王樂飛，古紹彬,2，吳 影,2,

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.河南省食品微生物工程技術研究中心，食品加工與安全國家級實驗教學示范中心，河南 洛陽 471023）

棗（Zizyphus jujubaMill.）是鼠李科棗屬植物，在我國具有6 000余年的種植歷史，并廣泛分布在歐洲、南亞和東亞、澳大利亞等地[1]。迄今為止，中國已發(fā)現(xiàn)700余棗樹品種[2]。中國是唯一的棗果出口國家，它的種植面積已達150萬 公頃，年產(chǎn)新鮮棗果420萬 t[3]。棗果含有豐富的生物活性物質，具有良好的營養(yǎng)和保健價值，可直接食用，也可用作食品添加劑和調(diào)味劑[4]。研究表明，棗果含有多種營養(yǎng)成分，包括三萜酸、黃酮、磷脂、氨基酸、酚酸、礦物成分和多糖[5-10]，具有增強免疫力、抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗炎殺菌、鎮(zhèn)靜等多種作用[11-14]。

棗果是含有黃酮類化合物的“木本糧食”之一，對人類飲食具有重要貢獻[15-16]，黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物的重要組成部分，包括花青素、黃烷類、黃酮、黃烷酮、黃酮醇和查爾酮等[17]。研究表明黃酮類化合物具有許多生物學功能和保健作用，如抗氧化、抗糖尿病、抗炎和降低高血壓[18-19]。此外，黃酮類化合物與果皮顏色密切關聯(lián)[20-22]，黃酮類化合物是重要的水溶性色素，是很多水果呈現(xiàn)紅色的原因，包括蘋果、葡萄、草莓和 荔枝[23-25]。盡管人們對黃酮類化合物抗氧化活性研究較為深入和系統(tǒng)，但有關黃酮類化合物種類、含量及變化規(guī)律與棗果皮顏色間的內(nèi)在關系卻鮮見報道[26]。

為研究棗果皮顏色變化和黃酮類化合物間的內(nèi)在關系，采用超高效液相色譜-質譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）技術，結合代謝組學分析方法[27]，選取顏色區(qū)分顯明的3 個發(fā)育階段（即“三變紅”棗），分析黃酮類化合物的種類和含量與顏色變化的關系。利用主成分分析（principle component analysis，PCA）[28]，初步區(qū)分3 個不同的發(fā)育階段，繼而通過正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least square-discriminate analysis，OPLS-DA），對不同階段黃酮類化合物進行判別分析，通過聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）3 個不同發(fā)育階段黃酮類化合物的組成及含量的分布規(guī)律，并對關鍵黃酮代謝物篩選[29]。本研究可更好地理解棗果發(fā)育過程中形成顏色的黃酮類物及棗果特性，對揭示“三變紅”棗果著色機理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“三變紅”棗果來源于河南科技大學實習基地，如圖1所示，發(fā)育階段S1為紫紅色、S2為綠白色、S3為深紅色，分別對應于開花后的第30、95、120天形態(tài)。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Meker公司。

圖1 “三變紅”棗果實發(fā)育的顏色變化Fig. 1 Color changes during fruit development of “Sanbianhong” jujube

1.2 儀器與設備

6500 QTRAP UPLC-MS儀 美國AB Sciex公司；MM 400研磨儀 德國Retsch公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集和預處理

為了使統(tǒng)計數(shù)據(jù)更加準確，隨機選取表型性狀穩(wěn)定，具有相似的活力、樹齡和高度的3 棵棗樹，每棵棗樹作為1 個樣品，進行了立體采樣，在棗樹的東西南北4 個方向采樣，S1、S2、S3期分別采集棗果40 g左右，去掉果核，用小刀輕輕刮去棗肉，直到無肉眼可見明顯果肉，獲得棗皮后，利用研磨儀磨棗皮（30 Hz，1.5 min）至粉末狀，稱取100 mg的粉末，溶于1.0 mL提取液（70%的甲醇溶液）中，溶解后樣品放置4 ℃冰箱12 h，每隔4 h渦旋1 次，共渦旋3 次，以提高提取率， 10 000×g離心10 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：A為體積分數(shù)0.04%乙酸溶液，B為體積分數(shù)0.04%乙酸-乙腈溶液；洗脫梯度：0～11 min，95% A，5% B；11～12 min，95%～5% A，5%～95% B；12～15 min，5%～95% A，95%～5% B；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

