薄永恒，王亮，楊修鎮(zhèn)，魏茂蓮，李有志*

發(fā)酵微生物篩選育種技術(shù)研究概述

薄永恒1，王亮2，楊修鎮(zhèn)1，魏茂蓮1，李有志1*

（1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所/山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250022；2.山東省新泰市畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，山東 新泰 271200）

隨著生命科學(xué)的發(fā)展，微生物與人類的關(guān)系越來(lái)越緊密，特別是發(fā)酵微生物的益處越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。目前發(fā)酵微生物主要應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、能源工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、環(huán)境保護(hù)以及農(nóng)業(yè)方面。因此對(duì)于微生物育種改良，已成為學(xué)者們的研究重點(diǎn)。微生物育種是運(yùn)用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對(duì)某種具有特定生產(chǎn)目的菌種進(jìn)行改造，去除不良特性，提升有益性狀，提高產(chǎn)品產(chǎn)量或發(fā)酵效能的育種方法。本文對(duì)微生物育種技術(shù)進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹，以期對(duì)科學(xué)技術(shù)工作者帶來(lái)啟發(fā)。

1 自然選育

通過(guò)自然發(fā)生的突變和篩選法，篩選那些含有所需性狀得到改良的菌種，酒精發(fā)酵是最早把微生物遺傳學(xué)原理應(yīng)用于微生物育種實(shí)踐而提高發(fā)酵產(chǎn)物水平的一個(gè)成功實(shí)例[1]。自然選育是一種簡(jiǎn)單易行的選育方法，可以達(dá)到純化菌種，防止菌種退化，提高產(chǎn)量的目的，但發(fā)生自然突變的幾率特別低。這樣低的突變率導(dǎo)致自然選育耗時(shí)長(zhǎng)，工作量大，影響了育種工作效率，在這種情況下，出現(xiàn)了誘變育種技術(shù)[2]。

2 誘變育種

誘變育種是以誘變劑誘發(fā)微生物基因突變，通過(guò)篩選突變體，尋找正向突變菌株的一種誘變方法誘變劑有物理誘變劑、化學(xué)誘變劑和生物誘變劑[3]。

2.1 物理因子誘變 （1）物理誘變劑包括紫外線、X射線、γ射線、激光、低能離子等。（2）常用的電離輻射有X射線、γ射線、β射線和快中子等。如γ射線具有很高的能量，能產(chǎn)生電離作用，因而直接或間接地改變DNA結(jié)構(gòu)；電離輻射還能引起染色體畸變，發(fā)生染色體斷裂，形成染色體結(jié)構(gòu)的缺失、易位和倒位等。低能離子注入育種技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的物理誘變技術(shù)，如H+、Ar+、O6+以及C6+。輻射能量大多集中在低能量輻射區(qū)[4]。（3）除此之外，還有微波、雙向復(fù)合磁場(chǎng)、紅外射線、重離子和高能電子流等新誘變技術(shù)，它們與其他誘變?cè)匆黄疬M(jìn)行復(fù)合誘變，能起到很好的誘變效果，因此從某種意義上稱這些誘變?cè)礊椤霸鲎儎盵5]。

2.2 化學(xué)因子誘變 化學(xué)誘變劑是一類能與DNA起作用而改變其結(jié)構(gòu)，并引起DNA變異的物質(zhì)。其作用機(jī)制都是與DNA起化學(xué)作用，從而引起遺傳物質(zhì)的改變?；瘜W(xué)誘變劑包括烷化劑如甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、亞硝基胍、亞硝基乙基脲、乙烯亞胺及氮芥等、天然堿基類似物、脫氨劑如亞硝酸、移碼誘變劑、羥化劑和金屬鹽類如氯化鋰及硫酸錳等。但這些物質(zhì)大多是致癌劑，使用時(shí)必須十分謹(jǐn)慎[6]。

2.3 生物因子誘變 噬菌體、基因誘變劑等點(diǎn)突變技術(shù)在蛋白質(zhì)工程的廣泛應(yīng)用，特定寡核苷酸在突變技術(shù)中起著介導(dǎo)作用，使基因成為一種新的分子水平的生物誘變劑?；蛘T變劑可以是特定的噬菌體，如M13DNA介導(dǎo)的1段寡核苷酸，也可以是喜劇質(zhì)粒DNA PCR介導(dǎo)中作為引物的1段寡核苷酸，也可以是DNA轉(zhuǎn)座子?？梢砸饓A基的取代和斷裂，產(chǎn)生DNA的確實(shí)、重復(fù)和插入等突變。目前認(rèn)為，生物誘變劑按右邊方式可以分為三類：轉(zhuǎn)導(dǎo)誘發(fā)突變、轉(zhuǎn)化誘發(fā)突變和轉(zhuǎn)座誘發(fā)突變。生物誘變劑應(yīng)用面比較窄，因此應(yīng)用受到了限制[7]。

