李榮源，盧紅梅，秦 興，陳 莉，汪 沙，吳 震

（貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

食醋作為常用的調(diào)味品和食品保藏劑，在中國具有悠久的發(fā)展歷史。早在2 500多年前就有食醋被用于調(diào)味和疾病治療的記載[1]。明朝時(shí)期，李時(shí)珍在《本草綱目》中就有記載：“醋能消腫、散火氣、殺邪毒、理諸藥之功效”[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明食醋具有降血壓、降血脂、抗疲勞、抗菌殺菌、調(diào)節(jié)血糖、抗氧化等功效[3-5]。

赤水曬醋是貴州省赤水市生產(chǎn)的一種具有典型地方特色的優(yōu)質(zhì)食醋產(chǎn)品，由多種中藥材制作成藥曲和大米、糯米、麩皮發(fā)酵生產(chǎn)而成。其生產(chǎn)過程主要分為4 個(gè)階段：采藥制曲階段、乙醇發(fā)酵階段、醋酸發(fā)酵階段和醋醅曝曬階段。赤水曬醋最顯著的特點(diǎn)便是“曬”，獨(dú)特的醋醅曝曬階段可以促進(jìn)醋液中風(fēng)味物質(zhì)積累，其次是以藥制曲的工藝，在制曲過程中加入108 種[6]中草藥粉成分，使曬醋不但具有很高的食用價(jià)值，還兼有一定的藥用作用。曬醋中檢測出的2,4,5,6-四甲基吡嗪（川芎嗪，揮發(fā)性成分相對含量的6.00%）的含量較高，使得曬醋具有一定的保健功效[7]。曬醋醋曲的制作是在自然條件下進(jìn)行的，包含了各種微生物的生長，由于中草藥本身具有抑菌、抗氧化等生物活性，既能保持赤水曬醋的獨(dú)特風(fēng)味，防止產(chǎn)生異味，又可以促進(jìn)霉菌等的生長，提高醋曲的品質(zhì)，從而形成赤水曬醋獨(dú)具特色的風(fēng)味特征。

現(xiàn)代生物技術(shù)的高速發(fā)展帶來了高通量測序[8-9]和變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）[10-12]等技術(shù)在食醋發(fā)酵中微生物群落測定的應(yīng)用，以至于有越來越多對發(fā)酵食品的微生物組成、發(fā)酵過程中的變化以及功能的研究。Solieri等[13]研究意大利傳統(tǒng)香醋的酵母菌群落，發(fā)現(xiàn)大部分菌株屬于Zygosaccharomyces屬，其中，Z. bailii的豐度占41%。Ilabaca等[14]研究智利傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過程中微生物變化，發(fā)現(xiàn)食醋在發(fā)酵末期僅存的醋酸菌為Acetobacterpasteurianus。Wu Jiajia等[15]研究食醋固態(tài)發(fā)酵過程中醋酸菌的多樣性，結(jié)果表明，醋酸菌主要是A. pasteurianus。本研究將通過高通量測序方法分析檢測各階段樣品及藥曲中細(xì)菌和真菌的種類和含量，結(jié)合微生物群落結(jié)構(gòu)變化研究赤水曬醋發(fā)酵過程中物質(zhì)含量變化的深層原因，對進(jìn)一步了解赤水曬醋工藝和認(rèn)識赤水曬醋具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥曲制備樣品：隨機(jī)選取3 個(gè)將用于生產(chǎn)的曲塊，取3 個(gè)樣品（YQ-1、YQ-2、YQ-3）進(jìn)行分析。

乙醇發(fā)酵樣品：選取上述3 個(gè)曲塊所屬的乙醇發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵缸，取3 個(gè)樣品（JJFJ-1、JJFJ-2、JJFJ-3）進(jìn)行分析。

醋酸發(fā)酵樣品：選取上述3 個(gè)發(fā)酵缸所屬的醋酸發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵槽，木槽四周和中間等量醋醅混勻，取3 個(gè)樣品（CSFJ-1、CSFJ-2、CSFJ-3）進(jìn)行分析。

