張 敏，張先舟，李 聰，高 浩，劉健慧，田益玲，馬 雯，李英軍，檀建新

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心，河北 保定 071000）

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）是真菌毒素中毒性最強(qiáng)的一種化合物，具有與蛋白質(zhì)和DNA結(jié)合的“雙重危險(xiǎn)”能力，有致突變和致癌毒性，可引起多種疾病，如肝癌、腦病、肺間質(zhì)纖維化以及生殖和免疫系統(tǒng)疾病等，被世界衛(wèi)生組織列為人類第一類致癌物[1-3]。這些真菌可以污染不同食物，如干果（無(wú)花果和葡萄干）、谷物（大米、玉米、大麥）、水果和咖啡等[4-5]。大多數(shù)動(dòng)物的半數(shù)致死量（LD50）在1～50 mg/kg之間，對(duì)于一些敏感的動(dòng)物，如家禽、虹鱒魚和大鼠，其臨界毒性水平低于1 mg/kg[6]。如果動(dòng)物誤食含黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1， AFB1）污染的飼料，經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化產(chǎn)生羥化代謝物AFM1，在哺乳動(dòng)物乳腺中，隨乳汁排出，危害動(dòng)物健康，同時(shí)也嚴(yán)重影響奶制品的質(zhì)量和安全[7]。

核酸適配體是通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)[8]，經(jīng)過(guò)多輪篩選后，從隨機(jī)單鏈寡核苷酸（single-strand DNA，ssDNA）或ssRNA分離得到與靶標(biāo)分子高親和力、特異性結(jié)合寡核苷酸序列，并能通過(guò)分子間的相互作用（如芳香環(huán)、π-π堆積、范德華力和帶電基團(tuán)之間的靜電相互作用等）形成特殊的三維結(jié)構(gòu)[9-10]。在1990年，Ellington[11]和Tuerk[12]等首次提出核酸適配體的概念。Ellington等[11]報(bào)道了一組與有機(jī)染料的特異性RNA適配體，Tuerk等[12]報(bào)道了一種與T4 DNA聚合酶相互作用的RNA適配體。適配體的靶標(biāo)范圍廣泛，從小分子的金屬離子、有機(jī)染料到生物大分子，如蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至整個(gè)腫瘤組織[13-14]。與抗體相比，適配體具有生產(chǎn)方便、成本低、熱穩(wěn)定好、易化學(xué)合成、易與多種官能團(tuán)修飾、高親和合力和高特異性等優(yōu)點(diǎn)[15-16]，在分析領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前靶向生物毒素適配體陸續(xù)有報(bào)道，包括特異性識(shí)別葡萄球菌腸毒素[17]、赭曲 霉素[18]、T-2毒素[19]、伏馬毒素[20]和玉米赤霉烯酮[21]。以適配體為識(shí)別元件，所開發(fā)的生物傳感器具有更高的靈敏度和特異性，檢測(cè)時(shí)間短，可在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[22]。

經(jīng)過(guò)近30年的發(fā)展，根據(jù)不同的靶標(biāo)已經(jīng)陸續(xù)發(fā)展了很多篩選方法。目前篩選小分子物質(zhì)一般采用磁珠法、親和層析柱法、氧化石墨烯（graphene oxide，GO）法[23-25]。在篩選AFB1時(shí)，因其無(wú)任何功能性官能團(tuán)，難以共軛，給篩選帶來(lái)一定的難度。如果采用傳統(tǒng)磁珠法，還有可能改變靶標(biāo)的構(gòu)象和性質(zhì)，影響適配體親和力等一系列的問題[26]。Gao Sunxiang等[27]針對(duì)海洋生物毒素膝溝藻毒素1/4進(jìn)行兩種不同篩選方法，一種采用傳統(tǒng)的磁珠法（magnetic beads-SELEX，MB-SELEX），另一種采用新型的氧化石墨烯法（GO-SELEX），結(jié)果發(fā)現(xiàn)與典型的MB-SELEX相比，GO-SELEX更具有優(yōu)勢(shì)。首先，GO-SELEX過(guò)程中，ssDNA每輪的回收率顯著高于MB-SELEX；其次，通過(guò)GO-SELEX獲得的序列顯示更高同源性，其中具有多個(gè)重復(fù)序列，而MB-SELEX獲得的序列具有較低同源性，幾乎沒有重復(fù)序列；最后GO-SELEX篩選的適配體解離常數(shù)Kd在納摩爾每升范圍內(nèi)，表現(xiàn)出更高的親和力，而MB-SELEX具有較低的親和力，范圍從幾十微摩爾每升到幾微摩爾每升，差距可達(dá)100 倍。

