楊劍輝 孟祥鈺 唐明宇 周 潔 孫岳明 代云茜

(東南大學化學化工學院，南京 211189)

0 引 言

石墨烯因具有高比表面積(2 630 m2·g-1)和特殊的二維層狀結構，能夠表現(xiàn)出優(yōu)異的物理、化學和力學性能，是一種很有前景的催化材料[1-2]。對石墨烯進行雜元素的摻雜改性和納米孔洞刻蝕可以增大其缺陷度與活性位點，提升其催化活性，進一步拓寬石墨烯的應用范圍。目前常見摻雜方式主要包括氮摻雜、磷摻雜和硼摻雜等[3]。其中磷的摻雜率很低且摻雜后的石墨烯比表面積較低[4]，而硼摻雜后的石墨烯電負性遠小于氮摻雜石墨烯的電負性[5]。氮摻雜后的石墨烯中氮原子能夠將更多的正電荷轉移到與其相鄰的碳原子上，這不僅有效地提高其催化活性，還能保持其更優(yōu)異的穩(wěn)定性[6-8]。例如，氮摻雜碳納米管可以高效催化還原4-硝基苯酚[9]；氮摻雜石墨烯可作為良好燃料電池電極對氧還原反應(ORR)進行催化[10-11]。然而，目前大多數(shù)研究中，氮摻雜石墨烯的N/C原子比都在10%以下，而且需要退火、等離子體處理等復雜的合成步驟，反應能耗高且對摻雜濃度與構型的可控性低[5]。另外，針對石墨烯片層的納米孔洞刻蝕仍需要在強氧化性的化學環(huán)境條件下進行，或者需要借助高能耗的激光轟擊，不僅不可避免地對環(huán)境造成污染，而且消耗大量燃料電力。合成涉及強酸或強堿的液相環(huán)境，還會由于嚴重影響石墨烯表面電荷分布而造成石墨烯的急劇團聚，使其比表面積下降[12-13]。因此，采用溫和、低能耗的合成方法來制備保留本征二維優(yōu)勢、具有可控的氮摻雜量、富含高密度納米孔的石墨烯材料具有深遠的意義。

辣根過氧化物酶(HPR)是臨床檢驗試劑中的一種常用生物酶，可高效分析血糖、尿液等健康指標，近年來在先進健康監(jiān)測與可穿戴醫(yī)療等方面得到廣泛應用[14]。然而，天然酶面臨穩(wěn)定性差、合成成本高以及分離和純化困難等眾多瓶頸。人工合成的具有酶性質的類酶催化劑因為其相較于生物酶不易失活，同時無需復雜的提純過程，便于儲藏，是代替天然酶的一種極具潛力的材料。近年來，研究人員已經(jīng)開發(fā)了包括貴金屬[15-16]、金屬氧化物[17-18]、金屬配合物[19-20]和非金屬碳材料[21]等在內的多種類酶催化劑，它們在生物傳感、疾病診斷和健康監(jiān)測中顯示出良好的應用潛力[22]。然而，由于金屬類酶催化劑高昂的價格和對環(huán)境、人體的重金屬污染，限制了其進一步的發(fā)展。碳基類酶催化劑不僅來源廣泛、性質穩(wěn)定、成本低廉，并且具有生物相容性高以及對環(huán)境無污染等特征，從而成為代替金屬類酶催化劑的首選材料。其中，石墨烯基材料因為含有豐富的含氧基團和高比表面積，已經(jīng)被證明具有良好的類過氧化物酶的性質，可以在H2O2參與下發(fā)生催化氧化，用于測定葡萄糖和農藥殘余量等[23-24]。然而，石墨烯基類過氧化物酶雖具有穩(wěn)定性高、成本低等優(yōu)勢，但相較于金屬基類酶材料活性較低，可以通過可控化學氮摻雜和精細納米孔洞刻蝕改變石墨烯片層表面電子分布、吸附能以及傳質速度，從而顯著提高其類酶活性。