曝曬醋醅樣品：選取同屬一個(gè)醋酸發(fā)酵槽的3 個(gè)曝曬3 a的曝曬壇，曬壇上部、中部、下部各不同位置等量醋醅混勻，取3 個(gè)樣品（SCP-1、SCP-2、SCP-3）進(jìn)行分析。

DNA抽提試劑盒 美國Omega BioTek公司；2%瓊脂糖凝膠 法國Biowest公司；FastPfuPolymerase 北京TransGen公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國Axygen公司；Fast DNA SPIN Kit for Soil 美國MP Biomedicals公司。

1.2 儀器與設(shè)備

N13462C移液器、5430 R小型離心機(jī)、5424R高速臺式冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；ABSON MiFly-6小型離心機(jī) 合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司； NanoDrop2000超微量分光光度計(jì) 美國Thermo Fisher Scientific公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；MiSeq測序儀、HiSeq測序儀 美國Illumina公司；ELx800酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；TBS380微型熒光計(jì) 美國Turner BioSystems公司；Covaris M220 Gene有限公司； QL-901旋渦混合器 海門其林貝爾儀器制造有限公司；TL-48R粉碎研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

參考文獻(xiàn)[16]方法。2 g醋醅樣品，20 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4，pH 7.0）懸浮，加0.5 g玻璃珠，渦旋儀最大渦旋速度充分渦旋5 min。4 ℃、200×g離心5 min，收集上清液，將沉淀用PBS洗滌2 次并收集上清液。將所有上清液4 ℃、10 000×g離心10 min棄去上清液，收集沉淀。收集的沉淀用1 mL PBS重懸，轉(zhuǎn)入1.5 mL的EP管 中，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA提取

使用DNA抽提試劑盒提取醋醅或醋液內(nèi)含物微生物DNA。所有樣品的DNA提取步驟均參照DNA抽提試劑盒說明書，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質(zhì)量。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及測序

按指定測序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物338F/806R、ITS1F/ITS2R（上海美吉生物公司），利用引物擴(kuò)增出特異性序列，具體引物見表1。

表1 PCR引物Table 1 Sequences of primers used for PCR

細(xì)菌PCR體系：20 μL rTaqDNA聚合酶，2 μL 10×Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，引物各0.8 μL，0.2 μLTaq酶，0.2 μL牛血清蛋白，10 ng模板DNA，20 μL ddH2O；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

真菌PCR體系：20 μLTransStart FastPfuDNA聚合酶，4 μL 5×FastPfuBuffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，牛血清蛋白0.2 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O 20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測效果。使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，純化后的樣品使用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建測序文庫后在MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

MiSeq測序得到雙端序列數(shù)據(jù)，根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對reads拼接（merge）成一條序列，對reads的質(zhì)量和merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向，得到優(yōu)化數(shù)據(jù)。使用FLASH、Trimmomatic以以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行數(shù)據(jù)優(yōu)化：1）過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads；2）根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對reads拼接（merge）成一條序列，最小overlap長度為10 bp；3）拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，篩選不符合序列；4）根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。得到最終優(yōu)化數(shù)據(jù)。

將最終優(yōu)化數(shù)據(jù)在97%相似度水平下進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析，根據(jù)聚類分析結(jié)果：1）進(jìn)行α多樣性分析，其中菌群豐度可由ACE指數(shù)進(jìn)行評估，其數(shù)值越高表明群落物種豐富度越高；菌群多樣性由Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)進(jìn)行評估，Shannon指數(shù)與群落多樣性呈正相關(guān)，Simpson指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。覆蓋率是測序深度指標(biāo)。2）分別繪制樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖、Venn圖、Heatmap熱圖、β分析圖、主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息，采用α多樣性指標(biāo)的ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)對樣品微生物物種豐富度和多樣性進(jìn)行評估，結(jié)果見表2。所有樣品的OTU覆蓋率為99.93%～99.99%，表明樣品中的微生物種類幾乎都被檢測到。稀釋曲線主要利用各樣本測序量在不同測序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，從而反映各樣本在不同測序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。當(dāng)稀釋曲線趨向于平緩時(shí)表明測序數(shù)據(jù)量較為合理?；?7%相似度的OTU水平制作的細(xì)菌和真菌的稀釋曲線如圖1所示，曲線平緩，說明測序深度較好，測序數(shù)據(jù)量合理。