國(guó)內(nèi)外已建立了多種針對(duì)AFB1的檢測(cè)方法，主要包括薄層色譜法[28]、高效液相色譜法[29]、酶聯(lián)免疫法[30]、膠體金免疫層析技術(shù)[31]和免疫親和柱熒光[32]檢測(cè)等，以上這些方法的應(yīng)用受到檢測(cè)儀器昂貴、檢測(cè)過(guò)程繁瑣且需要專門的操作人員等其他原因的限制。而納米金比色方法具有檢測(cè)方便、靈敏、適應(yīng)性強(qiáng)、低成本、可短時(shí)間分析等優(yōu)勢(shì)，在食品安全的快速檢測(cè)中越來(lái)越受到歡迎。

本實(shí)驗(yàn)利用GO-SELEX法將靶物質(zhì)AFB1和一個(gè)長(zhǎng)度為80 bp的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)進(jìn)行孵育，以GO作為分離物質(zhì)，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增和磁珠法制備次級(jí)文庫(kù)為手段，通過(guò)8 輪正篩選和2 輪反篩選，獲得高親和性和高特異性的核酸適配體序列，為小分子DNA適配體的篩選提供一種新的替代方法，并以篩選所得的適配體為特異性識(shí)別探針，納米金為指示劑，建立AFB1的可視化檢測(cè)方法，以期為食品安全檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米 保定永輝超市；A F B1、伏馬菌素（fumonisin B1，F(xiàn)B1）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A， OTA）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、T-2毒素 青島普瑞邦生物工程有限公司；GO 上海阿拉丁試劑有限公司；2×Es Taq Master Mix（Dye）、50 bp DNA ladder 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；核酸共沉劑試劑盒、pMD18-T連接試劑盒 大連寶生物工程有限公司；鏈霉親和素磁珠 蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；Top10大腸桿菌感受態(tài)、提取質(zhì)粒試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑 北京Solarbio 公司；氯金酸（HAuCl4） 美國(guó)Sigma公司；二水合檸檬酸三鈉、NaCl、HCl、HNO3上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

適配體庫(kù)：DNA （ssDNA ）文庫(kù)：5’-ATAGGAGTCACGACGACCAG-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGA-3’，上游引物P1：5’-ATAGGAGTCACGACGACCAG-3’，下游引物P2：5’-TCAAGAGGTAGACGCACATA-3’。標(biāo)記的下游引物P3：5’-biotin-TCAAGAGGTAGACGCACATA-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS微量高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JY04S-3C聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置 北京君意華鑫科技有限公司；TProfessional standard PCR儀 德國(guó)Biometra公司；DYY-7C電泳儀 北京市六一儀器廠；WD9413C凝膠成像分析系統(tǒng) 北京科普爾科技發(fā)展有限公司；iMark酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；K2800核酸蛋白儀 北京凱奧科技發(fā)展有限公司；KQ-500DV超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DFY-500高速粉碎機(jī) 浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠。

1.3 方法

1.3.1 SELEX過(guò)程

1.3.1.1 正向篩選

1）取2 nmol的初始文庫(kù)（合成的ssDNA文庫(kù)）溶解于400 μL結(jié)合緩沖液，混合均勻，于95 ℃水浴熱變性10 min，0 ℃冰浴10 min，室溫10 min。加入2 nmol靶標(biāo)AFB1，室溫孵育1 h。

2）加入GO溶液，4 ℃、13 000 r/min多次離心，去除上清液，將上述孵育混合液轉(zhuǎn)移到GO沉淀，孵育2 h。

3）4 ℃、13 000 r/min離心10 min，棄除沉淀，收集上清液，并通過(guò)苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）混合液抽提，12 000 r/min離心5 min，吸取上層水相，并加入1/10 倍體積的3 mol/L醋酸鈉（pH 5.2）溶液，2.5 倍體積的冰乙醇溶液混勻，-20 ℃靜置過(guò)夜。

