裘劼人， 柴偉國， 童建新， 周歷萍， 王淑珍

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

蛋白質(zhì)組學(xué)作為連接轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的橋梁，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。近年來，質(zhì)譜因其高通量和高分辨率的特性成為復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品分析的首選方法，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為解讀基因組編碼信息的一項(xiàng)必不可少的技術(shù)[1]。由于蛋白種類的千變?nèi)f化，不同組織蛋白質(zhì)組成各有特點(diǎn)，在進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)需要根據(jù)組織樣本的特點(diǎn)選擇合適的提取方法。如提取人樹突狀細(xì)胞蛋白時(shí)，純丙酮沉淀法比三氯乙酸/丙酮沉淀法更有效，約提升了28%的蛋白鑒定量[2]。而植物細(xì)胞一般富含色素、多酚等次生代謝物，在蛋白酶解時(shí)起干擾作用，因此提取植物蛋白時(shí)需進(jìn)行更繁復(fù)的純化程序。目前常用的適用于質(zhì)譜分析的植物蛋白提取方法主要為三氯乙酸/丙酮法和酚提法[3]。

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)因其香甜的口感和豐富的營養(yǎng)元素而深受消費(fèi)者青睞，是重要的經(jīng)濟(jì)作物。雜交授粉是草莓育種的常用手段，而雌蕊可授性強(qiáng)弱是雜交成功的重要影響因素。發(fā)育成熟的草莓雌蕊柱頭表面覆有一層親水蛋白膜，經(jīng)研究報(bào)道可能與花粉識(shí)別和萌發(fā)相關(guān)，因此可采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究雌蕊可授性[4]。非數(shù)據(jù)依賴性采集(data-independent acquisition， DIA)質(zhì)譜技術(shù)，是一種高效穩(wěn)定的非標(biāo)記蛋白質(zhì)組研究方法[5]。本研究擬對(duì)傳統(tǒng)蛋白提取方法進(jìn)行優(yōu)化并利用DIA技術(shù)評(píng)價(jià)篩選出一種適用于質(zhì)譜分析的草莓雌蕊蛋白提取方法，為草莓雌蕊蛋白質(zhì)組學(xué)研究與育種應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用草莓品種為紅頰(Benihoppe)，于2020年3月上旬在杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)所草莓試驗(yàn)基地采取。取開花第一天的草莓花，150朵混成1個(gè)重復(fù)，每種方法設(shè)3個(gè)重復(fù)。去花柄、萼片、雄蕊，取雌蕊組織稱取鮮重(約0.5 g)后立即置于液氮冷凍保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白提取

雌蕊組織液氮下研磨成粉，分別采用三種方法進(jìn)行蛋白提?。喝纫宜?丙酮沉淀法(方法Ⅰ)、酚提法(方法Ⅱ)和酚氯仿法(方法Ⅲ)。三氯乙酸/丙酮沉淀法和酚提法依照文獻(xiàn)[6]步驟進(jìn)行。酚氯仿法步驟如下：

取0.2 g研磨好的粉末轉(zhuǎn)移至2 mL離心管，加入800 μL 4 ℃預(yù)冷的提取液(含0.7 mol·L-1蔗糖、0.1 mol·L-1氯化鉀、0.5 mol·L-1Tris、2%巰基乙醇和50 mmol·L-1EDTA的水溶液， 鹽酸調(diào)至pH 8.0)，旋渦30 s混勻；再加入800 μL 4 ℃預(yù)冷的Tris飽和酚(pH 8.0)抽提，得到細(xì)胞沉淀和溶液層。溶液層又分為3層，從上至下依次為酚層、中間層和水層。吸取最上層酚層約600 μL至新的2 mL離心管，加入600 μL提取液進(jìn)行抽提，再取最上層酚層約400 μL至10 mL離心管。吸取中間層和水層至另一新的2 mL離心管，加入800 μL氯仿進(jìn)行抽提。此時(shí)溶液最上層為水層，中間層含部分蛋白，最下層為氯仿。吸取最上層水層丟棄，將中間層和最下層氯仿層轉(zhuǎn)移到上述的10 mL離心管與酚層合并，此時(shí)離心管內(nèi)溶液總體積約為1.2 mL。在10 mL離心管中加入6 mL-20 ℃預(yù)冷的0.1 mol·L-1醋酸銨甲醇，-20 ℃沉淀過夜，5 000×g離心30 min棄上清。沉淀經(jīng)-20 ℃預(yù)冷的甲醇清洗3次，于-70～-20 ℃凍干至恒重成蛋白粉。

