馬靖宇，朱玉峰，白 光

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121000)

結(jié)直腸癌已成為近幾十年來最常見的癌癥之一。它已成為全球第四大致命癌癥。由于生活方式和飲食行為的變化，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在中國迅速增長，2012年全世界診斷出大腸癌136萬例，中國確診25.3萬例(占18.6%)，中國是世界上結(jié)直腸癌新病例最多的國家，大腸癌已成為中國居民健康的嚴(yán)重威脅[1]。手術(shù)是非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的主要治療方法。盡管治療取得了重大進展，但結(jié)直腸癌的病死率仍然很高，并且有40%～50%的患者最終因疾病而死亡[2]。結(jié)直腸癌的早期診斷尤為重要。但是，由于早期結(jié)直腸癌患者缺乏特定癥狀，而且大多數(shù)地區(qū)尚未完成對結(jié)直腸癌的篩查，因此很難及早診斷。發(fā)現(xiàn)時超過60%的結(jié)直腸癌病例已經(jīng)發(fā)展到晚期，且大多已轉(zhuǎn)移，存活率為8%～9%[3]。因此，開發(fā)無創(chuàng)且準(zhǔn)確的篩查工具以促進結(jié)直腸癌的早期檢測和精確分期非常重要。迄今為止，基因組學(xué)的生物標(biāo)志物被認(rèn)為是一種有前途的方法，可以發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物來監(jiān)測腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后，從而進一步確保所有患者都得到適當(dāng)?shù)闹委?。這項研究利用生物信息學(xué)分析確定了一個具有潛在臨床應(yīng)用價值的靶基因，結(jié)合組織芯片和免疫組化技術(shù)，比較靶基因在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中的表達情況，并評估靶基因在結(jié)直腸癌患者中的預(yù)后意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究共選取了2015年1月1日—2019年1月31日期間在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬一院普外科因原發(fā)性結(jié)直腸癌接受手術(shù)治療的230例病例的結(jié)直腸癌組織和相鄰的癌旁組織。所有患者術(shù)前未接受化療和/或放療，術(shù)后生存超過30 d，且癌癥是直接的死亡原因，均接受了門診或電話隨訪，可獲得完整的隨訪數(shù)據(jù)。中位隨訪時間為735.5 d。根據(jù)第七版AJCC TNM分期系統(tǒng)對腫瘤分期進行分類。該研究得到了錦州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)且所有患者均簽署了知情同意書。使用福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片的供體組織塊制備人結(jié)直腸癌組織微陣列。

1.2方法

1.2.1GEO數(shù)據(jù)集的選擇 選擇GEO數(shù)據(jù)庫中的四個數(shù)據(jù)集(GSE113513，GSE32323，GSE75548和GSE25071)合并了134個樣本的數(shù)據(jù)，并進行分析識別出總共89個差異表達基因(DEGs)(|logFold2 change|≥ 1且P<0.05)。本研究數(shù)據(jù)的篩選條件如下：①以人類與結(jié)直腸癌作為關(guān)鍵詞；②數(shù)據(jù)集為全基因組RNA表達譜數(shù)據(jù)；③僅包括結(jié)直腸癌組織和配對的癌旁組織的全基因組微陣列，并且樣本量均>10。④基因組微陣列僅使用細(xì)胞系，并分析了不同的組織學(xué)亞型，但不包括非癌性組織。

1.2.2生物信息學(xué)分析 蛋白互相作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)分析是使用檢索相互作用基因的搜索工具(STRING)進行的，并根據(jù)官方指南通過Cytoscape軟件進行可視化[4]。使用Oncolnc工具在線評估候選基因的表達與結(jié)直腸癌預(yù)后之間的相關(guān)性。從癌基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中獲得結(jié)直腸癌患者的臨床資料并通過基因表達增強交互式分析(GEPIA)確定驗證靶基因的表達水平。使用GSEA工具在基因本體論的生物學(xué)過程中進行了富集分析，選取靶基因顯著相關(guān)通路，以闡明靶基因表達對結(jié)直腸癌生物學(xué)途徑和過程的影響[5]。納入標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05和FDR q<0.05。