我們通過溫和的水熱反應，一步完成對石墨烯片層的高濃度可控氮摻雜(原子分數(shù)13%)。同時，通過在此過程中的選擇性刻蝕、引入的納米孔洞密度高達86.5%(由Image J計算得到)，獲得具有高效催化氧化活性、寬pH值使用范圍的新型類酶催化劑。此外，我們進行系統(tǒng)的平行實驗研究其在類酶催化過程中的反應路徑，證明其在反應中遵循高效的氧氣參與的4電子轉移過程。本研究為設計具有選擇性反應路徑的高效非金屬類酶催化劑提供具有吸引力的策略，同時為其未來在醫(yī)療、健康檢測等方面的應用做出探索。

1 實驗部分

1.1 氧化石墨烯的制備

首先稱取1 g石墨并向其中加入10 g氯化鈉固體，置于瑪瑙研缽中研磨10 min后，用去離子水洗滌干燥；取25.4 mL 98%(質量分數(shù))濃硫酸，并將烘干后的石墨加入，攪拌10 h；然后均分成4份，向每一份中緩慢地加入3 g高錳酸鉀，待初步氧化后，使用油浴對其加熱，使其充分氧化；油浴結束后，逐次取28 mL蒸餾水和4 mL H2O2，分別加入4份反應后的濁液中，除去未反應完的高錳酸鉀；隨后用1.2 mol·L-1的鹽酸洗1次，水洗2次，除去未反應完全的硫酸；最后，轉移水洗后的膠體于透析袋，用18.2 MΩ的超純水透析3 d，將合成過程中混入的離子去除，得到高純度的氧化石墨烯(GO)膠體。

1.2 氮摻雜石墨烯的制備

通過調控GO的濃度來合成不同氮摻雜度的氮摻雜還原氧化石墨烯(N-RGO)。分別取4、20、60、100、140 mg GO分散在5 mL氨水中，通過加入去離子水使總體積最終均為20 mL，以獲得0.2、1、3、5、7 mg·mL-1的前驅液。然后將溶液轉移到高壓釜中，180℃下反應8 h，待其冷卻至室溫后，將高壓釜內的懸浮液離心、水洗直至溶液呈中性，移取出下層固體即為N-RGO。

1.3 表征與測試

1.3.1透射電子顯微鏡

分別取少量制備好的N-RGO樣品，用超純水稀釋并分散均勻后，滴到普通碳膜支持的銅網(wǎng)上，并于室溫下晾干，用TecnaiG2透射電子顯微鏡(TEM，荷蘭FEI)在200 kV下對其微觀結構進行觀察。

1.3.2拉曼光譜

將少許樣品滴于潔凈的硅片上，置于空氣中晾干，采用拉曼光譜儀(Raman，Thermo Fisher Scientific DXR Raman Microscope)測試樣品的拉曼光譜，激發(fā)波長λ=532 nm。

1.3.3X射線光電子能譜

將樣品分次滴在硅片表面，自然晾干，采用X射線光電子能譜儀(XPS，Esea Lab 250，Thermo-VG Scientific)測試樣品的電子能譜信息。

1.3.4類酶催化性能測試

分別配置10 mmol·L-13，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鄰苯二胺(OPD)、2，2′-疊氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)(ABTS)溶液。取80 μL上述所配溶液至3個離心管中，分別繼續(xù)滴加0.86 mL pH值為3.5的HAc-NaAc緩沖液，充分混合后，再取60 μL N-RGO水溶液(GO濃度為5 mg·mL-1，機理和影響因素的研究等未特別注明的實驗過程也均采用此樣品)滴加至該混合液(總體積為1 mL)。計時反應3 min后，離心1 min，控制總反應時間為4 min，取上層清液至石英比色皿中，采用Cary 60型號紫外可見光譜儀(Agilent Technologies)測定350～800 nm波長范圍內樣品的吸光度。

2 結果與討論

2.1 多孔氮摻雜石墨烯的制備與表征

圖1 (a)N-RGO(5 mg·mL-1)的TEM圖;(b)N-RGO樣品的ID/IG值;(c)N-RGO樣品的O/C和N/C原子比;(d)N-RGO樣品的APyridinic N/AN1s、APyrrolic N/AN1s和AGraphitic N/AN1sFig.1 (a)TEM image of N-RGO(5 mg·mL-1);(b)ID/IGof N-RGO samples;(c)Atomic ratio of O/C and N/C in N-RGO samples;(d)APyridinic N/AN1s,APyrrolic N/AN1sand AGraphitic N/AN1sin N-RGO samples

