吳玉晗，陳 偉

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

四環(huán)素是廣譜類抗生素，是一種從放線菌金色鏈叢菌培養(yǎng)液分離出來的抗菌物質(zhì)[1]，因具有優(yōu)良的廣譜抗菌性，預(yù)防和抗病能力強，被廣泛用于治療和預(yù)防動物疾病。但由于在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中的不合理使用和濫用，造成四環(huán)素在牛乳中的殘留問題[2]。許多國家都規(guī)定了牛奶中四環(huán)素的殘留限量，歐盟及我國對四環(huán)素最大殘留限量的規(guī)定均為0.1 mg/kg[3]。青霉素是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有 β-內(nèi)酰胺環(huán)的一類抗生素[4]，它由于能夠阻止細菌細胞壁的合成而呈現(xiàn)殺菌活性，常用于預(yù)防和控制各種細菌引起的動物的尿道、胃腸道和呼吸道感染，治療奶牛的乳腺炎[5]。青霉素G由于其廣譜、價格低廉而被大量甚至是超劑量的使用，導(dǎo)致牛乳中含有較高劑量的殘留物，進而通過食物鏈危害人體健康，人體長期攝入含有該抗生素殘留的食物易導(dǎo)致細菌耐藥性增加，過敏反應(yīng)和體內(nèi)菌群失調(diào)[6]等癥狀。

目前報道的食物中四環(huán)素和青霉素抗生素殘留的檢測方法主要有儀器分析法[7-9]、微生物測定法[10-11]和免疫分析法[12-13]。儀器分析法主要包括高效液相色譜法[14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]，其準確性高，但存在設(shè)備操作復(fù)雜、耗時時間長、對操作人員要求高、難以滿足現(xiàn)場快速檢測的需要。微生物法雖然檢測成本低，但靈敏度不高，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果?，F(xiàn)常用的免疫分析法包括酶聯(lián)免疫檢測法[16]和放射免疫分析法[17]，具有快速、靈敏等特點，但兩者的前處理過程較為復(fù)雜，對于現(xiàn)場大規(guī)模篩查樣品有很大的局限性。

側(cè)向免疫層析技術(shù)是近幾年來發(fā)展比較迅速的制備檢測試紙條基本方法的快速檢測技術(shù)[18]，其以條狀纖維層析材料為固相，借助毛細管的吸附作用使樣品在層析材料上移動，樣品中的待測物與層析材料上一定區(qū)域的配體發(fā)生特異性的免疫結(jié)合反應(yīng)，通過可目測標記物（如膠體金）的顯色反應(yīng)短時間獲得直觀的測試結(jié)果，廣泛應(yīng)用于臨床檢驗和食品檢測等領(lǐng)域[19-20]。膠體金免疫層析技術(shù)以膠體金為示蹤標記物，將膠體金標記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法有機結(jié)合 起來[21]。其靈敏度高、對操作人員要求低，并且不需要昂貴的儀器設(shè)備，易于實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，主要作為定性或半定量篩選檢測手段[22]。目前已有使用金標免疫層析法檢測牛乳中的β-內(nèi)酰胺和四環(huán)素類抗生素，其最低檢測靈敏度僅可達到4 ng/mL和80 ng/mL[23]，其中四環(huán)素檢測的檢出限遠低于國家標準。近幾年也有很多關(guān)于使用膠體金免疫層析法單獨檢測四環(huán)素類抗生素的研究，但其檢測靈敏度都不是很高，比如檀尊社等[24]研制的膠體金免疫層析試劑，檢測的水產(chǎn)品中四環(huán)素含量，檢出限為100 ng/mL。本研究以膠體金側(cè)向免疫層析技術(shù)為基礎(chǔ)，加以改進，采用牛乳樣品與金標抗體提前孵育后上樣的方法，與傳統(tǒng)檢測方法相比靈敏度得到顯著提高，達到了增敏的效果。且牛乳樣品不需要前處理，操作簡單，大大提高了檢測效率，可實現(xiàn)快速同時檢測牛乳樣品中兩種抗生素的目的，適合現(xiàn)場快速篩查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳 市購；氯金酸（分析純） 百靈威科技有限公司；檸檬酸三鈉、碳酸鉀（均為分析純）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，純度＞98%） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；青霉素標準品（純度99.9%）、四環(huán)素標準品（化學(xué)純） 國家標準品物質(zhì)中心；青霉素、四環(huán)素抗體和包被 天津生物科技有限公司；羊抗鼠二抗、吸水墊、樣品墊、PVC支撐底板和硝酸纖維素膜 上海捷寧生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Heraeus Fresco 17高速冷凍離心機 美國賽默飛科技公司；AL104分析天平 上海精天電子儀器有限公司；EOS600D單反相機 佳能光學(xué)設(shè)備有限公司；XYZ-3試紙條噴膜儀、CM-4000試紙條切條機 美國Bio-Dot公司；RCT加熱磁力攪拌器 廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；移液器 芬蘭雷勃公司；DHG-9101-SA 恒溫干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備[25]。將50 mL雙蒸水倒入250 mL錐形瓶中，再滴加850 μL 5 mg/mL氯金酸溶液于雙蒸水中，置于磁力加熱攪拌器上加熱到微沸。當錐形瓶中液體微沸后，保持1 500 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速不變，再迅速加入一定體積質(zhì)量濃度為10 g/L的檸檬酸三鈉溶液。溶液顏色在2 min內(nèi)發(fā)生明顯變化，透明-黑-紫-酒紅，至顏色不變后，關(guān)閉熱源，繼續(xù)攪拌5 min即可，冷卻，于4 ℃冰箱保存。

