向 琴，蔣宛瑾，喻 嶸*，吳勇軍，尹業(yè)師，劉 秀，蘇麗清，肖 凡，劉 旭

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208；2.湖南科技學院，湖南 永州425199）

隨著經濟的快速發(fā)展，糖尿病(diabetes mellitus,DM)的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內急劇上升。 其中2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)占DM 總發(fā)病率的90%左右[1]。 胰島素(insulin, INS)分泌不足是T2DM 發(fā)病主要因素之一。 胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1, GLP-1)由腸道L 細胞分泌，作為主要的促胰島素激素，可調節(jié)葡萄糖誘導的胰腺細胞INS 分泌[2]。目前，促進腸道內源性促胰島素激素的分泌已成為治療T2DM 的有效策略[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，L 細胞功能障礙可導致血漿中GLP-1濃度下降，其原因與線粒體應激反應有關，細胞中ATP 生產過剩從而導致線粒體應激，產生超氧化物（ROS），影響L 細胞功能。因此，平衡ATP 生產，抑制線粒體應激反應，降低ROS 生成，是改善L 細胞功能的重要途經。 而AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）作為協(xié)調代謝和能量的重要蛋白激酶，不僅能抑制ROS，而且能抑制腸道炎癥和調節(jié)腸道激素分泌[6-7]。 另一方面，解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2, UCP2) mRNA 在胃腸道中高表達[8-9]，并能負性調節(jié)GLP-1 分泌[10]。 前期研究發(fā)現(xiàn)[11]，白虎加人參湯能有效降低小鼠血糖水平，改善腸道炎癥反應，但其降糖和調節(jié)炎癥機制尚未完全闡明。本研究采用T2DM MKR 小鼠模型，通過觀察白虎加人參湯干預前后小鼠血糖代謝和GLP-1 水平變化，檢測小鼠結腸組織UCP2 和AMPK 表達水平，觀察小鼠結腸組織形態(tài)變化，為其治療T2DM 提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

采用8 周齡雄性MKR 小鼠。 MKR 小鼠為2 型糖尿病較好的轉基因動物模型，由美國國立衛(wèi)生研究院Dr. LeRoith 等[12]于2001 年建立并饋贈引進，是骨骼肌特異性胰島素樣生長因子-1 受體功能缺失的非肥胖型小鼠。 空白組為FVB 小鼠，雄性，8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2016-0006。

1.2 主要藥物

白虎加人參湯由知母18 g，石膏50 g，炙甘草6 g，粳米9 g，人參10 g 組成，飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，由湖南中醫(yī)藥大學藥學院吳勇軍副教授鑒定為正品。先用清水浸泡飲片30 min，煎煮2 次，合并兩次濾液，最終濃縮至含生藥量2 g/mL。

1.3 主要試劑和儀器

INS、GLP-1 ELISA 試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；RNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；逆轉錄試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；P-AMPK α 抗體、UCP2 抗體（英國Abcam公司）；PIKO REAL 96 熒光定量RCP 儀(美國Thermo 公司)；Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司）；Nikon 生物光學顯微鏡(日本尼康株式會社)。

1.4 動物分組及給藥

參考前期研究[11]，高脂喂養(yǎng)4 周后，MKR 小鼠隨機分為3 組：模型組、白虎加人參湯高劑量組、白虎加人參湯低劑量組，每組8 只?？瞻捉M：FVB 小鼠，8 只。白虎加人參湯低、高劑量組給藥劑量按小鼠與人體表面積的等效劑量折算法：折算臨床劑量為13.5 g/kg，定為低劑量；4 倍臨床劑量定為高劑量，即54 g/kg。模型組和空白組給與等體積蒸餾水，每日灌胃1 次，連續(xù)給藥4 周。

2 方法

2.1 FBG、INS 及GLP-1 的測定

各組小鼠于末次給藥物后，禁食不禁水12 h，尾靜脈取血，用血糖儀進行空腹血糖（fasting blood glucose,FBG)檢測；眼球采血后置于EP 管中，靜止4 h，隨后3 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清，采用ELISA方法檢測INS、GLP-1 的血清含量。