1.3.3 質譜條件

電噴霧離子源溫度500 ℃，質譜電壓5 500 V，氣簾氣25 psi，碰撞誘導電離參數(shù)設置為高。在三重四極桿中，每個離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進行掃描檢測。

1.3.4 黃酮類化合物分析

1.3.4.1 定性分析

利用軟件Analyst 1.6.1進行數(shù)據(jù)采集，基于自建數(shù)據(jù)庫MWDB（含有5 000 種以上小分子化合物的一級和二級圖譜）及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫（ChemBank：http://chembank.med.harvard.edu/compounds；pubchem：https://pubchemblog.ncbi.nlm.nih.gov/；NIST Chemistry Webbook：http://webbook.nist.gov/）。根據(jù)二級譜信息進行物質定性，分析時去除了同位素信號，含K＋、Na＋、NH4＋的重復信號，以及本身是其他更大分子質量物質的碎片離子的重復信號。

1.3.4.2 定量分析

黃酮物質定量是利用三重四極桿質譜的多反應監(jiān)測模式分析完成。對于已鑒定的黃酮類化合物，計算一級質譜中的提取離子色譜峰的峰面積，對所有物質質譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質譜出峰進行積分校正[30]，對棗果皮黃酮類化合物的相對含量進行比較分析。

1.3.4.3 總黃酮含量的測定

1）標準曲線的制作

分別吸取0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL的蘆丁標準溶液（0.528 mg/mL）于5 個25 mL容量瓶中，加入12.5 mL體積分數(shù)為70%的乙醇溶液、0.7 mL質量分數(shù)為5%的NaNO2溶液，搖勻后靜置5 min，加入0.7 mL質量分數(shù)為10%的Al(NO3)3溶液，靜置6 min后，再加入5 mL 1 mol/L 的NaOH溶液，搖勻后用體積分數(shù)70%的乙醇溶液定容，10 min后以試劑空白為參比，在510 nm波長處測定各標準溶液的吸光度。

2）樣品總黃酮含量的測定

從棗皮黃酮提取物中準確吸取0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，測定其在510 nm波長處的吸光度，然后按下式計算總黃酮含量（以干質量計）：

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Office Excel 2016和SPSS 23.0（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）進行統(tǒng)計分析。使用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan倍數(shù)進行統(tǒng)計學評估確定顯著異，P＜0.05，差異顯著。使用OriginPro 2016和Adobe Illustrator CC繪制圖片，HCA、PCA和OPLSDA，使用R（http://www.r-project.org/）進行[31]。

2 結果與分析

2.1 “三變紅”果實發(fā)育過程中棗皮總黃酮含量定量分析

圖2 “三變紅”3 個不同發(fā)育階段棗皮總黃酮的含量分析Fig. 2 Total flavonoid contents at three different developmental stages of “Sanbianhong” jujube

如圖2所示，3 個不同發(fā)育時期，S1的總黃酮含量略高于S3（P＞0.05），但顯著高于S2（P＜0.05），達到4.94 mg/g。S3中總黃酮含量為4.45 mg/g。S2的總黃酮含量最低，僅為0.95 mg/g。在“三變紅”棗果S1～S3不同發(fā)育時期，棗果顏色從深到淺再到深，總黃酮含量變化趨勢與之相同，從高到低再到高，表明總黃酮含量與棗果皮顏色變化呈正相關。

2.2 棗果不同發(fā)育時期的黃酮代謝判別分析

基于棗果實不同發(fā)育時期總黃酮含量建立了PCA模型（圖3A），由于采用無監(jiān)督的降維分析方法，統(tǒng)計分析結果表明，總黃酮無法以不同發(fā)育時期為指定變量獲得較好聚類效果。為此，采用OPLS-DA法，通過對不同處理樣本（如觀測樣本、對照樣本）的特性分別進行訓練，產(chǎn)生訓練集，并預先對所需的觀察變量進行分組，然后根據(jù)組別性質對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，從而精確獲悉影響分組的關鍵變量。以R對棗果不同發(fā)育時期總黃酮相對含量為基礎進行分析，建立了OPLS-DA模型，如圖3B所示，該OPLS-DA模型將棗果3 個不同發(fā)育時期清楚地區(qū)分開，且重復的樣品緊湊地聚集在一起，從而表明該實驗的可重復性和可靠性。PC1解釋了總變量的53.9%，PC2解釋了總變量的19.3%，累計貢獻率達到73.2%，2 個PC可很好地解釋總體變量的情況。由于當變量數(shù)大于樣品數(shù)時，使用有監(jiān)督判別方法進行分析時易產(chǎn)生過擬合現(xiàn)象，因此采用了置換檢驗法對OPLS-DA在無差異情況下的建模效果進行了考察（n=200，即進行200 次排列實驗），結果如圖3C所示。通過對OPLS-DA進行排列驗證，Q2為0.963，遠大于0.5，結果表明該模型擬合優(yōu)異，且R2Y大于Q2，R2Y和Q2的差值小于0.3，表明該模型的解釋度和預測度較優(yōu)。