蛋白粉加入400 μL裂解液(8 mol·L-1尿素，0.1 mol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1PMSF(苯甲基磺酰氟)，pH 8.0)，渦旋30 s，置于0 ℃冰水浴中，以1 000 kJ能量、超聲3 s間歇5 s的模式超聲2 min至蛋白粉完全溶解。溶解液在4 ℃ 14 000×g離心20 min取上清即為蛋白溶液。

1.2.2 蛋白酶解

蛋白溶液采用Bradford試劑盒(碧云天，上海)定量，取200 μg蛋白還原烷基化后轉(zhuǎn)移至Amicon-Ultra-15超濾管(Merck Millipore，美國)，按說明書除雜，加入含4 μg胰酶(Promega，美國)的100 mmol·L-1NH4HCO3(pH 8.0)緩沖液，37 ℃反應(yīng)12～16 h。酶解完成后于4 ℃、 12 000×g離心15 min，用200 mmol·L-1NH4HCO3(pH 8.0)清洗2次，即得肽段溶液。肽段溶液中加入5%三氟乙酸(Thermo Fisher Scientific，美國)至終濃度為0.1%～1.0%，以PierceTMC18 Tips(Thermo Fisher Scientific，美國)除鹽后凍干，復(fù)溶于200 μL 0.1%甲酸水。

1.2.3 DIA質(zhì)譜分析

酶解后所有樣本取10 μL肽段混合，混合樣本中加入1 μL 10×iRT標(biāo)準(zhǔn)肽段溶液(Biognosys，瑞士)，按本課題組前期優(yōu)化的二維液質(zhì)聯(lián)用方法建立肽段譜圖數(shù)據(jù)庫[7]。每個(gè)樣本再各取10 μL分別進(jìn)行反向色譜串聯(lián)DIA質(zhì)譜分析。

反向色譜分離梯度：0～3 min，4%～7% Buffer B；3～103 min，7%～18% Buffer B；103～113 min，18%～35% Buffer B；113～117 min，35%～75% Buffer B；117～120 min，75% Buffer B(Buffer A，0.1%甲酸水溶液；Buffer B，0.1%甲酸乙腈溶液)。質(zhì)譜設(shè)置參數(shù)：掃描時(shí)間120 min，離子模式正離子，一級(jí)質(zhì)譜分辨率70 000 atm/z200，最大注入時(shí)間50 ms，掃描范圍 350～1 300m/z；二級(jí)掃描分辨率17 500 atm/z200；碰撞能量27%，分設(shè)30個(gè)隔離窗口，為350～381、381～398、398～415、415～432、432～444、444～456、456～468、468～480、480～492、492～504、504～516、516～528、528～540、540～552、552～564、564～576、576～592、592～608、608～624、624～640、640～656、656～672、672～688、688～712、712～736、736～766、766～806、806～856、856～926、926～1 300m/z。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

蛋白提取得率通過Microsoft Excel 2016統(tǒng)計(jì)，并利用GraphPad Prism(v. 8.0.1)進(jìn)行兩兩比較單因素方差分析。質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)通過Spectronaut PulsarⅩ(Biognosys， 瑞士)進(jìn)行蛋白鑒定，通過保留時(shí)間和質(zhì)量窗口的校正決定理想的提取窗口，與譜圖庫進(jìn)行匹配，蛋白質(zhì)定性標(biāo)準(zhǔn)：母離子閾值1.0% FDR，蛋白閾值1.0% FDR。采用jvenn包進(jìn)行韋恩圖分析蛋白交集情況[8]，并利用Deeploc (v. 1.0)進(jìn)行非共有蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)[9]，利用在線工具(http://www.bioinformatics.orgsms2protein_gravy.html)評(píng)估非共有蛋白的總平均親水性(grand average of hydropathicity，Gravy)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白提取得率比較

方法Ⅰ三次重復(fù)的總蛋白提取得率分別為0.21%、0.22%和0.19%，平均得率0.20%；方法Ⅱ三次重復(fù)的總蛋白提取得率分別為0.11%、0.12%和0.12%，平均得率0.12%；方法Ⅲ三次重復(fù)的總蛋白提取得率分別為0.26%、0.27%和0.27%，平均得率0.27%(圖1)。此試驗(yàn)結(jié)果顯示，方法Ⅲ的蛋白提取效率最高，而方法Ⅱ效率最低。