4）4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清液，再加入4 ℃預(yù)冷的70%乙醇溶液洗滌后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。沉淀部分室溫干燥，加入100 μL滅菌TE緩沖溶液，通過(guò)核酸蛋白儀測(cè)定濃度。

1.3.1.2 反向篩選

1）用400 μL的結(jié)合緩沖液溶解ssDNA文庫(kù)，于95 ℃熱變性10 min，0 ℃ 10 min，室溫10 min。加入等物質(zhì)的量的ZEN、DON、T-2毒素、FB1和OTA混合液，室溫輕微振蕩孵育1 h。

2）加入GO溶液，4 ℃、13 000 r/min多次離心，去除上清液，將上述孵育混合液轉(zhuǎn)移到GO沉淀，孵育2 h。

3）4 ℃、13 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，得到GO-ssDNA沉淀，加入400 μL的結(jié)合緩沖液將其重懸，離心，棄上清液，重復(fù)操作3 次，以便徹底去除與反篩物結(jié)合的適配體。

4）經(jīng)過(guò)洗滌沉淀后，重新加入400 μL結(jié)合緩沖液和2 nmol AFB1溶液，室溫孵育1 h。

5）4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上清液通過(guò)苯酚、氯仿和異戊醇抽提，乙醇法沉淀，加入100 μL滅菌TE緩沖溶液重溶DNA，通過(guò)核酸蛋白儀測(cè)定濃度。

1.3.1.3 ssDNA的PCR條件優(yōu)化

用于擴(kuò)增ssDNA的PCR擴(kuò)增體系如下：DNA模板2.0 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，2×Es Taq Master Mix（Dye）12.5 μL，用無(wú)菌ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.1.4 ssDNA次級(jí)文庫(kù)的制備

取100 μL鏈霉親和素修飾過(guò)的磁珠，用磁珠緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、1 mol/L NaCl、0.01 %～0.1% Tween-20，pH 7.5）清洗3 遍，加入500 μL的磁珠緩沖液和待分離的雙鏈DNA，室溫振蕩孵育45 min，將其放置于磁力架上，靜置2 min，吸棄上清液。用磁珠緩沖液清洗3 遍后，加入125 μL的0.15 mol/L NaOH溶液，37 ℃孵育15 min，使雙鏈DNA解鏈。吸取上清液，用稀鹽酸溶液調(diào)整pH 7.5左右，即可用作次級(jí)文庫(kù)的下一輪篩選。

1.3.1.5 回收率實(shí)驗(yàn)

每一輪篩選經(jīng)過(guò)醇沉之后計(jì)算回收率，隨著篩選輪數(shù)的增加，未能與AFB1結(jié)合的不斷被篩掉，與AFB1親和力高的ssDNA逐漸得到富集，回收率不斷增加，待回收率趨于平穩(wěn)，篩選過(guò)程基本結(jié)束。

1.3.2 連接轉(zhuǎn)化及適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

將第8輪和終輪篩選得到的ssDNA，用上游引物P1和下游引物P3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物全量上樣于3%瓊脂糖，電泳并切下目的條帶，通過(guò)DNA回收試劑盒進(jìn)行ssDNA回收。將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)，振蕩培養(yǎng)45 min，使細(xì)菌復(fù)蘇，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證，隨機(jī)挑取60 個(gè)陽(yáng)性克隆子轉(zhuǎn)接到液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)序序列結(jié)果經(jīng)過(guò)比對(duì)，去除重復(fù)和非單克隆的序列，用DNAMAN軟件在線預(yù)測(cè)模擬二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3.3 適配體與AFB1的親和力驗(yàn)證