1.3.2 單克隆抗體-膠體金標記物的制備

取1 mL制備好的膠體金溶液，用0.1 mol/L碳酸鉀溶液，調(diào)至pH值約為7.2，再加入6 μL四環(huán)素抗體振蕩反應(yīng)1 h后，再加入100 μL質(zhì)量分數(shù)為10%的BSA溶液，繼續(xù)振蕩反應(yīng)0.5 h，9 600 r/min離心10 min，產(chǎn)生紅色沉淀；10% BSA 100 μL復(fù)溶后即可得到四環(huán)素的金標抗體溶液，置4 ℃?zhèn)溆谩０赐瑯拥姆椒ㄖ苽淝嗝顾貑慰寺】贵w-膠體金標記物。

1.3.3 膠體金雙重試紙條的組裝

試紙條由樣品墊、NC膜和吸水墊3 個部分組成。首先將寬度為22 mm玻璃纖維素膜在樣品墊預(yù)處理液中浸泡2 h后，取出于27 ℃條件下烘干待用。然后將羊抗鼠二抗、四環(huán)素-BSA和青霉素-BSA用10 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）稀釋至1 mg/mL，用噴膜儀依次噴至NC膜上，作為質(zhì)控線和兩條檢測線，27 ℃烘干2 h后取出，最后將樣品墊、NC膜和吸水墊依次粘貼在塑料底板上，用切條機切割成3 mm寬的試紙條保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 試紙條的檢測

1.3.4.1 偶聯(lián)過程中抗體添加量的優(yōu)化

在膠體金與標記抗體偶聯(lián)過程中，加入不同添加量的抗體進行偶聯(lián)，確定最適宜的偶聯(lián)抗體條件。

1.3.4.2 偶聯(lián)過程中偶聯(lián)pH值的優(yōu)化在膠體金與標記抗體偶聯(lián)過程中，加入不同添加量碳酸鉀溶液進行偶聯(lián)，確定最適宜的偶聯(lián)pH值條件。

1.3.5 靈敏度檢測

取四環(huán)素和青霉素標準品溶液，用pH 7.2、0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液稀釋到不同質(zhì)量濃度，不同質(zhì)量濃度的混合溶液與金標偶聯(lián)物在孵育器上孵育10 min后，滴加到試紙條上進行測試，在孵育器上測試10 min后觀察試紙條顯線結(jié)果。

1.3.6 特異性檢測

將牛乳中常檢的其他抗生素、藥物和添加劑：克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、三聚氰胺、氯霉素用pH 7.2、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋后用試紙條進行檢測，判斷試紙條的特異性。

1.3.7 添加回收實驗

向空白牛乳樣品中添加四環(huán)素和青霉素標準溶液，使其四環(huán)素和青霉素質(zhì)量濃度分別均為0.05、1、 2 ng/mL，依照1.3.5節(jié)方法進行檢測，得到的結(jié)果計算加標回收率，再分別對每種檢測物的3 個質(zhì)量濃度滴度平行測定8 次，計算相對標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測原理