表2 α多樣性分析Table 2 Microbial α-diversity indices of samples

圖1 基于97%相似度OTU高通量測序的稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves based on OTUs with 97% similarity obtained by Illumina MiSeq sequencing

2.2 微生物的組成分析

圖2 樣品中細(xì)菌在目水平上的物種相對豐度Fig. 2 Relative abundances of the major bacterial orders in samples

圖3 樣品中真菌在目水平上的物種相對豐度Fig. 3 Relative abundances of the major fungal orders in samples

由圖2、3 可得，在目水平上，各個(gè)階段的微生物結(jié)構(gòu)差異明顯，乙醇和醋酸發(fā)酵階段的微生物結(jié)構(gòu)有一定的延續(xù)性。藥曲階段，鏈霉菌亞目（Streptomycetales）、芽孢桿菌目（Bacillales）和乳酸桿菌目（Lactobacillales）是細(xì)菌優(yōu)勢菌目，占細(xì)菌總量的80%～98%，散囊菌目（Eurotiales）（96.7%～99.3%）是真菌優(yōu)勢菌目，且能看出各個(gè)樣品間的差異較大，說明每個(gè)曬壇內(nèi)部都具有獨(dú)特的微生物結(jié)構(gòu)。乙醇發(fā)酵階段，乳酸桿菌目（86.7%～97.3%）是細(xì)菌優(yōu)勢菌目，有少量紅螺菌目（Rhodospirillales）、梭菌目（Clostridiales）和芽孢桿菌目，散囊菌目（89.3%～95.3%）是真菌優(yōu)勢菌目，還有少量的絲孢酵母目（Trichosporonales）、酵母目（Saccharomycetales）（0.4%～8.7%）。醋酸發(fā)酵階段，乳酸桿菌目（60.4%～81.6%）和紅螺菌目（16.3%～32.4%）是細(xì)菌優(yōu)勢菌目，有少量芽孢桿菌目（1.5%～6.5%），散囊菌目（65.5%～84.5%）是真菌優(yōu)勢菌目，酵母目（5.6%～8.7%）的比例則在醋酸發(fā)酵階段上升。醋醅曝曬階段，紅螺菌目（6.8%～34.3%）、芽孢桿菌目（5.5%～67.6%）、棒桿菌目（Corynebacteriales）（4.6%～17.8%）、伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）（2.0%～12.9%）、假單胞菌目（Pseudomonadales）（0.5%～9.1%）和乳酸桿菌目（0.8%～12.1%）等細(xì)菌均有發(fā)現(xiàn)，散囊菌目（2.7%～3 4.4%）、煤炱目（Capnodiales）（4.0%～28.3%）、格孢腔菌目（Pleosporales）（1.0%～33.9%）和酵母目（1.0%～6.2%）等真菌也被發(fā)現(xiàn)。

表3 各樣品在屬水平的優(yōu)勢菌種Table 3 Dominant bacterial and fungal strains in samples at the genus level

表4 樣品在屬水平共有微生物種類數(shù)的統(tǒng)計(jì)Table 4 Number of bacterial and fungal species common to samples at the genus level

圖4 樣品中細(xì)菌在屬水平上的物種相對豐度Fig. 4 Relative abundances of the major bacterial genera in samples

圖5 樣品中真菌在屬水平上的物種相對豐度Fig. 5 Relative abundances of the major fungal genera in samples