2.4 復(fù)合因子誘變與新型誘變劑 某一菌株長(zhǎng)期使用誘變劑之后，除產(chǎn)生誘變劑“疲勞效應(yīng)”外，還會(huì)引起菌種生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)、孢子量減少、代謝減慢等，這對(duì)生產(chǎn)不利，在實(shí)際生產(chǎn)中多采用幾種誘變劑復(fù)合處理、交叉使用的方法進(jìn)行菌株誘變[8]。近年來(lái)，一些新型誘變劑被開(kāi)發(fā)出來(lái)，并被證明有良好的效果。1996年，離子束誘變用于右旋糖酐產(chǎn)生菌，得到產(chǎn)量提高36.5%的突變株；1999年N2激光輻照谷氨酸產(chǎn)生菌—鈍齒棒狀桿菌，谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率比對(duì)照提高31%.

3 基因重組

基因重組是遺傳的基本現(xiàn)象之一，菌株能夠經(jīng)過(guò)基因重組獲得新的遺傳型，從而獲得具有優(yōu)良性狀的菌種?；蛑亟M是雜交育種的理論基礎(chǔ)，由于雜交育種選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本，所以不論是方向性還是自覺(jué)性，都比誘變育種前進(jìn)了一大步。

3.1 雜交育種 雜交育種往往可以消除某一菌株在誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象，因而是一種重要的育種手段。但雜交育種方法較復(fù)雜，許多工業(yè)微生物有性世代不十分清楚，故沒(méi)有像誘變育種那樣得到普遍推廣和使用。

3.2 原生質(zhì)體融合育種 在工業(yè)微生物育種中，應(yīng)用轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合等重組技術(shù)來(lái)培育應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中的高產(chǎn)菌株的例子還不多見(jiàn)，只是在1978年第二屆國(guó)際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會(huì)上提出了原生質(zhì)體融合后，重組育種技術(shù)才獲得了飛速的發(fā)展。近年來(lái)，滅活原生質(zhì)體融合、離子束細(xì)胞融合、非對(duì)稱細(xì)胞融合以及基因重排分子育種等新方法相繼提出并且應(yīng)用于微生物育種，這是原生質(zhì)體融合技術(shù)的新發(fā)展。

4 代謝控制育種

代謝控制育種興起于20世紀(jì)50年代末，以1957年谷氨酸代謝控制發(fā)酵成功為標(biāo)志，并促使發(fā)酵工業(yè)進(jìn)入代謝控制發(fā)酵時(shí)期。近年來(lái)代謝工程取得了迅猛發(fā)展，尤其是基因組學(xué)、應(yīng)用分子生物學(xué)和分析技術(shù)的發(fā)展，使得導(dǎo)入定向改造的基因及隨后的在細(xì)胞水平上分析導(dǎo)入外源基因后的結(jié)果成為可能[9]。代謝控制育種提供了大量工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)菌種，使得了氨基酸、核苷酸、抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量成倍地提高，大大促進(jìn)了相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

5 基因工程育種

基因工程育種是指利用基因工程方法對(duì)生產(chǎn)菌株進(jìn)行改造而獲得高產(chǎn)工程菌，或者是通過(guò)微生物間的轉(zhuǎn)基因而獲得新菌種的育種方法甚因工程育種是真正意義上的理性選育，按照人們事先設(shè)計(jì)和控制的方法進(jìn)行育種，是當(dāng)前最先進(jìn)的育種技術(shù)[10, 11]。

6 太空育種

由于太空環(huán)境具有超真空、超潔凈、微重力、強(qiáng)輻射等不同的物理、化學(xué)因素，可以利用返回的衛(wèi)星或宇宙飛船將微生物搭載到宇宙空間，利用太空環(huán)境對(duì)微生物進(jìn)行誘變，返回地球后，對(duì)誘變體進(jìn)行選育，獲得新個(gè)體。研究表明，航天誘變可以改良微生物發(fā)酵特性，獲得地面育種難以獲得的突變菌種，有變異幅度大、頻率高、遺傳性能好等特點(diǎn)[12]。

目前，微生物制劑已用于畜牧養(yǎng)殖行業(yè)多個(gè)方面，如用于養(yǎng)殖方面，可以增加豬的產(chǎn)仔率、仔豬成活率，豬牛雞的日增重率，奶牛泌乳量等，提高了養(yǎng)殖效益；飼喂微生物制劑或微生物發(fā)酵的飼料可以增加家畜免疫力，減少了抗生素的使用，符合目前減抗的畜牧行業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)；還可用于畜禽糞水處理，達(dá)到養(yǎng)殖環(huán)保要求。因此，挖掘高效的微生物菌種已是一個(gè)熱門方向，根據(jù)不同微生物菌種特性，利用已有的微生物育種技術(shù)，篩選出高產(chǎn)、高效發(fā)酵菌株，制成的各種菌劑在畜牧行業(yè)具有十分廣泛的需求。

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（2020–07–21）

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