諶偉艷，黃 晟，張 杰，焦海洋，張雪平，許澤英

（江蘇省有色金屬華東地質(zhì)勘查局，江蘇 南京 210000）

土壤主要分布在地球中的巖石圈表面，是全球最大的生態(tài)系統(tǒng)即生物圈的重要組成部分，其質(zhì)量情況對于維護整個生物圈的穩(wěn)定性極其重要[1]。如今由于農(nóng)業(yè)化肥農(nóng)藥的過量使用以及工業(yè)廢水中有毒有害物質(zhì)的不合理排放，導(dǎo)致大量污染物質(zhì)以不同形式侵入我國的土壤資源，造成了我國土壤質(zhì)量的大幅度下滑[2]。土壤質(zhì)量的下滑，不僅影響了巖石圈，并且通過土壤中地表水流入地下水系統(tǒng)中，從而對水圈亦造成嚴(yán)重污染[3]?；谖覈罅客寥蕾Y源被大量污染的現(xiàn)狀，如何修復(fù)受污染嚴(yán)重的土壤資源，應(yīng)當(dāng)作為我國環(huán)境保護部門的首要工作內(nèi)容。據(jù)目前我國環(huán)境保護部門的檢測結(jié)果來看，土壤中氯代有機物的污染情況最為嚴(yán)重，其是由過量使用化肥而造成的一類持久性環(huán)境污染物，其中污染最為嚴(yán)重的氯代有機物為滴滴涕、林丹和六氯苯三種[4]。針對土壤中氯代有機污染物的修復(fù)治理工作，一直以來都是我國環(huán)境保護部門的重點研究課題[5]。土壤修復(fù)技術(shù)按照其工作內(nèi)容可分物理方法、化學(xué)方法和生物方法三大類：其中物理方法主要機械化的熱處理修復(fù)、沖洗修復(fù)，其成本投入普遍偏高；化學(xué)方法則是采用酸堿綜合的原理，應(yīng)用繼續(xù)施用化肥來處理，該方法容易引入新污染物；而生物方法是通過定向引入新物種，實現(xiàn)針對氯代有機污染物的吸收、轉(zhuǎn)化、降解、固定等有效措施，從而降低氯化有機污染物在土壤中的含量；因此相比之下生物修復(fù)技術(shù)被譽為最為節(jié)能且環(huán)保的技術(shù)。在此基礎(chǔ)上，本文引入了一種新型微生物修復(fù)技術(shù)，力爭降低土壤中氯代有機污染物的含量，以下為其具體工作內(nèi)容。

1 新型微生物修復(fù)技術(shù)

1.1 引入新物種

本文所設(shè)計新型微生物修復(fù)技術(shù)的第一步，就是引入新物種，即培養(yǎng)出高效菌株，吸收并轉(zhuǎn)化土壤中氯代有機污染物含量；其主要工作流程如下：首先選擇適應(yīng)菌株挑選的土壤，所選土壤根據(jù)其特征可分為兩類，第一類是從受到氯化有機物污染的土壤；第二類是從受到重金屬污染的土壤中；從而保證其篩選出的微生物菌株具有極其的適應(yīng)能力、繁殖能力以及生存能力。其次就是在正確的土壤環(huán)境下，采用五點取樣法快速且準(zhǔn)確的篩選出優(yōu)質(zhì)菌種；然后為篩選出的菌株配置適宜的平板培養(yǎng)基，進行富集培養(yǎng)；然后將培養(yǎng)到一定程度的菌株，采用多次平板畫線的方式，進行分離培養(yǎng)，其四種畫線方法如圖1所示，從而確保每一種培養(yǎng)基上僅有一種類型的菌株，其平板畫線方法如圖1所示。

圖1 為培養(yǎng)高效菌種的四種平板畫線方法

然后對這些平板進行分類，通常來說，分離出的菌種大體為Pseudom onas me sophillca和m alto philia P，Barton兩大類型 ；然后為應(yīng)用基因工程方法，將重金屬抗性基因或編碼重金屬結(jié)合肽的基因轉(zhuǎn)移到針對在污染土壤適應(yīng)性強菌株的體內(nèi)，除出這兩大類型菌株中的含有的錫、汞、鉛等毒性有毒重金屬，從而得到高效菌株；最后將得到的高效菌株通過富集培養(yǎng)的方式，加入到土壤環(huán)境中，從而土壤中生物多樣性。