由表3、4可知，18 種細(xì)菌和16 種真菌在每個(gè)階段都有發(fā)現(xiàn)，且在乙醇發(fā)酵、醋酸發(fā)酵和曝曬階段共有的真菌、細(xì)菌相對較多，在曝曬階段獨(dú)有的細(xì)菌種類數(shù)達(dá)到205 種，真菌種類數(shù)達(dá)到69 種，各個(gè)階段的共有真菌、細(xì)菌種類數(shù)也體現(xiàn)出了菌群的延續(xù)性。由圖4、5 可知，細(xì)菌的芽孢桿菌屬（Bacillus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）和真菌的曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）都有較大相對豐度，這些菌屬在藥曲的生長代謝中會產(chǎn)生各種發(fā)酵所需的酶和氨基酸，如芽孢桿菌屬能產(chǎn)蛋白酶、α-淀粉酶和L-酪氨酸等物質(zhì)[17-18]，高溫放線菌屬能分泌具有耐高溫性質(zhì)的α-淀粉酶、TVA I和TVAII[19-20]，曲霉屬可代謝產(chǎn)生大量高活性的蛋白酶及糖化酶[21-22]且部分菌種能轉(zhuǎn)化甾類、生物堿類和吩嗪類化合物等[23]，嗜熱真菌能夠生產(chǎn)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶，該酶能以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈，產(chǎn)生不同鏈長的寡糖和少量的木糖[24]。這些菌種在發(fā)酵過程對分解淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)有重要作用。

藥曲階段，部分樣品中鏈霉菌屬（Streptomyces）有較大的相對豐度，能分泌抗生素類物質(zhì)抑制其他菌種的生長，代謝生產(chǎn)抗腫瘤物質(zhì)[25]，還有糖單孢菌屬（Saccharomonospora）、糖多孢菌屬（Saccharopolypora）、絲孢酵母菌屬（Trichosporon）等能分泌多種物質(zhì)，如糖多孢菌屬能產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶、纖維素降解促進(jìn)因子等[26]，絲孢酵母菌屬能分泌β-葡萄糖苷酶，該酶屬于纖維素酶，能提高揮發(fā)性香氣成分的含量，可提升食醋的風(fēng)味[27]。

乙醇發(fā)酵階段，曲霉屬、嗜熱真菌屬和絲孢酵母菌屬是真菌優(yōu)勢屬，乳桿菌屬是乙醇發(fā)酵中唯一優(yōu)勢細(xì)菌菌屬，分析原因是由于發(fā)酵缸除表層外都處于無氧環(huán)境，較適宜乳桿菌屬的生長，此外，醋酸單胞菌屬（Acetobacter）和葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter）在乙醇發(fā)酵醪液中都被檢出。據(jù)報(bào)道，黃曲霉（Aspergillusflavus）等絲狀真菌可利用木糖生產(chǎn)乙醇[28]，Clostridium屬細(xì)菌能利用纖維素、半纖維素或五碳糖生產(chǎn)乙醇[29-30]，這些菌在樣品中的相對豐度達(dá)到1.0%～6.3%和0.3%～6.4%，且各個(gè)階段都有檢出。乙醇發(fā)酵階段是多邊發(fā)酵過程，醋酸菌和產(chǎn)膜酵母的代謝會消耗乙醇，且其他物質(zhì)也會在該階段積累，如有機(jī)酸、氨基酸等，造成了發(fā)酵醪液中乙醇含量低，酸度高。乙醇含量呈先增后降，酸度呈持續(xù)上升的趨勢。乳桿菌屬是乙醇發(fā)酵中唯一優(yōu)勢細(xì)菌菌屬，也使得曬醋制備中不揮發(fā)酸比例較高，保證赤水曬醋獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)。

