杜高波，唐其柱

(武漢大學人民醫(yī)院心內科，武漢大學心血管病研究所，心血管病湖北省重點實驗室，武漢430060)

心肌重構是指在各種病理生理因素刺激下，心臟結構、形態(tài)和功能發(fā)生的適應性代償改變的現象，是心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中的重要病理改變[1]。心肌重構主要包括結構重構和電重構，以心肌間質纖維化、心肌細胞肥大、心室順應性降低和心室電傳導異常為主要特征，可直接影響心臟功能甚至導致死亡[2,3]。因此，以心肌重構為靶點防治心力衰竭具有重要意義和前景。羅氟司特(roflumilast，RM)是第1個被美國食品和藥物管理局批準上市的磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4，PDF4)抑制劑，主要用于慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的治療，具有良好的抗炎特性及器官保護作用[4]。在細菌誘導的COPD小鼠模型中，RM能夠顯著抑制肺內白細胞浸潤、支氣管壁重構及肺氣腫[5]。此外，RM還能夠降低COPD患者血清中促炎癥細胞因子的水平。最近的一項研究表明，RM可通過抑制p38絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路改善膿毒癥肝損傷，提高小鼠生存率[6]。而在心臟中，p38 MAPK信號通路及炎癥反應的激活是導致心肌重構的重要機制[7,8]?；诖?，我們認為RM可能通過調節(jié)小鼠心肌中p38 MAPK信號及炎癥反應改善壓力負荷誘導的心肌重構。本研究通過主動脈縮窄術(aortic banding，AB)構建小鼠心肌重構模型，觀察RM對小鼠心肌重構及心功能的影響，同時探討了RM影響小鼠心肌重構的潛在機制，旨在為今后心肌重構及心力衰竭的藥物治療提供一定的參考依據。

國家為自貿區(qū)的建立出臺了一系列政策，也為自貿區(qū)知識產權保護制度的構建提供了便利。國務院于2013年在《中共中央關于全面深化改革若干重大問題的決定》中指出，國家應通過更為成熟的手段，加強和運用健全的知識產權保護制度，完善技術創(chuàng)新的激勵機制，并努力探索建立健全專門知識產權法院；國家對知識產權的保護日益重視，在知識產權核心法律體系中，法定賠償額的提高以及相關的頂層制度設計與出臺均反映了中央對知識產權的重視程度。重慶自貿區(qū)作為我國西部自貿區(qū)的試驗基地，其地位顯得尤為重要，因為先行試驗基地的成功與知識產權保護有著密切的關聯(lián)，同時知識產權的保護也為以后的自由貿易區(qū)提供著重要借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

RM購自于美國Sigma公司，純度≥98%；CD45和CD68抗體購自于美國Abcam公司；總p38(total-p38，T-p38)、磷酸化的p38(phosphorylated-p38，P-p38)及GAPDH抗體均購自于美國Cell Signaling Technology公司；免疫組織化學DAB試劑盒購于美國Gene-tech公司；羊抗兔IgG抗體購自于美國LICOR公司。

如SiO2/Fe3O4-C顆粒和Fe3O4-C磁性空心微球的磁滯回線，如圖2(d)所示，2種樣品均表現出典型的超順磁性。SiO2/Fe3O4-C顆粒的磁飽和強度為17.1 emu/g，除去中間的硅膠核心后，最終的Fe3O4-C空心微球的磁飽和強度上升至42.5 emu/g，完全滿足磁分離的需要。圖2(d)內部的小圖顯示的是Fe3O4-C空心微球在水溶液中的分散情況(左)和磁分離效果(右)，顯示了材料在無外加磁場時良好的分散性和施加外加磁場時良好的磁響應性，這對于材料的實際應用非常重要[10]。

