葛祥偉 張智博 智曉玉 汪進(jìn)良

肺癌是目前世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤疾病，對人類生命健康造成嚴(yán)重威脅。據(jù)統(tǒng)計，2018年全球約有210萬肺癌新增病例和180萬肺癌死亡病例，發(fā)病率和死亡率居所有癌種中首位[1]。根據(jù)組織學(xué)分型，肺癌可以分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）兩種，其中SCLC和NSCLC分別約占肺癌總數(shù)的15%和85%[2]。盡管臨床診斷和治療手段均有所改善，但由于診斷不及時、受益人群有限、患者耐藥等原因，肺癌的5年生存率仍不樂觀。另外，缺乏相對特異性的腫瘤標(biāo)志物為肺癌的診治及預(yù)后增添了挑戰(zhàn)。因此，有必要深入研究肺癌分子機(jī)制以探尋肺癌潛在的生物標(biāo)志物及治療靶點。

環(huán)狀RNA（circular RNA, circRNA）是一種特殊的內(nèi)源性非編碼RNA。早在20世紀(jì)70年代circRNA就被發(fā)現(xiàn)存在于RNA病毒中[3]。但介于當(dāng)時技術(shù)的局限，circRNA被認(rèn)為是剪接過程的副產(chǎn)物，因而并未受到廣泛關(guān)注[4]。近些年隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，circRNA被大量發(fā)現(xiàn)并逐漸成為RNA領(lǐng)域的研究熱點。目前，諸多研究證實circRNA能夠參與肺癌發(fā)生發(fā)展過程的調(diào)控，并有望為肺癌的診斷、治療及預(yù)后提供新思路[5,6]。

1 circRNA的生物學(xué)特性及功能

circRNA是共價閉合的非編碼RNA分子，在真核生物轉(zhuǎn)錄組中廣泛存在。通常根據(jù)circRNA的來源將其分為：外顯子circRNAs（ecRNAs）、內(nèi)含子circRNA（ciRNAs）以及外顯子-內(nèi)含子circRNA（EIciRNAs）[7]。其中以外顯子circRNAs最為常見。與線性RNA不同，circRNA沒有5’端的帽子結(jié)構(gòu)和3’端的多聚腺苷酸尾，能夠抵抗核酸外切酶RNase R的降解，因而circRNA相較于線性RNA穩(wěn)定性好且半衰期更長[8]。研究[9]還發(fā)現(xiàn)，circRNA表現(xiàn)出良好的物種保守性。另外，circRNA的表達(dá)具有組織特異性和發(fā)育階段特異性，提示circRNA可能參與機(jī)體多種病理生理過程的調(diào)控[10]。

circRNA的功能研究多集中在以下幾個方面：①作為分子海綿吸附miRNA。競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）機(jī)制指出具有相同miRNA應(yīng)答元件（miRNA response elements, MREs）的RNA能夠競爭性結(jié)合miRNAs，從而相互調(diào)控影響彼此的表達(dá)[11]。目前，多數(shù)circRNA研究圍繞miRNA分子海綿這一機(jī)制展開；②通過結(jié)合RNA聚合酶II調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄[12]；③與RNA結(jié)合蛋白相互結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用[9]；④翻譯蛋白。例如Yang等[13]發(fā)現(xiàn)Circ-FBXW7編碼蛋白進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤發(fā)生。

2 circRNA與肺癌的診斷

早期且準(zhǔn)確的診斷對肺癌的治療至關(guān)重要。盡管已有多種診斷方法應(yīng)用于臨床，但由于費用、準(zhǔn)確度以及患者接受程度等原因，當(dāng)前的手段仍有改進(jìn)空間。因此對肺癌診斷標(biāo)志物的探索依然很有必要。circRNA具有保守性、穩(wěn)定性、特異性等優(yōu)勢，因而具有成為肺癌新興標(biāo)志物的潛能[14]。一項針對中國肺癌人群的meta分析匯集了8項關(guān)于肺癌組織和血液中circRNA診斷效能的研究顯示，納入的circRNA總靈敏度和特異度分別為0.77和0.76，總受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC）的曲線下面積（area under curve,AUC）為0.78，提示circRNA在中國肺癌人群中具有診斷潛能[15]。

2.1 肺癌組織circRNA的診斷價值 Wang等[16]發(fā)現(xiàn)，在區(qū)分NSCLC和正常組織方面，hsa_circ_0077837和hsa_circ_0001821的AUC分別為0.921和0.863，展現(xiàn)了這兩種circRNA對肺癌的診斷價值。Liu等[17]證實hsa_circ_11780在NSCLC組織和細(xì)胞系中表達(dá)均顯著下降，且低表達(dá)hsa_circ_11780的患者出現(xiàn)較大腫瘤（>3 cm）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和較差生存預(yù)后的風(fēng)險更大。Zhao等[18]對61對配對的肺癌和癌旁組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0037515和hsa_circ_0037516在NSCLC中低表達(dá)，二者的AUC分別為0.81和0.82，同樣表現(xiàn)出較好的診斷能力。而聯(lián)合hsa_circ_0037515和hsa_circ_0037516后的總AUC提升至0.90，提示肺癌組織circRNA聯(lián)合診斷的重要性。