1.2.3模具蠟塊的制作 在模具蠟塊上打出間距為0.1 mm，直徑為0.6 mm的小孔，樣本蠟塊根據(jù)HE染色觀察選定并分別在HE染色切片和相應(yīng)石蠟組織塊標(biāo)記取樣組織位點，用內(nèi)徑0.6 mm的不銹鋼針進行穿刺，深度為2～3 mm，然后將其固定于模具蠟塊的小孔內(nèi)，將模具蠟塊以4 μm厚度切片敷貼于載玻片上，制成組織微陣列。制備好的組織微陣列用于后續(xù)的免疫組織化學(xué)分析。

1.2.4免疫組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)染色根據(jù)制造商提供的方法用含有10%正常血清和1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的三乙醇胺緩沖鹽水溶液(tris buffered saline,TBS)溶液封閉2 h后，將組織微陣列與SERPINE1一抗(1∶200稀釋，ab125687，Abcam，中國)在4℃孵育過夜，并進行第二次標(biāo)記，抗體在室溫下放置1 h。液體DAB底物在室溫下染色10 min。在顯微鏡下觀察標(biāo)記細(xì)胞的信號，并由兩名對研究的臨床病理因素不知情的獨立研究人員進行評估。根據(jù)視覺免疫反應(yīng)評分(immunoreacetive，IRS)=染色強度(IS)乘以陽性面積(AP)來判斷結(jié)果。IS分為：0(負(fù))，1(弱)，2(中)和3(強)。AP取決于陽性細(xì)胞的百分比：0(0)，1(<1/3)，2(1/3～2/3)，3(≥2/3)。IRS 0～1為“-”，IRS 2～3為“ +”，IRS 4～6為“ ++”，IRS 6～9為“ +++”。因此，SERPINE1的表達分為兩類：高水平(IRS 4～9)和低水平(IRS 0～3)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。通過Pearson卡方檢驗評估SERPINE1的表達與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。使用Cox風(fēng)險回歸模型通過單因素和多因素分析評估SERPINE1的表達在結(jié)直腸癌中的預(yù)后價值。通過Kaplan-Meier方法估計存活率，并通過對數(shù)秩檢驗進行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)直腸癌的生物信息學(xué)分析 在GEO數(shù)據(jù)庫中選擇了四個合格數(shù)據(jù)集GSE113513，GSE32323，GSE75548和GSE25071，并在重疊部分中鑒定了89個差異表達基因，見圖1。使用STRING在線數(shù)據(jù)庫分析DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，識別結(jié)直腸癌進展中的關(guān)鍵基因及其相互作用，并使用Cytoscape軟件將其可視化，該網(wǎng)絡(luò)包含106個節(jié)點和466個邊緣，見圖2。選擇MOCE插件來完成PPI網(wǎng)絡(luò)的k核分析并將k-core閾值設(shè)置為2，總共獲得了A、B和C三個模塊，它們的節(jié)點數(shù)分別為15、16和9。在這三個模塊中，節(jié)點度最高的五個基因是CCNB1、RFC2、EXOSC5、P2RY14和SERPINE1。為了研究這五個候選基因是否與結(jié)直腸癌患者的生存相關(guān)，使用Oncolnc工具在線分析了來自TCGA數(shù)據(jù)庫的結(jié)直腸癌患者的基因表達數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。根據(jù)Kaplan-Meier生存分析，見圖3，高CCNB1水平與更好的總體生存率顯著相關(guān)(logrankP=0.013 7)，而低SERPINE1水平與更好的總體生存率顯著相關(guān)(logrankP=0.032 5)，表明CCNB1和SERPINE1表達可能與結(jié)直腸癌的進展有關(guān)。但是在RFC2、EXOSC5和P2RY14中沒有發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。選擇癌基因數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中SERPINE1的表達增加，見圖4。使用TCGA進行了基因集富集分析(GSEA)鑒定SERPINE1基因的潛在功能。在GSEA分析中，與癌癥相關(guān)的信號通路包括通過核轉(zhuǎn)錄因子κB的腫瘤壞死因子α信號(NES=1.84)和WNT BETA CATENIN信號(NES=1.84)在 SERPINE1的高表達水平樣本中最常見(P<0.05，F(xiàn)DR q<0.05)，并且SERPINE1表達較高的樣本中血管生成(NES=1.94)和炎癥反應(yīng)(NES=2.10)的基因特征比SERPINE1表達較低的樣本更活躍(P<0.05，F(xiàn)DR q<0.05)，見圖5。這表明SERPINE1可能通過參與結(jié)直腸癌患者的幾種癌癥相關(guān)信號通路來促進疾病進展。