將不同濃度（5～200 nmol/L）熒光標(biāo)記的適配體序列進(jìn)行95 ℃加熱，立即0 ℃冰浴的預(yù)處理，分別與固定濃度AFB1（1 μmol/L）室溫孵育2 h，反應(yīng)總體積為500 μL，同時(shí)設(shè)置不加入AFB1的陰性對(duì)照，孵育結(jié)束后，加入與適配體呈比例的GO溶液，繼續(xù)避光孵育60 min，13 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL放入黑色酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值（Ex=480 nm，Em=520 nm）。采用GraphPad-Prism6軟件將熒光值對(duì)應(yīng)核酸適配體濃度進(jìn)行非線性擬合，根據(jù)公式：Y=Bmax×X/（Kd＋X）計(jì)算得到Kd值（Bmax為最大結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目， X為適配體濃度，Y為熒光強(qiáng)度）。

1.3.4 適配體與AFB1的特異性驗(yàn)證

通過(guò)比較每條適配體序列的Kd值，挑選親和力較高的適配體序列進(jìn)行特異性分析實(shí)驗(yàn)。具體操作步驟為：將100 nmol/L帶FAM標(biāo)記的序列分別加入ZEN、DON、T-2毒素、FB1、OTA和AFB1（各1 nmol），37 ℃孵育2 h后，再加入GO溶液（GO∶ssDNA=400∶1）進(jìn)行吸附，37 ℃搖床孵育1 h，以猝滅未結(jié)合AFB1適配體序列的熒光。反應(yīng)結(jié)束后，將孵育混合物以 13 000 r/min離心10 min，并收集上清液，測(cè)定上清液的熒光值（Ex=480 nm，Em=520 nm）。

1.3.5 納米金粒子比色法檢測(cè)AFB1

1.3.5.1 納米金的制備

納米金采用Frens[33]建立的檸檬酸鈉還原法制備。在燒杯中加入95.8 mL純水，再加入4.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%氯金酸溶液，加熱至沸騰，迅速加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)加熱20 min至沸騰，然后通過(guò)連續(xù)攪拌將溶液冷卻至室溫，得到的酒紅色液體為納米金溶液。通過(guò)紫外-可見光譜進(jìn)行表征。

1.3.5.2 NaCl濃度的優(yōu)化

在100 μL納米金溶液中，加入10 μL不同濃度的NaCl溶液混合，靜置10 min，整個(gè)反應(yīng)都在室溫下進(jìn)行，觀察溶液顏色變化并測(cè)定其A520nm值。

1.3.5.3 適配體濃度的優(yōu)化

在100 μL納米金溶液加入10 μL不同濃度的適配體溶液混合，37 ℃搖床中孵育3 h，最后加入10 μL 750 mmol/L濃度的NaCl溶液，觀察溶液顏色變化并測(cè)定其A520nm值。

1.3.5.4 AFB1的檢測(cè)

在100 μL納米金溶液加入10 μL 2 μmol/L濃度AFB1適配體，37 ℃搖床孵育3 h，再加入不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)樣品孵育1 h，再加入10 μL 750 mmol/L濃度的NaCl溶液，觀察溶液顏色變化并測(cè)定其A520值。

1.3.5.5 特異性的檢測(cè)

為驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)方法的選擇性，分別選取4 ng/μL的AFB1、FB1、OTA、ZEN、DON和T-2毒素，進(jìn)行檢測(cè)，觀察溶液中顏色變化并測(cè)定其A650nm/A520nm值。

1.3.5.6 大米樣品中AFB1的加標(biāo)回收測(cè)定

將市售的大米樣品，經(jīng)過(guò)粉碎研磨，取20 g于錐形瓶中，加標(biāo)后加入100 mL甲醇溶液（體積分?jǐn)?shù)55%），在45 ℃水浴恒溫振蕩器上振蕩1 h。振蕩之后，先用定性濾紙過(guò)濾，再用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至棕色容量瓶。按實(shí)驗(yàn)方法（1.3.5.4節(jié)）測(cè)定吸光度和計(jì)算回收率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定5 次。同時(shí)取上清液用GB 5009.22—2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》中的第二法 高效液相色譜-柱前衍生法進(jìn)行衍生處理、檢測(cè)和計(jì)算回收率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用Origin軟件和GraphPad-Prism6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 SELEX的適配體篩選與回收率

本實(shí)驗(yàn)基于GO可通過(guò)π-π共軛吸附ssDNA，而對(duì)已結(jié)合靶標(biāo)的ssDNA吸附能力較弱的特性，設(shè)計(jì)針對(duì)AFB1核酸適配體的篩選方案。圖1為各輪篩選得到與AFB1結(jié)合的ssDNA的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖1 每輪PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Electrophoretograms of PCR products from every round of SELEX