2.2 蛋白鑒定通量比較

三種方法提取得到的蛋白酶解后混合上機(jī)建立肽段譜圖庫，共鑒定到6 577個(gè)蛋白，25 895個(gè)肽段。三種方法鑒定蛋白的韋恩圖(圖2)結(jié)果表明，方法Ⅰ3次重復(fù)分別鑒定到4 876、4 826和4 869個(gè)蛋白，總共鑒定到5 170個(gè)蛋白；方法Ⅱ3次重復(fù)分別鑒定到5 082、4 995和5 056個(gè)蛋白，總共鑒定到5 345個(gè)蛋白；方法Ⅲ 3次重復(fù)分別鑒定到5 439、5 509和5 511個(gè)蛋白，總共鑒定到5 697個(gè)蛋白。

總鑒定蛋白的韋恩圖分析顯示，4 864個(gè)蛋白在3種方法中均有鑒定到，為共有蛋白。方法Ⅰ另外鑒定到的306個(gè)非共有蛋白中，有255個(gè)蛋白與方法Ⅲ有交集；方法Ⅱ鑒定到的481個(gè)非共有蛋白中，有421個(gè)蛋白與方法Ⅲ有交集；157個(gè)蛋白僅在方法Ⅲ鑒定到，35個(gè)蛋白僅在方法Ⅰ中鑒定到，44個(gè)僅在方法Ⅱ中鑒定到。由此可看出，方法Ⅲ提取的蛋白鑒定通量最高，并且交集到了方法Ⅰ和方法Ⅱ提取到的大部分非共有蛋白中，是提取最全面的方法。

2.3 非共有蛋白的亞細(xì)胞位置分析

方法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ鑒定到的非3組共有蛋白數(shù)分別為306、481和833，按照提取方法分別對(duì)各自的非共有蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析，并統(tǒng)計(jì)各個(gè)細(xì)胞位置分布的蛋白數(shù)和占比。結(jié)果顯示(表1)，3種方法提取的細(xì)胞質(zhì)蛋白在各自鑒定到的非共有蛋白中占比差異不大，分別為23.20%、23.91%、22.83%；而細(xì)胞核蛋白占比則變化較大。方法Ⅰ提取的細(xì)胞核蛋白數(shù)量在其鑒定到的非共有蛋白中占比37.58%，與占比第二的細(xì)胞質(zhì)蛋白相差約14%，這個(gè)差距在3種方法中最高；而方法Ⅱ中細(xì)胞核蛋白僅占16.74%，且其絕對(duì)數(shù)量在3種方法中也最低，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、液泡、細(xì)胞膜蛋白則相比方法Ⅰ有顯著提升；方法Ⅲ中細(xì)胞核蛋白占比最大為27.47%，但與細(xì)胞質(zhì)蛋白占比相差不大。方法Ⅲ提取的總蛋白數(shù)最多，分布到各亞細(xì)胞位置的絕對(duì)數(shù)量也均在3種方法中居首，大多數(shù)位置上均超過前2種方法的蛋白總和。

由此可知，3種方法對(duì)細(xì)胞蛋白的提取具有一定的位置偏好性，方法Ⅰ偏好細(xì)胞核蛋白的提??；而方法Ⅱ細(xì)胞核蛋白比例偏低，更偏向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等其他細(xì)胞器蛋白的提取；相對(duì)前兩種方法，方法Ⅲ提取的非共有蛋白較全面，在各細(xì)胞位置分布較為平衡。

2.4 非共有蛋白的親疏水性分布

總平均親水性Gravy值用以評(píng)價(jià)蛋白的親疏水性，Gravy值為正的蛋白為疏水性蛋白，為負(fù)則是親水性蛋白。對(duì)非共有蛋白的Gravy值進(jìn)行計(jì)算，并以0.5為一個(gè)區(qū)段進(jìn)行分布統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示(圖3)：三種方法提取到的草莓雌蕊蛋白均以親水性蛋白為主，方法Ⅰ提取的非共有蛋白中親疏水蛋白比例分別為93.5%和6.5%，其中強(qiáng)親水性蛋白(Gravy值<0.5)有153個(gè)；方法Ⅱ提取的非共有蛋白中親疏水蛋白比例分別為74.9%和25.1%，相較方法Ⅰ，親水性蛋白比例下降明顯，且強(qiáng)親水性蛋白絕對(duì)量也僅為103個(gè)；而方法Ⅲ中非共有蛋白親疏水性蛋白占比分別為81.8%和18.2%，比例介于前兩者之間，但各區(qū)段蛋白分布數(shù)量均高于前兩者，其中強(qiáng)親水性蛋白283個(gè)。