如圖1a所示，采用溫和的方法進行了氮摻雜后，N-RGO出現(xiàn)了大量褶皺和分布均勻的3～5 nm的刻蝕孔洞，孔密度高達86.5%。引入了與碳原子尺寸不同的氮雜原子后，原本相對平整的sp2雜化碳六元環(huán)因不對稱的應力而發(fā)生變形，因此石墨片層出現(xiàn)了明顯的皺褶。此外，水熱過程中水汽對GO片層產(chǎn)生強烈的刻蝕，蝕刻機理類似于煤炭氣化，碳原子與水蒸氣反應生成CO和H2，留下碳空缺，最終變成大孔隙或者被水熱蒸汽逐漸破壞[25]。盡管制備過程中使用的GO濃度不同，但所得N-RGO形貌結構基本保持不變[26-27]。這一結論與其他學者的研究一致，即使采用粒徑、尺寸、形貌不同的石墨合成的GO前驅體來制備N-RGO，N-RGO仍具有相似的形態(tài)和結構特征[28]。相比于激光或等離子刻蝕以及強氧化劑的氧化刻蝕[29-30]，我們報道的通過溫和氮摻雜在石墨烯片層上刻蝕豐富孔洞的策略具有較強的便捷性。

圖1b為由拉曼光譜得到的N-RGO樣品D帶和G帶的強度比(ID/IG)。拉曼光譜是用來探測碳材料結構特征和電子狀態(tài)的重要手段，其中D峰(～1 350 cm-1)代表石墨烯的階梯邊緣和缺陷特性；G峰(～1 580 cm-1)代表一階的散射E2g振動模式，對應于sp2雜化碳原子的面內振動強度。隨著GO濃度的上升，ID/IG從0.96增加到1.23，缺陷明顯增多，這是由于氮元素摻雜引起的褶皺和石墨烯被刻蝕產(chǎn)生的孔洞共同作用的結果，它們可為催化反應提供豐富的活性位點。

采用XPS分析可以定性和定量研究N-RGO的化學組成。圖1c和d是根據(jù)XPS分析所得柱狀圖。相比GO，可以發(fā)現(xiàn)N-RGO中的O/C原子比有明顯的下降，說明了GO被成功還原。水熱反應過程中，分子內或者分子間會脫去水，從而使羧基、環(huán)氧基、羥基等一些官能團移除[5]。N-RGO的XPS出現(xiàn)了氮原子的吸收峰，且氮摻雜的濃度高(原子分數(shù)在10%以上)。高濃度氮摻雜可有助于調節(jié)電子分布、注入負電子、增強催化活性[31]。摻雜后的氮有3種存在形式：石墨氮、吡啶氮和吡咯氮。有研究表明，石墨氮可以誘導電子從相鄰的碳原子轉移到氮原子，從而破壞sp2雜化的石墨烯六元環(huán)的化學惰性并改變石墨烯的催化活性[32]。石墨氮的原子分數(shù)在11%～24.8%之間時，隨著GO濃度的升高，含量先增大后減小，且在GO濃度為5 mg·mL-1時達到最大值，可以預測此濃度下制備的N-RGO具有優(yōu)異的催化性能。在GO濃度從0.2 mg·mL-1變化到7 mg·mL-1的過程中，N/C原子比始終控制在13%左右，這說明原始的氧化石墨烯的摻雜位點已經(jīng)被過量氮源摻雜到飽和狀態(tài)。同時，O/C原子比例從最初的56%快速下降到13%左右。這些結果表明在一步水熱反應中氮原子摻雜和含氧官能團的去除是同時進行的。

2.2 多孔氮摻雜石墨烯的催化氧化

2.2.1催化氧化性能

以GO濃度為5 mg·mL-1的N-RGO為例，研究其催化性能、機理及影響因素。由圖2a發(fā)現(xiàn)，N-RGO可以催化TMB產(chǎn)生藍色反應生成ox-TMB，催化OPD產(chǎn)生橘色反應生成ox-OPD，催化ABTS產(chǎn)生綠色反應生成ox-ABTS。從三者反應過程中的紫外吸收譜圖可以觀察到，催化氧化TMB的紫外吸收譜圖在652 nm處有一個強吸收峰，與文獻報道結果吻合[22]；OPD在445 nm處有個較弱的吸收峰；ABTS在426 nm處有個肩峰，在737 nm處有個低寬峰。催化氧化TMB的特征吸收峰相對其它2個催化底物易于識別，故以TMB為探針研究N-RGO催化氧化過程的機理，并進行定性和定量的分析。