2.2 血液circRNA的診斷價值 相比于傳統(tǒng)活檢，液體活檢具有操作簡單、侵入性小、成本低等優(yōu)點，因此研究前景廣闊。目前已有文獻(xiàn)初步證實血漿circRNA具有較好的診斷能力，如circRNA-002178[19]、circMAN1A2[20]等。Chen等[21]通過高通量測序技術(shù)以識別肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）患者血漿外泌體中差異表達(dá)的circRNA。與對照組相比，105個circRNA表達(dá)升高，78個circRNA表達(dá)降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0001492和hsa_circ_0001346在LUAD早期即表達(dá)明顯上調(diào)，而對照組血漿幾乎檢測不到，提示hsa_circ_0001492和hsa_circ_0001346可能成為早期LUAD診斷候選標(biāo)記物。

Liu等[22]檢測分析hsa_circ_0005962和hsa_circ_0086414在LUAD患者血漿中差異表達(dá)。二者聯(lián)合診斷AUC達(dá)到0.81，提示雙circRNA可能作為診斷LUAD的非侵入性生物標(biāo)志物。另外，血液circRNA可能與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，LUAD患者術(shù)后hsa_circ_0005962表達(dá)較術(shù)前明顯下降。而hsa_circ_0086414的表達(dá)水平與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變相關(guān)。與野生型患者相比，EFGR突變型患者h(yuǎn)sa_circ_0086414高表達(dá)。該研究表現(xiàn)了血液circRNA多方面的應(yīng)用價值。當(dāng)然，為實現(xiàn)血液circRNA肺癌診斷的臨床轉(zhuǎn)化，尚需更大的樣本量以及更為深入的機(jī)制探索。

3 circRNA與肺癌的治療

既往研究發(fā)現(xiàn)circRNA能夠作為調(diào)控分子促進(jìn)或者抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展，因而調(diào)控circRNA的表達(dá)水平對肺癌的惡性生物學(xué)行為具有重要意義。目前，多項研究依據(jù)circRNA的ceRNA機(jī)制進(jìn)行肺癌惡性生物學(xué)行為的機(jī)制探索（表1）。例如，Yao等[23]發(fā)現(xiàn)circGFRA1在肺癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)升高，并通過circGFRA1/miR-188-3p/PI3K/AKT通路促進(jìn)肺癌的惡性增殖。LIMK1作為一種絲蘇氨酸蛋白激酶，通過影響肌動蛋白細(xì)胞骨架參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT），調(diào)控腫瘤進(jìn)程[24]。Qin等[25]發(fā)現(xiàn)circ_0012673在肺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)。circ_0012673海綿吸附miR-320a導(dǎo)致下游靶蛋白LIMK1表達(dá)升高，從而抑制肺癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其增殖、遷移和EMT進(jìn)程。

3.1 circRNA與肺癌耐藥 隨著抗腫瘤藥物的不斷問世，為肺癌患者帶來了更多希望，但是耐藥問題依然是困擾臨床治療的一大難題。因此，亟待對肺癌耐藥機(jī)制進(jìn)行深入探索以探尋高效的生物標(biāo)志物或治療靶點。研究發(fā)現(xiàn)，部分circRNA能夠參與肺癌的耐藥進(jìn)程（表2）。Hong等[44]研究發(fā)現(xiàn)，circCPA4作為let-7的分子海綿，其下調(diào)可以影響程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1,PD-L1）使其表達(dá)降低，進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞的生長、遷移和EMT過程。另外，NSCLC來源的含PD-L1的外泌體能夠促進(jìn)其干細(xì)胞特性，增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞對順鉑的耐受性。Li等[42]報道circ_0002483能夠降低miR-182-5p表達(dá)水平，解除其對靶分子GRB2、FOXO1、FOXO3的抑制，進(jìn)而增強(qiáng)NSCLC對紫杉醇的敏感性。circRNA_103762在肺癌中高表達(dá)，通過抑制靶蛋白CHOP誘導(dǎo)肺癌的多藥耐藥[45]。