在SELEX篩選過(guò)程中，每一輪ssDNA都經(jīng)過(guò)苯酚、氯仿、異戊醇抽提和乙醇沉淀法回收，用核酸蛋白儀測(cè)定ssDNA濃度。如圖2所示，前兩輪篩選的回收率不高，可能是因?yàn)閯傞_始隨機(jī)文庫(kù)數(shù)量龐大，與AFB1結(jié)合的ssDNA占總體比例較少。隨著篩選輪數(shù)的增加，能與AFB1結(jié)合的ssDNA也不斷增加。經(jīng)過(guò)10 輪的篩選，能與AFB1結(jié)合的ssDNA已趨于飽和，能從隨機(jī)文庫(kù)中回收一半以上的ssDNA，因此第10輪結(jié)束篩選過(guò)程。

圖2 SELEX每輪篩選所得的結(jié)合AFB1的ssDNA回收率Fig. 2 Recovery of AFB1-bound ssDNA after each round of SELEX

2.2 PCR擴(kuò)增體系退火溫度和循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)定55、58、61.6、65.2、70 ℃五個(gè)退火溫度，如圖3所示，當(dāng)退火溫度為65.2 ℃時(shí)，目的條帶單一且明亮，無(wú)非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，以此作為最佳的退火溫度。

圖3 PCR退火溫度的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of annealing temperature for PCR

本實(shí)驗(yàn)固定退火溫度為65 ℃，同時(shí)設(shè)置16、18、20、22、24、26六個(gè)循環(huán)次數(shù)，如圖4所示，當(dāng)循環(huán)次數(shù)為24時(shí)，目的條帶顏色厚重且條帶單一，可作為最佳PCR循環(huán)次數(shù)。

圖4 65 ℃條件下循環(huán)次數(shù)對(duì)PCR的影響Fig. 4 Effect of number of PCR cycles on amplified products at annealing temperature of 65 ℃

2.3 適配體克隆、測(cè)序及序列分析

表1 第8輪核酸適配體序列Table 1 Aptamer sequences obtained from the eighth round of screening

在第8輪和第10輪中隨機(jī)挑取的60 個(gè)單克隆菌落經(jīng)測(cè)序后利用DNAMAN軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，其中除去非單克隆序列和錯(cuò)誤序列后從中共挑選出45 條核酸適配體序列進(jìn)行下一步的詳細(xì)分析，其中第8輪共得到23 條序列，命名為Seq.1～Seq.23，第10輪共得到22 個(gè)序列，命名為AFB-1～AFB-22。序列結(jié)果如表1、2所示。

表2 第10輪核酸適配體序列Table 2 Aptamer sequences obtained from the tenth round of screening

2.4 適配體的親和力分析

采用熒光分析法測(cè)定候選適配體序列與AFB1親和力。Kd值越小代表與靶標(biāo)的親和力越高，由表3可知，這6 條適配體序列的Kd值在16～47 nmol/L之間，表明適配體對(duì)AFB1親和性較高。6 條核酸適配體所涉及的飽和曲線如圖5所示，在適配體濃度為100 nmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度也趨于平穩(wěn)，結(jié)合反應(yīng)達(dá)到飽和。

表3 挑選出的6 條AFB1適配體的解離常數(shù)Table 3 Dissociation constants of six selected AFB1 aptamers

圖5 AFB1適配體的連接飽和曲線Fig. 5 Binding saturation curves of the selected aptamers to AFB1

2.5 適配體的特異性分析

選取親和力較高的AFB-5和AFB-8進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，如圖6所示，兩條候選適配體在AFB1溶液體系中明顯具有更高的相對(duì)熒光強(qiáng)度，顯示這兩條適配體均能特異性結(jié)合靶標(biāo)AFB1。通過(guò)比較，序列AFB-8特異性最好。這一結(jié)果說(shuō)明通過(guò)兩輪的反篩，降低了對(duì)ZEN、DON、T-2毒素、FB1和OTA的結(jié)合力。