如圖2b所示，當N-RGO、TMB分別存在或僅有N-RGO和TMB同時存在時，沒有顯示反應。只有當TMB、N-RGO和緩沖溶液同時存在時才會發(fā)生反應并產(chǎn)生紫外吸收。緩沖溶液提供的H+會參與到催化氧化反應中，這在后面對催化氧化機理推斷中也有了進一步的驗證。

2.2.2機理研究

圖2 (a)催化不同種底物的UV-Vis譜圖:(b)N-RGO、TMB、N-RGO+TMB與TMB+N-RGO+HAc-NaAc緩沖液的UV-Vis譜圖Fig.2 (a)UV-Vis spectra of different substrates;(b)UV-Vis spectra of N-RGO,TMB,and TMB+N-RGO+HAc-NaAc buffer solution

N-RGO發(fā)生該催化氧化反應的過程中，很可能生成H2O2(O2(g)+2H+(aq)+2e- H2O2(aq))，并作為反應物參與反應。例如，GO可以在H2O2存在的條件下催化TMB產(chǎn)生藍色反應物ox-TMB[23]，而氧氣也可作為氧化劑直接氧化TMB，由于H2O2和氧氣都可作為氧化劑參與反應，TMB的氧化機理可能是以下2種(圖3)：

圖3 機理推斷:(a)氧氣參與的4電子轉移反應和(b)H2O2參與的2電子轉移反應Fig.3 Proposed mechanisms:(a)4-electron transfer reaction involving oxygen and(b)2-electron transfer reaction involving H2O2

圖4 (a)N-RGO催化氧化TMB反應中有無加入過氧化氫酶的UV-Vis譜圖;(b)N-RGO催化氧化TMB反應中在通入30 min N2與不通N2時的UV-Vis譜圖Fig.4 (a)UV-Vis spectra of TMB catalyzed and oxidized by N-RGO system with or without catalase;(b)UV-Vis spectra of TMB catalyzed and oxidized by N-RGO system with or without degassing of N2 for 30 min

為了研究氧化的機理，首先進行了加入過氧化氫酶的對照試驗，從圖4a可以看出，在加入過氧化氫酶后，紫外吸收曲線與未加酶的N-RGO趨于一致，N-RGO催化氧化過程不會受到過氧化氫酶的影響。這也說明反應過程并沒有H2O2參與，N-RGO催化過程并不會促進H2O2生成，反應過程為氧氣被還原發(fā)生4電子轉移：O2+4H++4e+ 2H2O。因而氧氣是催化氧化TMB過程中的必要反應物，其可能來源于水中的溶解氧或N-RGO表面的吸附氧。為了進一步研究氧的來源，通30 min氮氣以排除緩沖液(pH值為3.5)中的氧氣，再加入N-RGO進行前面的步驟，可排除水中的溶解氧的干擾。如圖4b所示，2個反應溶液的紫外吸收曲線基本一致，說明水中的溶解氧對催化反應沒有影響。因此，發(fā)生催化氧化的氧分子來源于N-RGO的吸附氧。N-RGO具有高的催化活性，是氮摻雜和刻蝕孔洞產(chǎn)生的缺陷共同作用的結果。與氮原子相鄰的碳原子傾向于產(chǎn)生高正電荷和自旋，有利于氧分子的吸附[33-34]。同時，蝕刻的孔洞將平面結構破壞為非平面結構，并導致多孔網(wǎng)狀物皺褶明顯，在邊緣的孔洞誘導了結構缺陷，具有低配位數(shù)碳的缺陷孔洞可能充當了吸附和反應的位點，促進了催化反應中的傳質過程[35]。

以上的實驗結果基本明確了N-RGO催化氧化TMB的機理(圖5)：該反應發(fā)生在具有豐富納米孔洞的N-RGO褶皺片層上，多孔結構和有效的氮摻雜為催化氧化反應提供了豐富的活性位點，使TMB在NRGO的作用下發(fā)生氧氣參與的4電子轉移反應。