圖3 棗果不同發(fā)育時期PCA得分圖和OPLS-DA得分圖及其驗證模型Fig. 3 PCA score plot, OPLS-DA score plot and verification model for total flavonoid contents at different developmental stages of jujube fruit

2.3 黃酮類化合物差異代謝物篩選

基于OPLS-DA結果，獲得的多變量分析OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in project，VIP）初步篩選出不同樣品的差異代謝物；同時結合差異倍數(shù)值（fold change，F(xiàn)C）進一步精選出差異代謝物。通常認為FC≥2或FC≤0.5，同時VIP≥1的代謝物為差異代謝物；其中FC≥2或FC≤0.5表示代謝物在對照組和實驗組中差異為2 倍以上或0.5以下，當FC≥2表示差異上調(diào)，F(xiàn)C≤0.5則表示差異下調(diào)；VIP值則表示對應代謝物組間差異在模型中各組樣本分類判別中的影響強度，VIP≥1的代謝物為差異顯著?；赩IP和FC值，得出差異代謝物的火山圖（圖4）。

通過S1和S2比較，發(fā)現(xiàn)26 種差異代謝物，其中24 種下調(diào)，2 種上調(diào)，說明從幼果S1期紫紅色到白熟S2期綠白色，色澤逐步減退，黃酮類化合物大部分下調(diào)，通過S3和S2比較（圖4B），發(fā)現(xiàn)26 種差異代謝物，其中21 種下調(diào)，5 種上調(diào)，與成熟期S3相比，白熟期S2的酮類化合物大部分下調(diào)，與顏色的變淺保持一致。通過S1和S3比較（圖4C），發(fā)現(xiàn)6 種差異代謝物，3 種含量下調(diào)，3 種含量上調(diào)，S1和S2顏色差異不大，棗黃酮類化合物上調(diào)和下調(diào)的數(shù)量一致。本研究結果表明，棗黃酮類化合物隨著顏色的變化而變化，當顏色變深時，黃酮類化合物大部分上調(diào)，顏色變淺時，呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢。Park等[32]研究證實色素分子的含量和種類是決定植物顏色的主要因素。Wang Aimin等[33]研究發(fā)現(xiàn)甘薯黃酮類化合物的種類與甘薯呈色呈現(xiàn)明顯相關性，其中紫色甘薯中糖基化黃酮和金圣草素含量較為豐富，黃色甘薯和白色甘薯黃酮類物質含量明顯低于紫色甘薯。Li Jing等[29]研究結果表明紅花蕎麥葉片中總黃酮的含量與色澤深度呈正相關，紅花蕎麥葉片黃酮類物質含量最高，達到223.04 mg/g，而當黃酮類物質低于 223.04 mg/g時，色澤偏弱。

圖4 黃酮類化合物差異代謝物火山圖Fig. 4 Volcano map of differential flavonoid metabolites

2.4 “三變紅”不同發(fā)育時期關鍵成分的HCA

圖5 3 個不同發(fā)育時期棗黃酮差異代謝物熱圖Fig. 5 Heat map of differential flavonoid metabolites among three fruit developmental stages