醋酸發(fā)酵階段，醋酸單胞菌屬的相對豐度明顯增加，達(dá)到16.1%～31.6%，葡糖醋桿菌屬也有增加，說明醋酸代謝較旺盛，由于乙醇發(fā)酵階段乳桿菌屬的大量存在，所以乳酸菌在醋酸發(fā)酵階段仍占細(xì)菌的主體。醋醅曝曬過程中，微生物的種類大大增加，如紅球菌屬（Rhodococcus）、枝孢屬（Cladosporium）、梗孢酵母屬（Sterigmatomyces）、枝頂孢屬（Acremonium）等，這些微生物促進(jìn)了曝曬醋醅中各種物質(zhì)的積累，提升赤水曬醋的品質(zhì)，如紅球菌屬菌可以生產(chǎn)亮氨酸、苯丙氨酸和類胡蘿卜素[31-32]，枝孢屬可以產(chǎn)纖維素酶[33-34]，枝頂孢屬菌可以分泌酚類、萜類、環(huán)肽、蒽酮類等物質(zhì)[35]，梗孢酵母屬能夠產(chǎn)生各種細(xì)胞色素且是豆醬的主要功能微生物[36-37]。

Heatmap用顏色變化反映二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)信息，它可以直觀地以顏色深淺定義數(shù)值的大小，常通過顏色的梯度及相似程度反映數(shù)據(jù)的相似性和差異性。由圖6a可得，在細(xì)菌屬水平，乙醇和醋酸發(fā)酵的聚類分析結(jié)果最為接近，表示這6 個(gè)樣品所含細(xì)菌種類及其豐度相似，主要是由于2 個(gè)階段的發(fā)酵環(huán)境具有延續(xù)性且相似。與之較接近的是醋醅曝曬階段，分析是因?yàn)榧?xì)菌主要來源于醋酸發(fā)酵醋醅，在曝曬中因環(huán)境的改變而形成獨(dú)特的細(xì)菌結(jié)構(gòu)，但仍有一定的連續(xù)性。藥曲中形成了獨(dú)特的細(xì)菌結(jié)構(gòu)，這是不同的發(fā)酵環(huán)境所致。SCP-1與YQ-2被分為同一類，具體分析可以看出，SCP-1的細(xì)菌種類明顯高于YQ-2，其原因是二者的鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬和高溫放線菌屬的豐度較為接近。由圖6b可得，樣品真菌屬與細(xì)菌屬水平的聚類分類結(jié)果相似。乙醇和醋酸發(fā)酵被分在一個(gè)大類，藥曲則因其優(yōu)勢菌屬嗜熱真菌屬和曲霉屬的豐度等級與之相似，也被分為一個(gè)大類，同樣的也有SCP-2。嗜熱真菌屬豐度等級較高的JJFJ-1、JJFJ-2、 JJFJ-3和YQ-2、YQ-3分為一個(gè)小類，曲霉屬豐度等級較高的CSFJ-1、CSFJ-2、CSFJ-3和YQ-1被分為另一個(gè)小類。曝曬醋醅的真菌種類明顯比其他樣品豐富，因此，曝曬醋醅被獨(dú)立分為一類。

圖6 樣品物種相對豐度排名前30的屬及在每個(gè)樣品中的豐度聚類熱圖Fig. 6 Heat map analysis of top 30 most abundant genera in samples

2.3 β多樣性分析

圖7 樣品的層級聚類分析Fig. 7 Hierarchical clustering analysis of microbial community structure in samples using weighted UniFrac distance algorithm

β多樣性表示不同群落間物種組成變化，即“與環(huán)境梯度或環(huán)境格局相關(guān)的群落組成變化幅度或群落分化程度”[38]。本研究使用weighted UniFrac距離算法分析赤水曬醋發(fā)酵各階段的微生物多樣性。由圖7a可得，考慮到樣本間的細(xì)菌種類和豐度因素，乙醇和醋酸發(fā)酵階段各自為一個(gè)小類，然后聚為一個(gè)大類，表現(xiàn)出這2 個(gè)階段的延續(xù)性和與其他階段的不同。SCP-2、SCP-3和YQ-1、YQ-3同樣各自為一個(gè)小類，然后聚成一個(gè)大類。但SCP-1和YQ-2被分為了一類，這一分類結(jié)果同樣是由于二者的鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬和高溫放線菌屬的豐度較為接近。但由β多樣性可以看出，曝曬醋醅和藥曲細(xì)菌多樣性存在相似，與乙醇和醋酸發(fā)酵樣品有明顯差異，推測是由于兩者相似的固態(tài)、高溫和低含氧量的發(fā)酵環(huán)境。圖7b中將乙醇發(fā)酵和藥曲樣品分為一類，然后與醋酸發(fā)酵和SCP-2分為一個(gè)大類，SCP-1和SCP-3則分為一類，說明藥曲和乙醇發(fā)酵的真菌多樣性相似，而SCP-2與SCP-1、SCP-3的相似性較低。

