張雅靖 舒相華 黃鑫 呂濤 王余磊 張雅倫 張智慧 羅高 李鑫漢 李向楠 宋春蓮

摘 要：為分析云南撒壩火腿中微生物的菌群構(gòu)成、物種豐富度和多樣性差異，以1 年以上的撒壩火腿為研究對象，通過提取DNA，采用Illumina高通量測序方法對火腿表面和內(nèi)部細(xì)菌的16S rDNA V3～V4區(qū)和真菌ITS2區(qū)進行擴增和測序，并對其菌落構(gòu)成和多樣性進行分析。結(jié)果表明：撒壩火腿中微生物菌群存在差異，細(xì)菌豐富度極顯著高于真菌（P<0.01），多樣性高于真菌，且內(nèi)部真菌和細(xì)菌微生物多樣性和豐富度均高于表面;子囊菌門下曲霉菌屬是表面和內(nèi)部真菌中的優(yōu)勢菌群，其次Yamadazyma和青霉菌屬也是主要菌群，這些菌屬在火腿表面的分布多于內(nèi)部;厚壁菌門下葡萄球菌屬是火腿表面和內(nèi)部細(xì)菌中的優(yōu)勢菌群，色鹽桿菌、酸桿菌和鏈球菌也是表面的主要菌群;放線菌、桿菌屬、酸微菌綱及球菌屬則是火腿內(nèi)部的主要菌群，此外火腿內(nèi)部還存在大量未知微生物。綜上所述，曲霉菌和葡萄球菌是撒壩火腿表面和內(nèi)部的優(yōu)勢菌群。

關(guān)鍵詞：撒壩火腿;微生物多樣性;高通量測序;16S rDNA

Abstract： In order to analyze the microbial flora composition， species richness and diversity of Saba ham， a traditional Chinese fermented meat product in Yunnan province， total microbial DNA was extracted from Saba ham （more than one year old） for amplification and Illumina high-throughput sequencing of the V3-V4 region of the bacterial 16S rDNA gene and the ITS2 region of the fungal ITS rDNA gene on the surface and in the interior of Saba ham. Further， the microbiota composition and diversity were analyzed. The results revealed that the microbial flora in the ham varied; the diversity and abundance of bacteria were significantly higher than those of fungi （P < 0.01）， and the diversity and abundance of fungi and bacteria in the interior were higher than those on the surface （P < 0.05）. Aspergillus， a genus in the phylum Ascomycota， was the dominant fungus both on the surface and in the interior， followed by Yamadazyma and Penicillium， which were more distributed on the surface than in the interior. At the bacterial genus level， Staphylococcus， belonging to Firmicutess was dominant both on the surface and in the interior; Chromohalobacter， Mitsuokella and Streptococcus were also dominant on the surface， and Actinobacteria， Bacillus， Acidimicrobiia and Coccus were also dominant in the interior. In addition， there were a large number of unknown and unclassified microorganisms in the interior. Collectively， the above results demonstrated that Aspergillus and Staphylococcus were the dominant microbes both on the surface and in the interior of Saba ham.

Keywords： Saba ham; microbial diversity; high-throughput sequencing; 16S rDNA

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200803-184

中圖分類號：TS251.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）10-0026-07

撒壩火腿主產(chǎn)于云南省昆明市祿勸縣馬鹿塘鄉(xiāng)，馬鹿塘海拔2 750 米，常年平均氣溫10.4 ℃，屬于冷涼高寒山區(qū)[1]。當(dāng)?shù)剞r(nóng)民采用本地撒壩豬的后腿，修割成琵琶形狀，進行低溫冷涼、排血，再將配制好的鹽料分3 次上鹽、堆碼、清表面，掛于通風(fēng)陰涼處，在微生物協(xié)助下經(jīng)過長達(dá)12 個月或以上的自然熟化，成熟后的火腿具有特殊香味且有玫瑰紅色切面，是人們佐食的佳肴。近年來由于撒壩豬種稀缺，養(yǎng)殖規(guī)模急劇下降，致使撒壩火腿產(chǎn)業(yè)出現(xiàn)生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新滯后、質(zhì)量下降等問題[2]。

在火腿成熟過程中微生物對風(fēng)味的形成和品質(zhì)起著重要作用[3]。在沒有內(nèi)源性酶的情況下，微生物可以降解火腿中的蛋白質(zhì);另外微生物的群落組成和消長受氣候及地域的影響，從而促進火腿品質(zhì)特征的形成，如云南的宣威火腿、諾鄧火腿、鶴慶圓腿、三川火腿和老窩火腿等[4]。宣威火腿獨特風(fēng)味形成的基礎(chǔ)與葡萄球菌、微球菌的代謝活動和火腿表面霉菌的生長有關(guān)[5]。胡永金等[6]研究發(fā)現(xiàn)，三川火腿的優(yōu)勢菌為馬尾葡萄球菌和模仿葡萄球菌。張詩意等[7]從貴州威寧火腿中分離得到馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌、乳酸片球菌、變平滑假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌。Alapont等[8]研究表明，青霉屬、產(chǎn)黃青霉屬、納爾青霉菌屬和枝孢枝霉屬等菌株可作為西班牙特魯火腿的發(fā)酵劑。