圖5 N-RGO催化TMB氧化的機理模型圖Fig.5 Mechanism model of TMB oxidation catalyzed by N-RGO

2.2.3催化氧化的影響因素

常見生物酶的活性一般都會受到溫度、pH值、離子強度和光照條件的影響，為了進一步研究NRGO的類酶性質，我們進行了系列實驗。以5 mg·mL-1GO合成的N-RGO為催化劑，TMB為底物，分別改變其中1個因素，測定其催化活性，并作出相對活性曲線。其中溫度的變化范圍為25～85℃；pH值依靠HAc-NaAc緩沖溶液來調控，變化范圍為2.5～7；離子強度依靠加入NaCl來調控，NaCl濃度變化范圍為0～100 mmol·L-1；分別在黑暗、可見光和紫外照射下實驗。

由圖6可知，N-RGO與HPR相似，對溫度、pH值和NaCl濃度均有依賴。在實驗范圍內，催化活性隨著pH值的增大先增大后降低，可知最佳的pH值大約為3.5，N-RGO在酸性、弱酸性條件下均有催化活性。最佳溫度為55℃，同樣在溫度變化比較劇烈的時候，雖然催化活性會降低，但是并沒有失活。在NaCl濃度為40 mmol·L-1時氧化性能最好，如果增加NaCl濃度，會抑制N-RGO的類酶活性，但是在試驗所測范圍內其相對活性還是在80%以上。N-RGO在3～4.5的pH值范圍內，溫度為25～85℃時都有較高的活性，相比HPR(pH值：4.5～5.5，溫度：10～40℃)有更寬的活性范圍[36]。

為了研究N-RGO類氧化物酶對光的敏感性，改變光照條件，分別在黑暗中、可見光和紫外光照射條件下，其催化活性沒有顯著變化(圖6d)，可以確定光照對其活性影響微乎其微，說明N-RGO催化氧化不依賴外加的光照條件。紫外線照射下會引起HPR的嚴重變性，并伴有化學鍵破壞或殘基之間的交聯(lián)，降低催化活性[37]。可見，和天然酶相比較，NRGO由于不會隨光照發(fā)生活性改變，有明顯的優(yōu)勢，無需特殊光源的刺激進行反應及檢測。

由于溫度和pH值對物質溶解度有較大影響，為研究測試條件是否會影響生成物的吸光度，控制反應在25℃、pH值為3.5的條件下發(fā)生，僅改變測量時的pH值和溫度，可發(fā)現(xiàn)溫度對測量結果無影響，而將pH值從3.5增加至6時吸光度會降低15%(圖7)。當pH值為6時，可能是生成的二胺類物質溶解性變差，導致吸光度降低[38-39]。這也說明了圖6b中相對活性減弱的現(xiàn)象可能是由于pH值過大導致生成物溶解度降低而引起的，在高pH值下的NRGO依舊具有較高的活性。

基于以上的結果可知，雖然N-RGO可能在非最佳條件下催化活性降低，但是它不會像生物酶一樣完全失活。在35℃時，N-RGO的類酶活性在90%以上，與生物酶非常相似，可適用于生物體中的檢測。

圖6 (a)溫度、(b)pH值、(c)NaCl濃度和(d)光照對N-RGO活性的影響Fig.6 Effect of(a)temperature,(b)pH value,(c)concentration of NaCl and(d)light on catalytic activity of N-RGO

圖7 測量時pH值和溫度改變對吸光度的影響Fig.7 Effect of pH value and temperature change on absorbance during measurement

2.2.4穩(wěn)態(tài)動力學

為了研究N-RGO催化氧化的穩(wěn)態(tài)動力學，控制實驗條件為N-RGO催化氧化的最佳條件(溫度為55℃、pH值為3.5、NaCl濃度為40 mmol·L-1)，將制得的5種不同的N-RGO樣品，分別在400、600、800、1 000和1 200 μmol·L-1的TMB濃度下測量UV-Vis譜圖。