圖1 差異表達基因的維恩圖

圖2 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

Figure 3 Draw the overall survival map of candidate genes from Oncolnc database

圖4 SERPINE1在大腸癌和正常組織中的表達差異

圖5 基因集富集分析

2.2SERPINE1基因在結(jié)直腸癌中高表達 應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析了包括230例大腸癌組織在內(nèi)的組織芯片來研究SERPINE1在結(jié)直腸癌中的表達。SERPINE1的陽性染色主要分布在結(jié)直腸癌組織的細(xì)胞質(zhì)中。在結(jié)直腸癌組織和正常組織中SERPINE1的代表性免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在230例大腸癌中，有134個(58.3%)結(jié)直腸癌組織中SERPINE1的表達較高，而其他96例(41.7%)則較低。統(tǒng)計分析表明，SERPINE1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織。見圖6。

圖6 在結(jié)直腸癌樣品和相應(yīng)正常組織中SERPINE1表達的代表性免疫組織化學(xué)圖像(免疫酶標(biāo)法 ×200)

2.3結(jié)直腸癌SERPINE1表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 SERPINE1的表達在不同浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠處轉(zhuǎn)移和不同TNM分期組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、分化和組織學(xué)類型上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 結(jié)直腸癌患者SERPINE1表達與臨床參數(shù)的相關(guān)性

2.4SERPINE1的高表達預(yù)示結(jié)直腸癌患者的預(yù)后不良 以大腸癌患者預(yù)后為因變量，以SERPINE1表達、性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、分化程度、組織學(xué)類型、T分期、N分期、M分期、TNM分期為自變量，采用單因素分析，結(jié)果顯示浸潤深度(P=0.035)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)，遠處轉(zhuǎn)移(P=0.015)，TNM分期(P=0.001)和SERPINE1表達(P=0.002)對整體生存有重大影響，見表2，3。以大腸癌患者預(yù)后為因變量，以SERPINE1表達、T分期、N分期、M分期、TNM分期為自變量，采用多因素分析，結(jié)果顯示SERPINE1表達是結(jié)直腸癌患者的獨立預(yù)后因素(P=0.020)，見表2，4。通過Kaplan-Meier生存分析評估總體生存率(overall surviva,OS)，并通過對數(shù)秩檢驗進行比較，顯示SERPINE1表達高的患者比SERPINE1表達低的患者的OS差(P=0.002)。見圖7。