表1 三種方法鑒定的非共有蛋白亞細(xì)胞位置分布

圖3 非共有蛋白Gravy值分布圖Fig.3 Histogram of Gravy value distribution of non-shared proteins

3 討論

三氯乙酸/丙酮沉淀法和酚提法是傳統(tǒng)常用的植物組織蛋白提取方法，酚氯仿法則是對(duì)酚提法的優(yōu)化。本研究結(jié)果表明，兩種傳統(tǒng)方法中，三氯乙酸/丙酮法的總蛋白提取得率高于酚提法，約為后者的1.67倍，但質(zhì)譜鑒定通量不及后者，這與Jin等[11]在棉花葉片蛋白提取上的試驗(yàn)結(jié)果相符；提取蛋白種類方面，三氯乙酸/丙酮法中細(xì)胞核和強(qiáng)親水性蛋白的提取比例較高、疏水性蛋白提取能力較弱，而酚提法中細(xì)胞核和親水性蛋白提取能力下降、疏水性和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等其他細(xì)胞器蛋白比例提升。

本研究借鑒核酸提取時(shí)去除蛋白雜質(zhì)的原理，通過在傳統(tǒng)酚提法中加入氯仿提取步驟，建立了新的酚氯仿抽提蛋白方法。在傳統(tǒng)酚提法中，組織細(xì)胞中的蛋白首先溶入提取液水層，再經(jīng)酚抽提變性溶入酚層后，用甲醇沉淀純化并濃縮[12]。但由于酚與水能部分互溶(常溫下約8 g酚溶于100 g水)，水層中仍有少量酚和強(qiáng)親水性蛋白殘留[13]。核酸提取時(shí)，常用酚氯仿混合物萃取含有核酸的水相，去除水相中的蛋白。氯仿在其中除了變性蛋白外，還起進(jìn)一步萃取酚進(jìn)入氯仿層、加速水相和酚相分離的作用[14]。酚提取后加入氯仿抽提步驟，預(yù)計(jì)將增加親水性尤其是強(qiáng)親水性蛋白的提取比例，本研究結(jié)果支持了這一預(yù)測(cè)。相比酚提法，酚氯仿法提取的親水性蛋白比例提升了6.9%，其中強(qiáng)親水性蛋白增加180個(gè)，超過了三氯乙酸/丙酮沉淀法的親水性蛋白提取容量，并同時(shí)保留了酚提法提取疏水性蛋白能力較高的特點(diǎn)，因此其蛋白提取得率和鑒定通量在3種方法中均為最高。以往的研究中注重氯仿的疏水屬性，常以氯仿/甲醇組合直接抽提細(xì)胞以進(jìn)行疏水性和脂溶性蛋白的提取，如Vertommen等[15]用氯仿/甲醇法進(jìn)行了香蕉葉片膜蛋白的提??；而本研究結(jié)果顯示，氯仿與酚組合還可以促進(jìn)親水性蛋白的提取，彌補(bǔ)酚提法親水性蛋白提取能力較弱的不足。

本研究利用DIA技術(shù)對(duì)3種方法——三氯乙酸/丙酮沉淀法、酚提法和酚氯仿法提取草莓雌蕊蛋白的適用性進(jìn)行了評(píng)估。通過總蛋白提取得率、蛋白鑒定通量、非共有蛋白亞細(xì)胞位置和親疏水性分布4個(gè)方面的綜合評(píng)價(jià)得出，3種方法中酚氯仿法的提取效率最高，蛋白提取最全面。酚氯仿法綜合了兩種傳統(tǒng)方法的特點(diǎn)，提取到了兩者大部分的非共有蛋白，兼顧了親疏水性和各細(xì)胞位置蛋白的提取，其提取得率、鑒定通量、蛋白種類相比兩種傳統(tǒng)方法均有顯著提升，為最優(yōu)提取方法。本研究結(jié)果為草莓雌蕊組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究選擇合適的蛋白提取方法提供了依據(jù)，為后續(xù)草莓雌蕊可授性機(jī)理研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。