圖1 四環(huán)素和青霉素雙重檢測試紙條原理圖Fig. 1 Schematic diagram of the test strip used for detection of tetracycline and penicillin

圖1 為四環(huán)素和青霉素雙重檢測的原理圖。當C線、T1線和T2線均顯色，無論顏色深淺均表示牛乳樣品中兩種抗生素質(zhì)量濃度低于檢出限；當C線和T2線顯色，T1線無顯色，表示牛乳樣品中四環(huán)素質(zhì)量濃度等于或高于檢出限；當C線和T1線顯色，T2線無顯色，表示牛乳樣品中青霉素質(zhì)量濃度等于或高于檢出限。

2.2 抗體量的優(yōu)化

圖2 四環(huán)素（a）和青霉素（b）在不同抗體量下的試紙優(yōu)化結(jié)果Fig. 2 Optimization of antibody dose

與金納米粒子偶聯(lián)的四環(huán)素與青霉素抗體量優(yōu)化結(jié)果如圖2所示，向相同體積的金納米粒子溶液中加入不同體積1 mg/mL的四環(huán)素與青霉素抗體，可以明顯看出，隨著加入抗體體積的增大，陰性T線強度有明顯的提高，C線強度變化不明顯。四環(huán)素抗體量3 μL時陰性強度明顯強于1 μL時的抗體量，出于節(jié)約原料方面考慮，四環(huán)素選擇抗體量為3 μL；而青霉素隨著抗體量增加，陰性強度逐漸增強，青霉素抗體量選擇為5 μL。

2.3 偶聯(lián)pH值的優(yōu)化

免疫層析試紙條制備過程中偶聯(lián)pH值的選擇對檢測靈敏度極為重要。用制備的試紙條對不同質(zhì)量濃度的實際樣品進行檢測，結(jié)果如圖3所示，比較偶聯(lián)添加不同碳酸鉀量，可以看出，四環(huán)素在碳酸鉀添加量為5 μL時靈敏度較3 μL時高，陰性較7 μL時強，所以四環(huán)素的碳酸鉀添加量選擇5 μL；青霉素隨著碳酸鉀添加量的增加，陰性有減弱的趨勢，而靈敏度并沒有因此增加，因此青霉素偶聯(lián)碳酸鉀量選擇2 μL。

圖3 四環(huán)素（a）和青霉素（b）在不同偶聯(lián)pH值下的試紙優(yōu)化結(jié)果Fig. 3 Optimization of pH for coupling reaction

2.4 四環(huán)素和青霉素的單重檢測結(jié)果

制作好的免疫膠體金試紙條于肉眼下觀察，10 min即可出現(xiàn)結(jié)果。分別對四環(huán)素和青霉素利用雙重試紙條進行靈敏度檢測，由圖4a、b可得，在只有四環(huán)素或者青霉素獨立存在的情況下，隨著四環(huán)素和青霉素質(zhì)量濃度的增大，檢測線的顯線強度不斷減弱，且四環(huán)素和青霉素靈敏度分別達到1 ng/mL和2 ng/mL。再根據(jù)顯色結(jié)果對T1、T2線作出峰形圖，結(jié)果如圖4c、d所示，在只有四環(huán)素存在的情況下，T1線信號強度峰值隨著四環(huán)素質(zhì)量濃度增高而不斷降低，T2峰值穩(wěn)定；在只有青霉素存在的情況下，T2線信號強度峰值隨著青霉素濃度增高而不斷降低，T1峰值穩(wěn)定，表明四環(huán)素和青霉素互相之間不存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象。

圖4 四環(huán)素（a、c）和青霉素（b、d）的單重檢測結(jié)果Fig. 4 Results of separate detection of tetracycline and penicillin