3.2 circRNA與肺癌免疫治療 腫瘤細(xì)胞能夠表達(dá)多種機(jī)制來逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，為自身的生長創(chuàng)造條件。程序性死亡受體1（programmed death protein 1, PD-1）是一種跨膜蛋白，已被發(fā)現(xiàn)幾乎表達(dá)于各種類型的腫瘤細(xì)胞表面，并通過于PD-L1相互作用參與腫瘤的免疫逃逸機(jī)制[53]。近些年，以PD-1/PD-L1為靶點的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）為肺癌治療提供了強(qiáng)大武器。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-002178在肺腺癌組織中異常高表達(dá)，通過吸附miR-34促進(jìn)肺癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)。同時，肺癌細(xì)胞能夠分泌外泌體circRNA-002178并傳遞給T細(xì)胞，通過抑制miR-28-5p進(jìn)而促進(jìn)T細(xì)胞PD-1的表達(dá)。文獻(xiàn)[54]證實，CXCR4參與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞耗竭、誘導(dǎo)抗PD-1藥物耐藥等過程。Zhang等[55]發(fā)現(xiàn)circFGFR1/miR-381-3p/CXCR4通路通過促進(jìn)肺癌細(xì)胞對抗PD-1治療藥物的耐藥進(jìn)程，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。提示circRNA能夠參與腫瘤免疫逃逸機(jī)制，相關(guān)通路抑制劑的聯(lián)合使用有望提高臨床療效，為腫瘤的免疫療法提供新的思路。

4 circRNA與肺癌的預(yù)后

肺癌患者的預(yù)后監(jiān)測是評價臨床診療效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對調(diào)整用藥方案、改善患者生存時間有重要意義。研究證實，多種circRNA能夠作為肺癌患者獨立預(yù)后指標(biāo)，與肺癌患者生存期緊密相關(guān)，如circSMARCA5[52]、circ_11780[17]、circCRIM1[37]。Liu等[17]對93例NSCLC患者腫瘤組織進(jìn)行RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)hsa_circ_11780異常低表達(dá)，而低表達(dá)hsa_circ_11780的患者往往腫瘤更大，伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及更嚴(yán)重的腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumornode-metastasis, TNM）分期。以Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析表明低表達(dá)hsa_circ_11780的NSCLC患者總生存期（overall survival, OS）更短。circHIPK3來源于染色體11p13區(qū)的癌基因HIPK3的2號外顯子。Chen等[6]發(fā)現(xiàn)敲低circHIPK3能夠抑制NSCLC細(xì)胞株A549、H838和H1299增殖、遷移、侵襲能力，并誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，而circHIPK3和linHIPK3對自噬的調(diào)控作用相互拮抗，circHIPK3:linHIPK3（C:L）比值能夠反映腫瘤細(xì)胞的自噬水平。對于晚期NSCLC患者來說，高C:L比值（>0.49）又是其低生存率的有效指標(biāo)。這些結(jié)果提示自噬調(diào)節(jié)因子circHIPK3具有作為預(yù)后因子的潛在臨床應(yīng)用價值。

表 1 circRNA通過ceRNA機(jī)制作用于肺癌惡性生物學(xué)行為的總結(jié)Tab 1 Summary of circRNA acting on malignant biological behaviors of lung cancer through ceRNA mechanism

表 2 肺癌circRNA對抗腫瘤藥物敏感性影響的總結(jié)Tab 2 Summary of the effects of circRNA on tumor drug sensitivity

EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKIs）是EGFR敏感突變的NSCLC患者的重要治療選擇。Liu等[56]通過對使用EGFR-TKI吉非替尼后有效組與無效組NSCLC患者血漿circRNA測序，檢測到1,377個差異表達(dá)的circRNA。RT-qPCR檢測證實hsa_circ_0109320與hsa_circ_0134501在吉非替尼有效組中高表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0109320的高表達(dá)與患者更好的無進(jìn)展生存期（progression-free survival,PFS）相關(guān)，提示hsa_circ_0109320可能是反映吉非替尼療效的生物標(biāo)志物。Fu等[57]發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_012515在NSCLC的組織、細(xì)胞尤其是吉非替尼耐藥的細(xì)胞株中表達(dá)顯著升高。另外，hsa_circRNA_012515表達(dá)上調(diào)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)hsa_circRNA_012515的NSCLC患者其OS和PFS更短。研究者還發(fā)現(xiàn)與I期/II期NSCLC患者相比，hsa_circRNA_012515在III期/IV期患者中的表達(dá)水平更高。由此可見，hsa_circRNA_012515具有良好的臨床相關(guān)性，可能是預(yù)測NSCLC患者不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。

5 展望

隨著研究的不斷深入，circRNA與肺癌的聯(lián)系正在日益凸顯。一方面，circRNA作為促癌或抑癌因子調(diào)控肺癌的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、自噬等生物學(xué)行為，調(diào)節(jié)化療或靶向藥物的敏感性以及免疫治療療效，為輔助臨床治療提供初步理論基礎(chǔ)；另一方面，組織或血液中circRNA的差異表達(dá)在肺癌的早期診斷及預(yù)后評估都展現(xiàn)了一定的相關(guān)性，有望成為肺癌潛在的生物標(biāo)志物。但是目前circRNA研究尚處于早期階段，多數(shù)研究者將重點置于miRNA海綿吸附功能探索，許多機(jī)制尚未闡明。其臨床相關(guān)性研究也局限于少量樣本，其轉(zhuǎn)化價值有待商榷。相信未來circRNA領(lǐng)域?qū)懈嗤黄疲瑸榉伟┰\療提供更多思路。