通過朗伯-比爾定律(A=εbc，其中A為吸光度；ε為摩爾吸光度，L·mol-1·cm-1；b為吸收層厚度，cm；c為吸光物質的濃度，mol·L-1)將吸光度與生成物的濃度建立聯(lián)系，生成物的濃度除以反應時間即可得到對應的反應速率。已知：ox-TMB的ε=39 000 L·mol-1·cm-1[22]，b=1 cm，t=240 s。由此可知，反應速率v=c/t=A/(εbt)。以圖8a中400 μmol·L-1底物(652 nm處的吸光度為0.079 3)為例，其對應的反應速率v=8.47×10-3μmol·L-1。由圖8可知，與生物酶催化過程相似，初始TMB的濃度越高，對應的N-RGO催化活性越高。隨著底物濃度的升高，反應速率的升高速率逐漸減慢。當?shù)孜餄舛茸銐虼髸r，有最大的反應速率，這是由N-RGO的缺陷度和石墨氮的含量所決定的。因此可將N-RGO催化氧化TMB的反應看作酶促反應，將這些數(shù)據(jù)擬合到Michaelis-Menten模型中其中cs代表TMB的濃度，mol·L-1；v代表反應速率，mol·L-1·s-1；vmax代表酶被底物飽和時的最大反應速度，mol·L-1·s-1；Km代表米氏常數(shù)，mol·L-1)，作雙倒數(shù)圖，縱坐標的截距為1/vmax，橫坐標的截距為-1/Km，即可得出Km和vmax值。隨著GO濃度增大，vmax首先增加，而Km值逐漸減小，這可能是因為起始GO濃度高，獲得的N-RGO有相對較少的含氮量。當含氮量增加時，對催化性能有兩方面的影響：一方面N-RGO的缺陷度增大，催化活性位點增加，對氧氣的吸附增強，會增大催化氧化速率；另一方面N-RGO的電子傳輸能力會下降，導致催化氧化速率減慢。當GO濃度為5 mg·mL-1時，N-RGO催化的vmax最大，這可能是因為石墨氮含量比其他樣品高。石墨氮有利于大分子的吸附[25]，而且N-RGO中sp2雜化的碳原子可通過摻雜的石墨氮進一步活化[32]。

以TMB為底物的N-RGO的Km值比HPR、CeO2納米顆粒和Pt納米團簇低約2～3倍[22,40-41]，Km代表酶對底物的親和力，故N-RGO對TMB表現(xiàn)出更強的親和力。相比于文獻中GO和Fe3O4磁性納米顆粒來說，雖然得到的Km值相對較大，但vmax值約是其2倍大[23,42]。從以上結果中可知N-RGO有較高的催化活性，說明N-RGO具有一定的潛能，可發(fā)展為簡易、廉價、具有高靈敏度和選擇性的生物檢測劑。

表1 不同催化劑對底物TMB的Km和vmaxTable 1 Kmand vmaxof different catalysts to substrate TMB

圖8 不同N-RGO樣品分別在不同的TMB濃度下發(fā)生氧化反應的UV-Vis譜圖(a、c、e、g、i)和相應的米氏方程(b、d、f、h、j)Fig.8 UV-Vis spectra(a,c,e,g,i)of oxidation reaction of different N-RGO samples at different TMB concentrations and corresponding Michaelis-Menten equations(b,d,f,h,j)

3 結 論

通過一步溫和水熱法制備了具有豐富納米孔的氮摻雜石墨烯，其N/C的原子比高達10%以上且含量穩(wěn)定。N-RGO具有顯著的類過氧化物酶性質，對OPD、ABTS和TMB等有機物均有顯著的催化顯色活性，這得益于其獨特的缺陷孔洞和氮原子摻雜形成豐富的活性位點。N-RGO在溫度為35～55℃范圍內表現(xiàn)良好，即在人的正常體溫范圍內有較高的催化活性，這使其在人體檢測方面有很大的應用前景。這其中5 mg·mL-1的N-RGO樣品催化活性較高，反應速率與HPR接近，是已報道的人工類酶催化劑Fe3O4納米顆粒的2倍多，而且其對底物的親和力已超過了HPR。相比傳統(tǒng)的貴金屬類酶催化劑，它在環(huán)保與經(jīng)濟效應方面表現(xiàn)得極為出色?；贜-RGO優(yōu)異的催化氧化性能和較寬的作用區(qū)間，它有望被廣泛應用于可穿戴醫(yī)療設備進行血糖檢測，以及便攜式環(huán)境監(jiān)測儀進行污水的檢測。