1.2 實驗動物及模型建立

雄性C57/B6小鼠(8～10周)，體質量 255～320 g，購自于中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所(動物合格證號：11401300036042)，飼養(yǎng)于武漢大學心血管病研究所動物中心。采用隨機數表法隨機將40只小鼠隨機分為假手術組(Sham組)，AB組，AB+RM(1mg/kg)組及AB+RM(3 mg/kg)組，每組10只。AB組，AB+RM(1 mg/kg)組及AB+RM(3 mg/kg)組小鼠均接受AB手術處理。超聲心動圖檢測術后6周是否成功建立壓力負荷誘導的心肌重構模型。AB+RM(1 mg/kg)組及AB+RM(3 mg/kg)組小鼠于AB術后2 d開始，每天給予1及3 mg/kg的RM灌胃處理，持續(xù)6周。本研究中所有涉及動物的實驗均通過武漢大學動物護理和使用委員會批準。

1.3 AB組小鼠手術方法

首先將各組石蠟切片于60 ℃溫箱中脫蠟30 min，采用檸檬酸鹽高壓法進行抗原修復；隨后將3%雙氧水覆蓋于心肌組織上孵育15 min， 8%羊血清封閉30 min，一抗CD45和CD68(1∶200，磷酸緩沖液稀釋)滴加并完全覆蓋于心肌組織孵育，4 ℃過夜。次日，各組切片復溫后滴加二抗B液，室溫孵育30 min，沖洗后滴加顯色劑二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzine, DAB)工作液，并在光鏡下嚴格控制顯色時間。最后，蘇木素復染各組切片，梯度乙醇脫水后封片。隨機選取10張心肌組織不重復的區(qū)域觀察，記錄視野中白細胞及巨噬細胞數量。

目前，高中生物一線教師在培育學生生命觀念的教學過程中存在一定的問題。例如，教師對生命觀念的內涵缺少深刻的理解、對生命觀念在生物學中相應的錨定點缺少系統(tǒng)的把握、對三維目標和核心素養(yǎng)教學目標的轉化缺少足夠的認識、對培育學生生命觀念的系統(tǒng)教學方案缺少應有的重視等。下面重點闡述生命觀念及其培育策略。

1.4 各組小鼠心臟形態(tài)學參數的收集

各組小鼠通過吸入1.5%異氟烷麻醉后，剔去心前區(qū)毛發(fā)，固定于保溫平板上，采用MyLab 30CV多普勒超聲診斷儀(意大利Biosound Esaote公司，頻率10 MHz)檢測。在靠近乳頭肌水平的胸骨旁長軸和胸骨旁短軸上以二維模式成像后，記錄一個二維引導的穿過左心室前壁和后壁M型超聲，隨后收集并計算心臟的形態(tài)學參數，心率(heart rate，HR)、左室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)、左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)及左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)。各參數最終取值為3個連續(xù)心動周期的平均值。

1.5 心肌肥厚與纖維化的形態(tài)學檢測

1.6.1 RNA的提取 各組取30 mg心肌組織剪碎并加入TRIzol，充分研磨后離心取上清液，加入200 ml三氯甲烷，靜置5 min。12 000 g離心15 min(4 ℃)，取上清液轉移至新的離心管，加入等體積異丙醇，靜置10 min。再次12 000 g離心30 min(4 ℃)，得到白色沉淀。75%乙醇進行漂洗，繼續(xù)7 500 g離心5 min(4 ℃)。利用紫外分光光度計檢測所獲RNA的濃度及純度，當A260/A280=1.8～2.0時，代表該樣品達標可用。

1.6 qPCR檢測肥厚、纖維化及炎癥相關基因

通過頸椎脫臼法處死各組小鼠后，獲取小鼠心臟，用吸水紙擦干心臟殘余液體，并稱重(mg)，獲得心重/體重(heart weight/body weight，HW/BW)值。同時取出小鼠下肢脛骨并測量其長度(cm)，計算心重/脛骨長(heart weight/ tibia length，HW/TL)。隨后，迅速將心臟置于有10%甲醛溶液的容器中固定，隨后進行石蠟包埋并制成厚度為5 μm的切片。HE染色評價心肌組織形態(tài)結構，天狼猩紅染色評價心肌組織間質及血管周纖維化狀況。用Image-ProPlus 6.0軟件分析計算各組心肌細胞橫截面積及心肌組織中膠原百分比。

為了更好地落實新型職業(yè)農民培育工程，需要圍繞市場需求，合理地設計新型職業(yè)農民培育工程信息管理系統(tǒng)。同時，結合實際確定新型職業(yè)農民培訓工程實操計劃，旨在提高新型職業(yè)農民的培育質量。