圖6 AFB-5和AFB-8對(duì)不同毒素的相對(duì)結(jié)合力Fig. 6 Relative binding abilities of AFB-5 and AFB-8 to different toxins

2.6 納米金粒子比色法檢測(cè)AFB1

2.6.1 NaCl和適配體濃度的優(yōu)化

合適的NaCl濃度能降低背景的干擾值，從而提高檢測(cè)的靈敏度。如圖7所示，隨著NaCl濃度的增加，納米金顏色由紅色逐漸變紫色最后變?yōu)樗{(lán)灰色。納米金溶液在150 mmol/L濃度的NaCl溶液中幾乎不團(tuán)聚，肉眼看不出差別，仍保持穩(wěn)定的紅色，但通過(guò)紫外-可見吸收光譜可得出A520nm的值降低，當(dāng)NaCl濃度為300～750 mmol/L， 納米金溶液開始出現(xiàn)團(tuán)聚，顏色也逐漸加深，且在520 nm波長(zhǎng)處的吸光度也不斷下降，直到在750 mmol/L處趨于平緩。根據(jù)紫外-可見吸收光譜和顏色變化最終選擇750 mmol/L為最佳鹽濃度。

圖7 在520 nm波長(zhǎng)處的吸光度變化Fig. 7 Changes in absorbance value at 520 nm

適配體在一定程度上可以保護(hù)納米金在高鹽條件下聚沉，但也不是適配體的量越多越好。若吸附納米金的適配體量過(guò)多，將導(dǎo)致納米金在高鹽濃度溶液中不團(tuán)聚變色，使整個(gè)體系中顏色變化受到影響。如圖8所示，當(dāng)適配體濃度為1 μmol/L時(shí)，納米金處于團(tuán)聚狀態(tài)，適配體不能阻止鹽誘導(dǎo)的聚集，當(dāng)適配體濃度為2 μmol/L時(shí)，納米金變?yōu)榧t色，說(shuō)明對(duì)納米金鹽誘導(dǎo)保護(hù)效果較好，相應(yīng)的A520nm出現(xiàn)增大的趨勢(shì)，且在濃度2 μmol/L以后A520nm值趨于平穩(wěn)，適配體結(jié)合納米金已經(jīng)飽和。故選擇適配體濃度 2 μmol/L做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖8 最適適配體濃度的篩選Fig. 8 Selection of the optimal concentration of aptamer

2.6.2 線性范圍和檢出限

將納米金溶液與適配體進(jìn)行孵育，然后加入不同質(zhì)量濃度的AFB1溶液，最后加入高濃度的NaCl溶液。如圖9所示，通過(guò)紫外-可見吸收光譜可得，隨著AFB1質(zhì)量濃度的增大，A520nm值逐漸降低。再通過(guò)A520nm值繪制AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為y=-0.007 09x＋0.461 42，R2=0.997 9，線性范圍為0.025～10 ng/mL，檢測(cè)限為0.025 ng/mL。

圖9 不同AFB1質(zhì)量濃度下納米金紫外-可見吸收?qǐng)D譜Fig. 9 UV-visible absorption spectra of AuNPs at different concentrations of AFB1

2.6.3 特異性分析

分別選取質(zhì)量濃度為4 ng/mL的AFB1、FB1、OTA、ZEN、DON和T-2毒素進(jìn)行測(cè)定。如圖10所示，該方法在測(cè)定除AFB1外的5 種毒素時(shí)A650nm/A520nm的值變化較小，故特異性較好。

圖10 核酸適配體的特異性檢測(cè)結(jié)果Fig. 10 Specificity evaluation of nucleic acid aptamers

2.6.4 大米樣品中AFB1加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的大米樣品中分別加入不同質(zhì)量濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)比對(duì)，計(jì)算加標(biāo)回收率，每個(gè)添加水平設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)用高效液相色譜法對(duì)相同樣品進(jìn)行檢測(cè)。如表4所示，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的AFB1檢測(cè)方法與傳統(tǒng)高效液相色譜法相比，結(jié)果相差不大，表明本檢測(cè)方法具有可行性。

表4 大米樣品中AFB1的檢測(cè)回收率（n=5）Table 4 Recoveries of AFB1 in spiked rice samples (n= 5)