為更清晰探究“三變紅”棗果在發(fā)育過程中的顏色變化與黃酮類化合物的關聯(lián)特征，進一步采用HCA對關鍵黃酮類化合物進行分析。如圖5所示，這些關鍵差異性成分在S1、S2、S3中的含量分布上呈現(xiàn)一定的規(guī)律特征（圖中化合物相對含量從綠色到紅色為逐漸升高）。S1中的黃酮類代謝產(chǎn)物與S2和S3形成鮮明對比，含量具有較大差異，槲皮素3-O-蕓香糖苷、甲基槲皮素O-己糖苷、木犀草素O-芥子酰己糖苷、羥甲基黃酮5-O-己糖苷、柚皮素O-丙二酰己糖苷、3,4,5-三羥黃酮O-蕓香糖苷、6-C-己糖基-木犀草素O-己糖苷、異牧荊素，在含量分布上的變化趨勢最為明顯，其含量在S1中遠高于S2和S3，被鑒定為S1階段的特征性物質，這些物質多為黃酮醇和黃酮碳糖苷，它們對S1發(fā)育期棗果的紫紅色形成可能發(fā)揮著重要作用。Beninger等[34]研究發(fā)現(xiàn)黃酮醇苷對菜豆種皮呈現(xiàn)紫色和紅色具有密切的相關性。Eiro等[35]研究進一步證實黃酮醇多以糖苷態(tài)的形式存在，能與花色苷類物質發(fā)生輔色作用，對顏色穩(wěn)定具有重要的作用。 S2的黃酮類化合物顯著低于S1和S3，這與S2期果實的所呈現(xiàn)出綠白的顏色較為吻合，含量較高僅有2 種，分別是C-己糖基木犀草素O-己糖苷、6-C-己糖苷-芹菜素O-己糖苷。S3中含量較高的物質為矢車菊素O-己糖基、芹菜素O-己糖基-戊糖苷、槲皮素5-O-己糖苷-O-丙二酰己糖苷、金圣草黃素O-葡萄糖醛酸（水楊醇）醚O-二葡萄糖醛酸、金圣草黃素，這些物質多為糖基化的黃酮，屬于黃酮糖苷類化合物中的花色苷類物質，它們對S3時期棗皮呈現(xiàn)出深紅色具有重要影響。何丹等[36]在研究紫色西番蓮果皮花色苷時指出，花色苷是天然色素的主要成分之一，其可賦予水果、蔬菜和花卉等植物靚麗的藍色、紅色和紫色。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的上述差異性物質可作為區(qū)分棗果皮顏色的潛在標志物，為棗黃酮類化合物與棗果皮顏色的關聯(lián)研究提供理論基礎。

3 結 論

本實驗以“三變紅”棗果不同發(fā)育時期為切入點，研究棗果皮顏色變化和黃酮類化合物的關聯(lián)，結果發(fā)現(xiàn)S1的總黃酮含量略高于S3，但顯著高于S2 （P＜0.05），達到4.94 mg/g；而棗果從S1至S3期，顏色經(jīng)歷了從由紫紅到綠白再到深紅過程，總黃酮含量變化與棗果顏色變化呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，由此表明棗總黃酮的含量與棗果皮顏色變化表現(xiàn)為明顯正相關。利用PCA和OPLS-DA，將S1幼果期、S2白熟期和S3成熟期的黃酮類化合物清晰的HCA，并通過黃酮類化合物差異代謝物篩選出59 個差異代謝物。采用聚類熱圖分析發(fā)現(xiàn)，槲皮素3-O-蕓香糖苷、甲基槲皮素O-己糖苷、木犀草素O-芥子酰己糖苷、羥甲基黃酮5-O-己糖苷、柚皮素O-丙二酰己糖苷、3,4,5-三羥黃酮O-蕓香糖苷、6-C-己糖基-木犀草素O-己糖苷、異牧荊素含量在S1中遠高于S2和S2，被鑒定為S1階段的特征性棗黃酮類化合物，這些物質多為黃酮醇和黃酮碳糖苷，顏色多為紫色或者紅色，為棗皮的紫紅色起到較大的貢獻作用。S2的黃酮類化合物顯著低于S1和S3，這和果實呈現(xiàn)的顏色高度吻合，含量較高僅為C-己糖基木犀草素O-己糖苷、6-C-己糖苷-芹菜素O-己糖苷。S3中含量較高的物質有5 種，分別為矢車菊素O-己糖基、芹菜素O-己糖基-戊糖苷、槲皮素5-O-己糖苷-O-丙二酰己糖苷、金圣草黃素O-葡萄糖醛酸（水楊醇）醚O-二葡萄糖醛酸、金圣草黃素。本研究可更好地理解棗果發(fā)育過程中形成顏色的黃酮類化合物累積規(guī)律，為棗黃酮的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。