2.5 四環(huán)素和青霉素的雙重檢測結(jié)果

同時對四環(huán)素和青霉素進行靈敏度檢測，即將二者的標準品溶液稀釋不同質(zhì)量濃度后混合上樣，10 min后觀察結(jié)果如圖5a所示，隨著四環(huán)素和青霉素質(zhì)量濃度的增大，兩條T線顏色均逐漸減弱，且檢出限皆可達到 2 ng/mL。再根據(jù)顯色結(jié)果對C、T線作出峰形圖以及根據(jù)峰形圖得出的線性圖，結(jié)果如圖5b所示，T1和T2的峰高均隨著兩種抗生素質(zhì)量濃度的增大而逐漸減弱。結(jié)果表明，在0～2 ng/mL的四環(huán)素和青霉素質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，根據(jù)試紙檢測結(jié)果T線強度峰面積和四環(huán)素與青霉素同時檢測質(zhì)量濃度關(guān)系繪制標準曲線，所建立的免疫膠體金檢測方法對四環(huán)素和青霉素的同時檢測具有良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程分別為Y1＝435-1 612X（＝0.995 6）和Y2＝252-1 086X（＝0.989 3）。

圖5 四環(huán)素和青霉素的雙重檢測結(jié)果Fig. 5 Results of simultaneous detection of tetracycline and penicillin

2.6 特異性驗證結(jié)果

圖6 四環(huán)素和青霉素的特異性檢測結(jié)果Fig. 6 Specificity evaluation of the test strip for detection of tetracycline and penicillin

如圖6所示，選取另外幾種牛乳中常檢的抗生素和添加劑：克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、三聚氰胺、氯霉素、鏈霉素。6 種小分子及四環(huán)素和青霉素的檢測質(zhì)量濃度均為1 μg/mL。如圖6a所示，四環(huán)素和青霉素結(jié)果的T線完全消失，四環(huán)素的T1線消失，青霉素的T2線消失，其余6 種小分子的檢測結(jié)果相同，即3 條線同時存在，說明質(zhì)量濃度為1 μg/mL的6 種小分子均不能使試紙檢測達到消線水平，同時對顯線結(jié)果做出了峰形 （圖6b），都說明此方法的特異性很強。

2.7 添加回收實驗結(jié)果

將四環(huán)素和青霉素標準品溶液加入空白牛乳樣品中，使其四環(huán)素和青霉素質(zhì)量濃度分別均為0.05、1、2 ng/mL，每個滴度設(shè)8 個重復(fù)，樣品準備好后，用免疫層析試紙條進行檢測，并用Image J掃描其結(jié)果得到T線灰度值，根據(jù)標準曲線計算四環(huán)素和青霉素含量及其回收率。如表1所示，四環(huán)素回收率在98.6%～100.2%之間，青霉素回收率在97.1%～101.3%之間。

表1 牛乳樣品中四環(huán)素和青霉素的添加回收實驗Table 1 Recoveries of tetracycline and penicillin spiked in milk samples

3 結(jié) 論

膠體金側(cè)向免疫層析技術(shù)是以膠體金作為示蹤標記物應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型的免疫標記技術(shù)[26]，由于其高效、簡便、快速的性能，在現(xiàn)場篩查中得以廣泛應(yīng)用。多元檢測是膠體金免疫層析法發(fā)展的趨勢，它能同時高效檢測目標物，降低檢測成本[27]。本實驗基于膠體金側(cè)向免疫層析方法，建立能同時檢測牛乳中殘留的四環(huán)素和青霉素的方法，結(jié)果表明本實驗研制的試紙條能達到聯(lián)檢的目的，特異性較高。此外該方法舍棄了使用金標墊的傳統(tǒng)型試紙條檢測方法，利用預(yù)孵育的高效性，與傳統(tǒng)檢測方法相比，既保留了檢測樣品無需預(yù)處理、檢測快速等優(yōu)點，又顯著提高了檢測靈敏度[28]。在最優(yōu)化條件下增敏型試紙條對四環(huán)素和青霉素的檢出限為2 ng/mL，檢測時間10 min，檢測特異性好，同時也適用牛乳樣品中四環(huán)素和青霉素殘留檢測。

本研究成功建立了四環(huán)素和青霉素的雙重免疫層析試紙條檢測方法，研制的試紙條對四環(huán)素和青霉素具有很高的特異性和敏感性。驗證實驗證明，該試紙條使用方便、快捷且操作簡單，在對大量食品樣本現(xiàn)場篩檢方面具有重要的應(yīng)用價值，為我國現(xiàn)有食品檢測技術(shù)提供了重要參考[29-30]。