超聲心動圖數據顯示(圖1A)，與Sham組相比，AB組小鼠心室壁厚度明顯增加；與AB組相比，AB+RM(1 mg/kg)組及AB+RM(3 mg/kg)組小鼠心室壁厚度明顯減少；進一步分析發(fā)現，4組小鼠HR無明顯差異(P>0.05)，表明心功能各指標具有可比性(圖1B)。與Sham組相比，AB組小鼠EF和FS百分數均顯著降低(均P<0.05)，而LVESD及LVEDD則顯著升高(均P<0.05)，表明AB手術成功誘導了小鼠心功能不全；與AB組小鼠相比，AB+RM(1 mg/kg)組及AB+RM(3 mg/kg)組小鼠EF及FS顯著升高(均P<0.05)，而LVESD及LVEDD則顯著降低(均P<0.05)，提示RM能夠改善AB誘導的小鼠心功能不全(圖1C～F)。

1.6.3 實時熒光定量PCR 將步驟1.6.2中獲取的cDNA加60 μl DEPC水稀釋后，配置反應體系。具體如下：(1)SyBr Green 10 μl；(2)DEPC水：8 μl；(3)正向引物及反向引物各0.5 μl。最終以GAPDH作為內參基因進行校正。各待測基因引物詳見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primers used in qPCR

1.7 免疫組織化學法檢測CD45和CD68

經腹腔注射的方式給予小鼠3%異戊巴比妥麻醉，同時經口給予氣管插管輔助呼吸。在小鼠胸部2～3肋間隙水平方向切開皮膚，仔細分離降主動脈，將26號針置于主動脈旁并結扎。結扎后迅速拔出針頭，逐層縫合小鼠肌肉及皮膚。

1.8 蛋白免疫印跡法檢測

1.9 統(tǒng)計學處理

取約30 g的心肌組織用剪刀盡量剪碎，隨后加入放射免疫沉淀試驗裂解液，于研磨儀中充分粉碎。進一步超聲(400 W，5 kHz)裂解后離心取上清液，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度后，將各組蛋白液定容至等濃度。將所獲蛋白用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel，SDS-PAGE)電泳分離，隨后轉入聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，加入磷酸緩沖液稀釋的P-p38(1∶500)，T-p38(1∶5000)及GAPDH(1∶1000)抗體，4 ℃孵育過夜，次日將PVDF膜置于羊抗兔二抗中避光孵育60 min，利用Odysse掃描儀(美國LI-COR)對各組蛋白條帶掃描并定量，最終以GAPDH作為內參蛋白進行校正。

2 結果

2.1 4組小鼠心功能的比較

1.6.2 AMV逆轉錄 取0.65 ml EP管，加入4.5 μl DEPC水，1 μl引物及1 μl模板RNA。離心并沸水浴后加入0.5 μl dNTP，2 μl 5× Buffer及1μl AMV逆轉錄酶，離心后進行逆轉錄，獲取cDNA。

基于先前的工作[25]，本文認為,判斷彈體是否進入銷蝕侵徹狀態(tài)的主要依據為長桿彈頭部是否形成了穩(wěn)定的蘑菇頭。由式(11)和式(12)可以看出，長桿彈形成穩(wěn)定蘑菇頭，且銷蝕碎片拋射出的條件為

圖1 各組小鼠心功能狀況Figure 1 Heart function of mice among four groupsAB: aortic banding; RM: roflumilast; HR: heart rate; LVEF: left ventricular ejection fraction; LVFS: left ventricular fraction shortening; LVESD: left ventricular end-systolic diameter; LVEDD： left ventricular end-diastolic diameter. Compared with sham group,*P<0.05; compared with AB group, #P<0.05.