PCoA是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，使用PCoA圖可展示各樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。從 圖8a可得，PCoA1的貢獻(xiàn)率為64.59%，可知乙醇和醋酸發(fā)酵的細(xì)菌微生物結(jié)構(gòu)相似，藥曲和曝曬醋醅的細(xì)菌微生物結(jié)構(gòu)相似，但樣品之間差異性較大，尤其是YQ-2和SCP-1與其他同一階段樣品距離較遠(yuǎn)。圖8b則顯示，藥曲、乙醇和醋酸發(fā)酵樣品的真菌微生物結(jié)構(gòu)相似，與曝曬醋醅樣品有明顯區(qū)別，并且曝曬醋醅樣品之間也有較大差異。這符合聚類分析結(jié)果，但PCoA可清晰反映曝曬醋醅樣品之間微生物結(jié)構(gòu)的較大差異，分析是因?yàn)榇柞盅b在曬場的曝曬壇內(nèi)，無論是裝壇以前的微生物結(jié)構(gòu)，還是曝曬環(huán)境都存在區(qū)別，導(dǎo)致曝曬醋醅樣品之間的微生物結(jié)構(gòu)有明顯差異。

圖8 樣品中細(xì)菌和真菌群落的PCoAFig. 8 PCoA of bacterial and fungal communities present in samples

3 結(jié) 論

本研究采用高通量測序檢測赤水曬醋各生產(chǎn)階段微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)合豐度聚類熱圖和β多樣性分析表明。對于細(xì)菌，乙醇發(fā)酵和醋酸發(fā)酵相似度最高。對于真菌，藥曲制備、乙醇發(fā)酵和醋酸發(fā)酵的微生物結(jié)構(gòu)相似度較高，醋醅曝曬階段的微生物結(jié)構(gòu)則有明顯差異。發(fā)現(xiàn)從藥曲、乙醇發(fā)酵、醋酸發(fā)酵至醋醅曝曬都有微生物的傳承，但每個(gè)階段存在環(huán)境和條件的差異，使微生物結(jié)構(gòu)不斷變化，尤其是在醋醅曝曬階段各個(gè)樣品之間的差異更為明顯。通過微生物結(jié)構(gòu)分析，在乙醇發(fā)酵和醋酸發(fā)酵階段都是乳桿菌屬、醋桿菌屬和曲霉屬、嗜熱真菌屬、絲孢酵母屬占絕對優(yōu)勢菌屬，起到了主導(dǎo)作用，這兩個(gè)階段是赤水曬醋中主要物質(zhì)積累的過程，生產(chǎn)大量的有機(jī)酸、氨基酸等物質(zhì)。在醋酸發(fā)酵和醋醅曝曬階段，酵母菌的活性并沒有受到抑制，共檢出了梗孢酵母屬、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）、紅酵母屬（Rhodotorula）和絲孢酵母菌屬等非釀酒酵母，并且在部分樣品中有較高的相對豐度，它們能夠產(chǎn)生包括萜類化合物、酯類、高級醇、丙三醇、乙醛、乙酸和琥珀酸的風(fēng)味化合物，增加了赤水曬醋中風(fēng)味成分的種類和含量。而醋醅曝曬階段微生物結(jié)構(gòu)則不同于其他階段，無論是細(xì)菌還是真菌都沒有絕對優(yōu)勢菌種存在，同時(shí)也是微生物種類最多的階段，有194 種真菌和400 種細(xì)菌被檢測到。因此，在這一重要階段會代謝生產(chǎn)大量營養(yǎng)物質(zhì)，從而形成赤水曬醋獨(dú)具特色的風(fēng)味品質(zhì)。