2.2 結腸組織病理形態(tài)觀察

取結腸組織，4%多聚甲醛固后進行脫水、石蠟包埋、切片、貼片，行常規(guī)HE 染色，顯微鏡下觀察結腸組織病理形態(tài)。

2.3 RT-qPCR 檢測腸道AMPK、UCP2 mRNA 相對表達量

結腸組織勻漿后，Trizol 提取組織總RNA。引物序列由上海生工合成，β-actin 為內參基因。AMPK：正向引物5’-CGGGGTCATTCTCTATGCTT-3’；反向引物5’-TTTAAACCACTCGTGTTCCCT-3’，片段長度208 bp；UCP2：正向引物5’-AAAGCAGCCTCCAGAACTCC-3’；反向引物5’-ATTCTGATTTCCTGCTACCTCC-3’，片段長度110 bp；β-actin：正向引物5’-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3’；反向引物5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’， 片段長度223 bp。 使用SYBR 法進行實時定量，反應條件為95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)。 采用2-ΔΔCt方法計算各組小鼠腸道AMPK、UCP2 mRNA 相對表達水平。

2.4 Western blot 法檢測腸道P-AMPK α、UCP2 蛋白表達

提取結腸組織總蛋白后，電泳分離蛋白，將蛋白轉移到NC 膜后，浸入5%脫脂奶粉過夜。 次日室溫放置30 min，加入一抗（P-AMPK α，1∶1 000 稀釋；UCP2，1∶500 稀釋；β-actin，1∶5 000 稀釋），室溫孵育90 min，洗膜3 次除去過量的一抗稀釋液，再加入HRP標記的山羊抗小鼠二抗，室溫孵育90 min，再次洗膜后，進行化學發(fā)光反應。 采用quantity one 專業(yè)灰度分析軟件進行分析，將目的蛋白與內參的灰度值的比值作為蛋白的表達值進行統(tǒng)計分析。

2.5 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用“±s”表示，使用單因素方差分析比較各組間差異，方差齊時使用LSD 檢驗法進行兩兩比較，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 白虎加人參湯對MKR 小鼠FBG、INS 及GLP-1的影響

模型組FBG 和INS 水平顯著高于空白組(P＜0.01)，白虎加人參湯治療后，中藥高劑量組和低劑量組較模型組FBG 和INS 水平均顯著降低(P＜0.01)，且低劑量組降低INS 血清水平更為顯著，兩組間比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。 從GLP-1 血清濃度來看，模型組明顯低于空白組(P＜0.01)，而白虎加人參湯高劑量組和低劑量顯著提高了血清中GLP-1濃度(P＜0.01，P＜0.05)。 見圖1。

3.2 白虎加人參湯對MKR 小鼠結腸病理形態(tài)的影響

觀察到MKR 小鼠黏膜表面上皮層減少、脫落，炎性細胞浸潤，以及粘膜層厚度不均勻（圖2），而白虎加人參湯可改善MKR 小鼠的上述形態(tài)變化，使得黏膜變得厚度均勻而完整。

3.3 白虎加人參湯對MKR 小鼠結腸AMPK、UCP2 mRNA 表達的影響

與空白組比較，模型組AMPK mRNA 表達顯著降低（P＜0.01），而UCP2 mRNA 表達升高顯著（P＜0.01）。與模型相比，白虎加人參湯高劑量組和低劑量組顯著上調了AMPK mRNA 的表達（P＜0.01）；顯著下調UCP2 mRNA表達(P＜0.01)，白虎加人參湯高劑量組稍優(yōu)于低劑量組，但無統(tǒng)計學意義。 見圖3。

圖1 白虎加人參湯對MKR 小鼠血清中FBG、INS 及GLP-1 水平的影響

圖2 白虎加人參湯對MKR 小鼠結腸病理形態(tài)的影響(HE 染色，×100)

