%，與對照組F(100.0%)差異不大(P>0.05)；D組的存活率為0，說明蚯蚓對純雞糞的耐受性最低，無法存活；E組為鋸末，主要作用是證明雞糞中添加的鋸末不是A、B組蚯蚓死亡的原因。

2.3.3蚯蚓體重增長率

蚯蚓的體重增長率如圖3所示。在第21天，A、B組存活的蚯蚓體重增長率分別為6.22%、12.32%，C組的增長率達38.04%。

A、B、C分別表示初始C/N比為20、25、30的試驗組； D、E、F分別表示純雞糞、鋸末、花園泥土。

蚯蚓在沒有養(yǎng)分的鋸末中存活7 d時體重沒有變化，在第14和第21天體重分別下降6.01、8.23%。F組蚯蚓第7～14天體重無變化，可能是靠泥土中少量的營養(yǎng)維持生長，第21天蚯蚓體重下降5.07%。綜合前文分析，蚯蚓在腐熟度較高的雞糞中適應性和生長狀況最好，且試驗結束時只有C組產生蚓繭，楊世關等[23]的研究中也有類似現象。

2.4 重金屬

2.4.1蚯蚓和雞糞重金屬含量變化分析

如表5所示，將試驗結束時蚯蚓體內不同重金屬含量、總量與初始值進行對比，只有As、Cd含量增加。重金屬通過攝食進入蚯蚓體內，為維持細胞內金屬離子的穩(wěn)態(tài)，蚯蚓體內形成金屬硫蛋白，與一些重金屬離子結合的同時富集在蚯蚓體內。部分研究顯示金屬硫蛋白水平的逐漸增加與蚯蚓內臟中的金屬積累成正比[24-27]。從富集系數大小看，該試驗中重金屬含量Cd>Cu>As>Cr>Zn，這與黃煒等[28]的研究(Cr>Cd>Zn>Cu>As)不一致。不僅蚯蚓體重增長可影響重金屬含量變化，當環(huán)境中重金屬含量低于蚯蚓體內時，可能也無法促進蚯蚓產生更多金屬硫蛋白。Zn、Cu在蚯蚓體內的減少量(減少約50%)小于Cr，也能說明含量對富集系數的影響。

表5 蚯蚓飼喂前后、雞糞和蚯蚓糞中重金屬含量

雞糞中重金屬并不能被蚯蚓和微生物降解(由表5中蚯蚓和雞糞總量之和可知)，經過蚯蚓處理后，營養(yǎng)物質被分解，雞糞總量減少(干重減少31.38%)，重金屬總量不變，形成濃縮效應，導致相對含量增加[29]。蚯蚓雖然能富集一部分重金屬，但量太少不足以影響試驗結果。腐熟雞糞中Cd、Hg、Pb這3種重金屬含量始終低于0.1 mg·kg-1，說明雞糞中這3種物質含量很少，經過濃縮后變化也不大。

2.4.2重金屬對蚯蚓和蚓糞利用的影響

蚯蚓常用作蛋白補充飼料，根據GB 13078—2017《飼料衛(wèi)生標準》，As、Pb、Hg、Cd、Cr含量在飼料中的最高限值分別為40、40、0.5、75、20 mg·kg-1。由表5可知，經過發(fā)酵雞糞飼養(yǎng)后的蚯蚓體內重金屬As含量超標，蚯蚓不能直接作為飼料產品和單一原料加工使用。

經過蚯蚓處理后的雞糞，如果作為有機肥商品，應該符合NY 525—2012標準。此標準要求As、Pb、Hg、Cd、Cr的含量必須分別低于15、2、50、3、150 mg·kg-1，如果直接還田需滿足GB/T 25246—2010《畜禽糞便還田技術規(guī)范》，As、Cu、Zn 含量必須分別低于50、800和3 400 mg·kg-1，在這2種條件下As都超標。

根據以上分析可知，影響蚯蚓和蚯蚓糞后續(xù)使用的問題主要是As含量超標。雞飼料中的藥物添加劑是雞糞中As的主要來源，可通過減少使用或者用其他藥物替代的方法降低雞糞中As含量。

2.5 抗生素對蚯蚓的影響

2.5.1抗生素對蚯蚓的急性毒性

目前國內尚無獸藥對蚯蚓的急性毒性評價標準，參考GB/T 31270.15—2014，100 mg·kg-1含量條件下蚯蚓未見死亡，試驗則無需繼續(xù)。該試驗抗生素含量在0.01～100 mg·kg-1范圍內，并未見蚯蚓死亡，3種獸藥應屬于低級毒。試驗結果說明，3種抗生素對蚯蚓存活率并無明顯影響，蚯蚓不僅具有多功能的解毒防御系統(tǒng)，長期暴露于污泥和雞糞中的蚯蚓腸道內還會出現抗生素耐藥基因(ARGS)[30-31]?？股貙︱球镜亩拘耘c劑量有關，許多關于抗生素對蚯蚓的毒性試驗都是采用試紙接觸法，試驗過程中蚯蚓與抗生素溶液接觸時間長、面積大。該試驗以雞糞為接觸媒介模擬自然養(yǎng)殖條件，驗證蚯蚓處理雞糞的可行性，蚯蚓與抗生素直接接觸時間和面積都較少[32-33]?？股貙︱球镜穆远拘院托罘e毒性有待進一步研究。

2.5.2抗生素對蚯蚓產蚓繭數的影響

如表6所示，試驗結束時蚯蚓在不同含量抗生素條件下生長1個周期后都會產生蚓繭，且各組之間產生的蚓繭數量差異性不顯著(P>0.05)。試驗過程中蚯蚓也未出現不適狀況，初步判斷試驗中3種抗生素對蚯蚓產蚓繭數無明顯影響。

表6 不同含量抗生素作用下蚯蚓產蚓繭數

3 結論

(1)初始C/N比為30的試驗組雞糞發(fā)酵結束后腐熟度較高，飼喂蚯蚓的存活率和增長率較高。

(2)腐熟雞糞中高含量的As易引起蚯蚓富集，蚯蚓糞中As濃縮積累，不利于后續(xù)利用。

(4)推廣腐熟雞糞養(yǎng)殖蚯蚓是可行，潛在問題主要在于雞糞中As含量過高，建議減少As類藥物的使用，尋找相同藥效物品替代。