1.2 轉(zhuǎn)化土壤成分

在得到了新型微生物培養(yǎng)技術(shù)之后，就到了應(yīng)用這些微生物菌株已完成受污染土壤成分的轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)，其具體的工作流程為：首次采用在將這些微生物菌株均勻的分布到受氯代有機物污染土壤中的同時，加入適應(yīng)微生物生存濃度的氮、磷、鉀等無機鹽成分以及電子受體，從而保證所添加的微生物菌株和原有的微生物在土壤中均可穩(wěn)定的生長和繁殖。其次由于微生物菌種其表面是由編碼目的肽的DNA片段通過基因重組的方法構(gòu)建和表達(dá)在噬菌體表面、細(xì)菌表面或酵母菌表面，因此其菌株表面的每一個生物大分子或細(xì)胞均僅呈現(xiàn)出一種多肽類型。微生物菌株中的高效菌種表面具有多態(tài)類型，可以與含有氯代有機物的物質(zhì)進行緊密的結(jié)合，并且通過基因重組的方法與編碼細(xì)菌表面蛋白的基因相連，高效菌株高效結(jié)合肽的方法，可以融合蛋白的形式表達(dá)在細(xì)菌表面，從而提高其表面與氯代有機物的結(jié)合效率。然后將結(jié)合之后的菌株其表面會成分為發(fā)生變化，觀察其表面中LamA、血紅蛋白、酵母α-激活酶、a-凝集素和葡萄球菌蛋白A等表面蛋白成分的轉(zhuǎn)變從而在微生物表面展示技術(shù)中用來定位、錨定外源多肽.等將六聚組氨酸多肽展示在E.coliLamB蛋白表面，進而提高其針對氯代有機物的吸收能力。之后要將吸收了大量氯代有機污染物的菌株，進行富集比處理，從而將多聚組氨酸與OmpC融合，已保證其菌株群體的吸附的能力可達(dá)到16mol/L。通過經(jīng)數(shù)輪篩選和富集，獲得對多種氯代有機污染物具有高親和力的表面多肽，從而將將酵母金屬硫蛋白串聯(lián)體在酵母表面展示表達(dá)后，實現(xiàn)提升其4倍～8倍的吸收能力。最后為高效菌株在最大限度吸收了氯代有機污染物的自身清理過程，其體內(nèi)由于過多積累的氯代有機污染物，可以通過主導(dǎo)運輸方式，進行到其細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞內(nèi)進行區(qū)域性的劃化，將有害物質(zhì)分布到細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)工作車間中，實現(xiàn)了將高效菌株內(nèi)的有害氯代有機物的封閉或轉(zhuǎn)變成為低毒的處理，從而讓無毒的高效菌株繼續(xù)進行土壤的修復(fù)工作，通過長期的良性循環(huán)，讓土壤中氯化有機污染物含量得到最大限度的降低，進而完成針對土壤成分的改善工作。

2 對比實驗

2.1 實驗準(zhǔn)備

本實驗選擇一塊氯代有機物濃度為15.23%的農(nóng)田作為實驗原材料，首先將其等分為相同的兩部分；然后采用新型微生物修復(fù)技術(shù)和傳統(tǒng)技術(shù)分別對其進行修復(fù)；之后對比相同修復(fù)時間內(nèi)兩個部分中氯代有機物的含量，驗證新型微生物修復(fù)技術(shù)的實用價值。

2.2 結(jié)果討論

以下為新型微生物修復(fù)技術(shù)和傳統(tǒng)修復(fù)技術(shù)，對于同一農(nóng)田在相同時間內(nèi)修復(fù)程度的對比結(jié)果。

根據(jù)上圖數(shù)據(jù)信息，可以清楚的看出，對比傳統(tǒng)技術(shù)，新型微生物修復(fù)技術(shù)可在更短的時間內(nèi)完成針對受污染土壤的修復(fù)工作，且最終將土壤中的氯代有機物含量降低至3.12%；而傳統(tǒng)修復(fù)技術(shù)最終的氯代有機物含量僅降低至3.54%；相比之下新型微生物修復(fù)技術(shù)多降低了0.42%的氯化有機物含量，由此驗證了新型微生物修復(fù)技術(shù)的實用價值。

圖2 為兩種修復(fù)方法的實驗結(jié)果對比圖

3 結(jié)語

本文引入了新型微生物修復(fù)技術(shù)，已治理土壤中氯代有機物含量過高的問題。之后通過對比傳統(tǒng)修復(fù)技術(shù)的方式，說明了新型微生物修復(fù)技術(shù)對于降低土壤中氯代有機物含量，具有更好的效果。由此，可驗證新型微生物修復(fù)技術(shù)中的高效菌株，對于降低土壤中氯化有機污染物含量，以及修復(fù)污染土壤具有極為重大的意義。

目前，應(yīng)用微生物技術(shù)對受有機物侵害的土壤進行修復(fù)，被國際上公認(rèn)為是一項既節(jié)能又環(huán)保的環(huán)境保護措施[6]。近年來我國針對生物修復(fù)技術(shù)的研究越來越深入，尤其是針對殘留在土壤中的危險物質(zhì)如TNT、石油、農(nóng)藥、甲基汞等有機污染的研究工作[7]。但因為生物修復(fù)技術(shù)發(fā)展的時間晚，且沒有可參考的前人資料，造成其發(fā)展速度十分緩慢。由目前的發(fā)展來看，要想全面發(fā)展生物修復(fù)技術(shù)，就必須結(jié)合生態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)酵工程、環(huán)境化學(xué)、植物化學(xué)、微生物學(xué)和環(huán)境工程學(xué)等多門學(xué)科知識，才能確保我國生物修復(fù)技術(shù)水平的穩(wěn)步提升。