3 討論與結(jié)論

AFB1相對(duì)分子質(zhì)量?jī)H為312.27，且不具備任何活性基團(tuán)，用離心沉淀法和毛細(xì)管電泳等傳統(tǒng)篩選方法不能將靶標(biāo)物質(zhì)與適配體分離出來(lái)，大大增加了篩選難度。本實(shí)驗(yàn)采用GO的SELEX篩選方法，無(wú)需將AFB1做任何修飾，避免繁瑣的活化固定過(guò)程，同時(shí)還能保持其完整結(jié)構(gòu)，不會(huì)影響適配體的親和力，為篩選適配體提供了簡(jiǎn)單、快速的方法，有效地降低了篩選成本，縮短了篩選時(shí)間。目前采用此篩選方法已獲得岡田酸[34]、T-2毒 素[35]、棒曲霉素[36]、玉米赤霉烯酮[37]、氧氟沙星[38]、重金屬砷[39]等高親和性高特異性適配體序列。

迄今為止有關(guān)AFB1特異性適配體序列報(bào)道不多，僅有楊朝勇等[40]基于瓊脂糖微株分離-流式細(xì)胞術(shù)分析的親和SELEX方法篩選制備和王文鳳[41]采用磁珠負(fù)篩SELEX技術(shù)篩選得到。但兩種方法都先需要將靶標(biāo)固定在瓊脂糖微珠或氨基化的磁珠上，都涉及一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，還可能因改變其原有結(jié)構(gòu)以及固相載體的空間位阻效應(yīng)而影響適配體的篩選效果[42]。

在篩選過(guò)程另一大難點(diǎn)就是消除非特異干擾，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增一方面可能是因?yàn)镻CR條件不理想，如退火溫度太低、擴(kuò)增循環(huán)輪數(shù)太多；另一方面很可能是因?yàn)镻CR體系混有了GO，雖然在篩選過(guò)程中，盡可能地多次離心，去除GO沉淀，但是還是有少量GO混雜在模板中，參與了PCR擴(kuò)增。經(jīng)查閱參考文獻(xiàn)，證實(shí)這一推測(cè)，魏曉磊[43]研究證明，GO可能會(huì)結(jié)合到TaqDNA聚合酶上，降低酶的活性，或是與DNA模板本身相互作用，導(dǎo)致DNA構(gòu)象發(fā)生改變。不管GO是與DNA模板結(jié)合還是與DNA聚合酶結(jié)合，都會(huì)使PCR擴(kuò)增效率降低，一定程度上抑制PCR，導(dǎo)致DNA產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增反應(yīng)，使產(chǎn)物條帶變得不再單一，或是產(chǎn)生引物二聚體。

將測(cè)序得到的45 條適配體序列與原始序列相比，一部分序列的長(zhǎng)度大于原始序列長(zhǎng)度，可能是由于多次重復(fù)PCR造成的。這些序列長(zhǎng)度的增加，有可能改變G-C對(duì)數(shù)量或莖距距離。這些有可能會(huì)改變適配體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性或親和力。Sekhon等[44]研究了通過(guò)突變或刪除G-C對(duì)和干莖距離對(duì)銅親和力的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)G-C對(duì)從1增加2時(shí)，突變之后的適配體比原始適配體親和力增加了10 倍。若從原始適配體序列中刪除一個(gè)G-C對(duì)時(shí)，適配體結(jié)構(gòu)改變，其親和力增加了100 倍。此外，莖間距也對(duì)親和力有影響，當(dāng)間距從2 nt增加到4 nt時(shí)，改變后的適配體親和力有所下降，Kd值下降了近10 倍，由 7.88×10-11mol/L變?yōu)?.65×10-10mol/L。

基于核酸適配體的識(shí)別與檢測(cè)方法逐漸為一種新的普遍適用的技術(shù)，因此篩選AFB1的特異性適配體并發(fā)展核酸適配體技術(shù)應(yīng)用于AFB1的檢測(cè)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)所建立的基于核酸適配體識(shí)別的AFB1比色檢測(cè)方法，具有快速靈敏低成本易操作可視化等優(yōu)勢(shì)，并可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，但AFB1與其適配體的結(jié)合機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。