圖3 白虎加人參湯對MKR 小鼠結腸組織UCP2、AMPK mRNA 相對表達量的影響

3.4 白虎加人參湯對MKR 小鼠結腸P-AMPK α、UCP2 蛋白表達的影響

模型組結腸UCP2 蛋白表達較空白組顯著上升(P＜0.01)，而P-AMPK α 蛋白表達較空白組顯著下降(P＜0.01)。白虎加人參湯高劑量組和低劑量組干預后，不僅顯著上調P-AMPK α 蛋白表達(P＜0.01)，而且顯著下調UCP2 蛋白表達(P＜0.05)，但白虎加人參湯高劑量組和低劑量組之間無明顯差異。見圖4。

4 討論

圖4 白虎加人參湯對MKR 小鼠結腸組織UCP2、P-AMPKα 蛋白表達的影響

糖尿病因其發(fā)病年輕化、病因復雜、病程長且難治愈等特點，已經嚴重威脅人類健康。 GLP-1 是腸道L細胞分泌的具有葡萄糖依賴性促胰島素分泌功能的腸促胰島素[13]。 因其不僅能刺激胰島β 細胞呈葡萄糖依賴性地分泌INS，還能調節(jié)胰島β 細胞的增殖和抗凋亡，且具有低血糖發(fā)生率較低等優(yōu)點，已成為目前降糖藥物研究最具潛力的作用靶點之一[14]。據(jù)報道[10，15]，腸道L 細胞的UCP2 與GLP-1 分泌密切相關，腸黏膜細胞內UCP2 升高可能是腸源性GLP-1 分泌的負調節(jié)因子。 另有研究發(fā)現(xiàn)，導致血漿GLP-1 下降機制的主要原因是L 細胞功能障礙[4]。細胞中ATP 生產異常和ROS 的產生，可能影響L細胞分泌功能[5，16-17]。 而AMPK 不僅能改善炎癥，還能通過上調UCP2 的表達激活線粒體解耦聯(lián)，從而降低線粒體ROS 的產生[18]。 除此之外，AMPK 的激活還能促進線粒體合成，增加線粒體數(shù)量，從而改善細胞能量代謝功能。由此可見，腸道UCP2 和AMPK的表達與L 細胞分泌GLP-1 關系密切，可能是促進GLP-1 分泌防治T2DM 的重要靶點。

糖尿病屬中醫(yī)學“消渴”范疇。 白虎加人參湯由知母、石膏、炙甘草、粳米、人參組成，為漢代張仲景創(chuàng)立，是治療肺胃熱盛，津氣兩傷的“消渴”經方，具有清熱益氣、生津止渴的功效。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)[11]，白虎加人參湯能顯著改善MKR 小鼠糖代謝和胰島素抵抗，降低血清中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平，并能上調結腸組織中ZO-1、Claudin-1、Occludin的表達，重建腸道黏膜完整性。 通過本次實驗發(fā)現(xiàn)，白虎加人參湯不僅能不同程度地降低血糖，還能顯著增加GLP-1 在血清中的含量。為了進一步了解白虎加人參湯降糖和促GLP-1 分泌機制，我們觀察了各組小鼠結腸組織形態(tài)、結腸組織UCP2 和AMPK mRNA和蛋白的表達水平。 結果顯示，白虎加人參湯顯著下調結腸組織中UCP2 mRNA 和蛋白的表達，且上調AMPK mRNA 和蛋白的表達，并能使結腸黏膜層變得厚度均勻而完整，促進腸道細胞黏液物質的分泌。

綜上所述，白虎加人參湯能顯著降低T2DM MKR小鼠的FBG 水平，提高血清GLP-1 的濃度，上調結腸組織中UCP2 和AMPK 的mRNA 和蛋白表達水平。 提示白虎加人參湯促進MKR 小鼠GLP-1 分泌的作用機制之一，可能與腸道UCP2 和AMPK 的水平有關。 當然，其促進GLP-1 分泌的機制可能是多方面、多層次、多環(huán)節(jié)的結果，因此，還需對白虎加人參湯降糖和促GLP-1 分泌的具體機制進行進一步的研究和探討。