表2 變量賦值表

表3 單因素Cox回歸分析結(jié)果

表4 多因素Cox回歸分析結(jié)果

圖7 結(jié)直腸癌患者不同SERPINE1表達的總體生存分析

3 討 論

利用生物信息學(xué)方法篩選出CCNB1和SERPINE1表達可能與結(jié)直腸癌的進展有關(guān)。已有研究表明，CCNB1在結(jié)直腸癌發(fā)展的早期階段過表達并促進細(xì)胞增殖，而且結(jié)直腸癌中CCNB1的過表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期和不良生存率呈負(fù)相關(guān)[6-7]。但尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于SERPINE1表達在大腸癌中意義的研究。Serpin家族E成員1(SERPINE1)，也稱為纖溶酶原激活物抑制劑1。許多研究表明，SERPINE1在各種癌癥的多步過程中起著至關(guān)重要的作用。此外，有幾項基因表達研究已將SERPINE1鑒定為與轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要基因。Pavon等[8]報道，在頭頸癌中，SERPINE1的過表達促進腫瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移擴散，促進血管生成，保護細(xì)胞免受Fas/Fas-L介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并與不良預(yù)后相關(guān)。Liao等[9]證明胃癌組織中SERPINE1明顯上調(diào)，而且SERPINE1高表達與不良生存相。Wu等[10]報道神經(jīng)膠質(zhì)瘤中過表達的SERPINE1誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，SERPINE1的作用可能基于調(diào)節(jié)p53信號通路。SERPINE1在多種腫瘤中起作用。然而，SERPINE1在大腸癌中的異常表達及其臨床意義尚未在大規(guī)模臨床樣品中得到證實。在這項研究中，我們通過生物信息學(xué)和免疫組織化學(xué)證實了SERPINE1在大腸癌患者中的臨床意義。與正常組織相比，SERPINE1在結(jié)直腸癌患者中顯著上調(diào)。另外，SERPINE1的高表達與結(jié)直腸癌的浸潤深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析表明，SERPINE1高表達的患者比低表達的患者的生存時間明顯縮短。Cox多因素分析表明，SERPINE1的高表達是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素。因此，可確定SERPINE1的高表達增加了轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，并且為預(yù)后不良的標(biāo)志。

SERPINE1是尿激酶和組織型纖溶酶原激活劑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。尿激酶纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)系統(tǒng)在腫瘤生長，血管生成，腫瘤細(xì)胞入侵，遷移和轉(zhuǎn)移中起主要作用[11]。uPA系統(tǒng)通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinase，MMP)和潛在的生長因子來調(diào)節(jié)腫瘤血管生成和運動[12]。GSEA分析表明，在SERPINE1高表達的結(jié)直腸癌樣本中，血管生成尤其顯著，這表明SERPINE1基因可能通過調(diào)節(jié)uPA來調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，從而有助于癌癥的發(fā)展。在結(jié)直腸癌中，β-catenin途徑的激活有助于uPA的反式激活[13]。通過多種癌基因的轉(zhuǎn)錄激活，WNT/β-catenin途徑被認(rèn)為是癌癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[14]。同時，在此研究中，GSEA分析表明，在SERPINE1高表達的結(jié)直腸癌組織中，與Wnt/β-catenin途徑相關(guān)的基因豐富，這表明SERPINE1可能通過Wnt/β-catenin途徑參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

結(jié)合免疫組織化學(xué)結(jié)果和生存分析，推測SERPINE1可能在結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。GSEA分析表明，結(jié)直腸癌患者中炎癥反應(yīng)與SERPINE1的高表達密切相關(guān)。炎癥反應(yīng)在腫瘤的發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[15]。炎癥浸潤產(chǎn)生的活性氧被認(rèn)為是異常增生的原因，活性氧會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致癌癥[16]。腫瘤浸潤的骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，例如腫瘤壞死因子，它激活髓樣細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子κB并刺激腫瘤相關(guān)的炎癥，腫瘤壞死因子激活轉(zhuǎn)化后的結(jié)腸上皮細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子κB信號傳導(dǎo)并促進其存活和增殖[17]。同時，在該研究中，GSEA分析表明與核轉(zhuǎn)錄因子κB的腫瘤壞死因子α信號相關(guān)的基因在高表達SERPINE1的結(jié)直腸癌樣本中富集。以上所有結(jié)果提示SERPINE1可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，并可能通過參與腫瘤壞死因子α信號通路和Wnt信號通路而影響結(jié)直腸癌的預(yù)后。因此，深入研究結(jié)直腸癌中SERPINE1和SERPINE1途徑之間的關(guān)系將有助于結(jié)直腸癌的研究。

綜上所述，本研究證實了SERPINE1在結(jié)直腸癌中的臨床意義。免疫組化結(jié)果表明，SERPINE1在結(jié)直腸癌中表達上調(diào)，SERPINE1的高表達與腫瘤的侵襲性，疾病的進展和不良的預(yù)后密切相關(guān)。生物信息學(xué)分析也支持SERPINE1的高表達參與了結(jié)直腸癌的發(fā)病機制，且預(yù)后較差。本研究為SERPINE1用作人類結(jié)直腸癌有前景的治療靶標(biāo)和新的預(yù)后生物標(biāo)志物提供了重要的新證據(jù)。