2.2 4組小鼠心肌肥厚相關指標的比較

HE染色結果顯示，與Sham組相比，AB組小鼠心臟大體橫截面積及心肌細胞橫截面積均明顯增加，HW/BW及HW/TL值明顯上升(均P<0.05)；與AB組相比，AB+RM(1 mg/kg)組及AB+RM(3 mg/kg)組小鼠心臟大體橫截面積及心肌細胞橫截面積顯著降低，同時HW/BW及HW/TL值也明顯下降(均P<0.05；圖2A～D)。進一步，我們分析了4組小鼠心肌肥厚相關標志基因[心鈉素(atriopeptin，ANP)、腦利鈉肽(brainnatriureticpeptide，BNP)及β-MHC]的mRNA表達水平，結果顯示1和3 mg/kg的RM干預能夠顯著抑制AB誘導的小鼠心肌ANP、BNP及β-MHC的mRNA表達上調(均P<0.05；圖2E～G)。

圖2 4組小鼠心肌肥厚相關指標的比較Figure 2 Comparison of hypertrophic markers of mice among four groupsAB: aortic banding; RM: roflumilast; HW: heart weight; BW: body weight；TL: tibia length; ANP: atriopeptin; BNP: brain natriuretic peptide. Compared with sham group, *P<0.05; compared with AB group, #P<0.05.

2.3 4組小鼠心肌纖維化相關指標的比較

免疫組織化學染色結果提示，與Sham組相比，AB組小鼠心肌組織中CD45及CD68陽性細胞數目明顯增多，同時增加促炎癥細胞因子白細胞介素(interleukin-6,IL-6)及腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)的表達，表明AB能夠通過促進心肌組織中白細胞及巨噬細胞浸潤，激活心肌炎癥反應(均P<0.05)；而不同劑量RM干預后均能降低心肌組織中炎癥細胞數目，抑制相關促炎癥細胞因子釋放(均P<0.05；圖4A～E)。免疫印跡結果揭示，與AB組相比，AB+RM(1 mg/kg)組及AB+RM(3 mg/kg)組小鼠心肌組織中p38蛋白磷酸化水平明顯被抑制(均P<0.05；圖4F, G)。

圖3 4組小鼠心肌纖維化相關指標的比較Figure 3 Comparison of fibrotic markers of mice among four groupsAB: aortic banding; RM: roflumilast; Ctgf：connective tissue growth factor. Compared with sham group,*P<0.05; compared with AB group, #P<0.05.

2.4 4組小鼠心肌組織炎癥反應及p38 MAPK的激活狀態(tài)

天狼猩紅染色結果顯示，與Sham組相比，AB組小鼠心肌間質及血管周膠原沉積明顯增加；與AB組相比，AB+RM(1 mg/kg)組及AB+RM(3 mg/kg)組小鼠心肌血管周及間質中膠原沉積明顯降低(均P<0.05；圖3A～C)；同時，我們分析了心肌纖維化相關標志基因(Ctgf、fibronectin、collagen1和collagen3)的mRNA表達水平，結果顯示，與AB組相比，AB+RM(1 mg/kg)組及AB+RM(3 mg/kg)組小鼠心肌組織中Ctgf、fibronectin、collagen1和collagen3的mRNA表達水平明顯降低(均P<0.05；圖3D～G)。

圖4 4組小鼠炎癥反應及p38 MAPK信號的激活狀況Figure 4 Inflammatory response and activation of p38 MAPK signaling pathway of mice among four groupsAB: aortic banding: RM: roflumilast; IL-6：interleukin-6；TNF-α：tumor necrosis factor-α; P-p38: phosphorylated-p38; T-p38: total-p38. Compared with sham group,*P<0.05; compared with AB group, #P<0.05.

3 討 論

心肌重構是心臟應對各種內源性及外源性損傷時的一種適應性反應。一方面，長期壓力負荷刺激下，白細胞向心臟浸潤，與巨噬細胞、T淋巴細胞和心臟成纖維細胞相互作用，導致心肌組織中促炎和抗炎因子的平衡失調，同時促進心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，分泌大量細胞外基質，最終導致心肌膠原沉積和心臟纖維化[9]；另一方面，p38 MAPK信號通路作為關鍵的胞內信號轉導交匯點，可介導多條信號通路導致心肌細胞肥大[10]。因此，抑制心肌組織炎癥激活，阻斷p38 MAPK信號通路對干預心肌重構、治療心力衰竭具有重要意義。本研究發(fā)現新型抗COPD藥物能夠顯著抑制壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚及纖維化，可能與RM對心臟炎癥激活的抑制劑p38磷酸化激活有關。

左心室功能障礙和心力衰竭與促炎細胞因子、T細胞、白細胞及巨噬細胞浸潤密切相關。大量促炎癥細胞因子的累積不僅會導致心臟各類細胞死亡、阻斷β-腎上腺素信號、胚胎基因的激活、內皮細胞功能紊亂及膠原沉積，還能夠通過激活下游的p38 MAPK信號通路、細胞外信號調節(jié)激酶及核因子-κb信號促進心肌肥厚。同時，炎癥急性期促炎癥細胞因子基因表達的增加可進一步通過自分泌和旁分泌的方式引起“繼發(fā)性炎癥反應”[11,12]。臨床研究表明，心力衰竭患者外周血中促炎癥細胞因子水平與心力衰竭嚴重程度呈正相關[13]。動物實驗表明，心臟特異性過表達TNF-α能誘導小鼠發(fā)生自發(fā)性擴張型心肌病及心肌纖維化[14]。此外，心臟特異性過表達IL-1β能導致小鼠發(fā)生射血分數保留的心肌肥厚[15]。此外，抗炎癥細胞因子IL-10能夠通過抑制STAT3依賴的核因子-κb信號明顯逆轉壓力負荷誘導的小鼠心肌重構[16]。上述研究提示抑制心肌炎癥激活是預防心肌重構的重要靶點。

p38 MAPK隸屬于MAPK家族，與多種心血管疾病(高血壓、心肌梗死及心力衰竭等)的發(fā)生發(fā)展密切相關，可被缺血缺氧、紫外線、高糖、高滲、脂多糖、氧化應激及炎癥等多種損傷相關刺激激活。心肌細胞在受到上述刺激后，會產生大量活性氧自由基，通過進一步激活p38 MAPK在內的相關促肥厚信號通路，誘導心肌細胞c-fos大量轉錄，最終導致心肌細胞體積增大[7]。同時，p38 MAPK信號亦可調節(jié)心臟成纖維細胞，影響心肌纖維化。體內實驗表明p38 MAPK特異性抑制劑PH797804能夠明顯提高缺氧或肺動脈縮窄所誘導的小鼠右心室重構，改善心功能。體外實驗進一步揭示PH797804可抑制TGF-β誘導的心臟成纖維細胞膠原合成及應力纖維形成，其機制可能與p38 MAPK對Smad2/3磷酸化及心肌素蛋白核轉位的調節(jié)有關[17]。

(3)在鈾尾礦下游農田中，除Cd和U，其余幾種重金屬潛在生態(tài)危害單項系數均小于6，潛在危害性很低，并不能對當地農田構成生態(tài)威脅。Cd單項系數均值為206.68，潛在生態(tài)危害程度為重。其次為U，單項系數均值為63.18，潛在生態(tài)危害程度為中。9個樣品中有8個樣品的RI值介于150～300之間，綜合潛在生態(tài)風險程度為中，一個樣品RI值超過300，綜合潛在生態(tài)風險程度為重。總體來看，該農田潛在生態(tài)風險較高，主要是Cd和U所帶來的潛在生態(tài)風險。

RM作為新型抗COPD的選擇性PDF4抑制劑，在改善COPD患者肺功能及減少急性加重頻率方面取得了良好效果。最近的研究表明，RM還能通過抑制炎癥及p38信號通路改善膿毒癥誘導的小鼠肝損傷[6]。此外，RM可通過下調iNOS，上調cAMP減輕潰瘍性結腸炎大鼠的炎癥反應[18]。本研究發(fā)現RM可顯著改善壓力負荷誘導的小鼠心功能不全，減輕心肌肥厚及纖維化。進一步實驗發(fā)現，RM的抗心肌重構作用可能與對炎癥反應及p38磷酸化的抑制有關。研究已證實，p38 MAPK亦是介導心肌細胞炎癥和凋亡的重要原因之一[19]，因此本研究中RM抑制心臟炎癥是否依賴于其對p38 MAPK信號通路的阻斷還需要進一步的實驗來闡明。

綜上，RM可通過抑制心肌組織炎癥細胞浸潤及p39 MAPK信號激活改善壓力負荷誘導的心肌重構，但仍需要進一步研究探討其具體分子靶點。