云南傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中微生物的測定大多采用經(jīng)典的分離培養(yǎng)和菌落鑒定方法，或是分離后在顯微鏡下直接進行形態(tài)觀察，但是這些方法僅能檢測出完整微生物種群的一部分，限制了人們對微生物的認(rèn)識及利用[9]。近年來，16S rDNA分子生物學(xué)技術(shù)促進了微生態(tài)研究的發(fā)展。16S rDNA測序比傳統(tǒng)方法具有更高的檢測效率，因此在未培養(yǎng)細(xì)菌的分類中得到廣泛應(yīng)用[10]。此外，16S rDNA測序技術(shù)相對便宜，并且有一套用于數(shù)據(jù)分析的完善計算工具及數(shù)據(jù)庫，而且16S rDNA基因存在于所有細(xì)菌物種中[11]，因此被認(rèn)為是研究細(xì)菌多樣性的理想方法[12]。郭明亮[13]采用Illumina Miseq高通量測序方法對4 個月和2 年的金華火腿與成品宣威火腿的16S rDNA V3區(qū)進行研究，結(jié)果表明，葡萄球菌和乳酸菌是主要菌群。黨喜軍[14]采用純培養(yǎng)和16S/內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）測序?qū)χZ鄧火腿表面微生物進行研究，結(jié)果表明，酵母菌、曲霉菌和葡萄球菌是主要優(yōu)勢菌群。

目前關(guān)于撒壩火腿中微生物方面的系統(tǒng)研究還很少，與其他火腿的微生物構(gòu)成是否相似尚不清楚。基于此，本研究對云南撒壩火腿表面和內(nèi)部微生物的菌群構(gòu)相、微生物的豐富程度及多樣性進行系統(tǒng)分析，旨在為云南開發(fā)利用撒壩火腿微生物、發(fā)展火腿文化產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

撒壩火腿采購自云南省昆明市祿勸縣馬鹿塘鄉(xiāng)當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶，為腌制1 年以上的火腿，共3 只。土壤（HiPure Soil）DNA提取試劑盒 廣州美基生物科技有限公司;AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒 美國Axygen Biosciences公司;TruSeqTM DNA樣品制備試劑盒 美國Illumina公司;10×KOD（Kodakara品牌）緩沖液、KOD DNA聚合酶 日本Toyobo生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoPhotometer NP80超微量分光光度計 德國Implen公司;-80 ℃冰箱 合肥美菱股份有限公司;DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 德國耶拿公司;WD-9413B凝膠成像分析系統(tǒng) 北京六一生物科技有限公司;Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;ABI StepOnePlus實時PCR系統(tǒng) 美國Life Technologies公司;PE250 Illumina平臺 廣州基迪奧生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選擇3 只質(zhì)量相近的撒壩火腿隨機編號，并作統(tǒng)一處理，無菌條件下每只火腿以相同的方式在半膜肌表面切厚度0.5 cm、邊長4 cm的四方形，相應(yīng)編號為BM1、BM2、BM3，立即放入已滅菌的凍存管中;在內(nèi)部切割厚度2 cm、邊長3 cm的肉塊，相應(yīng)編號為NB1、NB2、NB3，立即放入已滅菌的凍存管中。表面和內(nèi)部樣品均采集2 份，分別裝入無菌密封袋中，貯存于-80 ℃冰箱中，一份用于細(xì)菌16S rDNA測序，一份用于真菌ITS測序[15]。

1.3.2 總DNA的提取

在無菌條件下取10 g肉樣充分混勻，用HiPure Soil DNA試劑盒按操作指南提取樣品總DNA。然后用超微量分光光度計測定DNA濃度和純度，再用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。

1.3.3 PCR擴增

經(jīng)純化后的DNA用于細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS基因擴增。以341F（5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3）和806R（5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3）為引物對細(xì)菌V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增[16];以ITS3-KYO2F（5-GATGAAGAACGYAGYRAA-3）和ITS4R（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）為引物對真菌ITS2區(qū)進行PCR擴增[17]。擴增程序：94 ℃、2 min，然后98 ℃、10 s，62 ℃、30 s，68 ℃、30 s進行30 個循環(huán)，最后68 ℃、5 min。擴增體系（50 μL）：5 μL 10×KOD緩沖液、5 μL 2 mmol/L dNTPs、3 μL 25 mmol/L MgSO4、上下游引物各1.5 μL（10 μmol/L）、1 μL DNA聚合酶、100 ng模板DNA。

1.3.4 Illumina測序

從2%瓊脂糖凝膠中搜集擴增子，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒按操作說明進行純化，并使用ABI StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)進行定量[13]。純化后的擴增子根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作在Illumina平臺上進行雙端測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Omicsmart動態(tài)實時數(shù)據(jù)分析平臺（http：//www.omicsmart.com）進行數(shù)據(jù)分析。利用FASTP軟件（版本0.18.0）對原始測序數(shù)據(jù)進行過濾，使用QIIME軟件（版本1.9.1）進行序列拼接。參考數(shù)據(jù)庫（http：//drive5.com/uchime/uchime_download.html），使用UCHIME算法[18]進行tag嵌合體檢查進行后續(xù)分析。使用UPARSE（版本9.2.64）流程將Clean Tag按≥97%相似度聚類為操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），利用RDP軟件（版本2.2）進行物種分類注釋，比對SILVA數(shù)據(jù)庫[19]和ITS2數(shù)據(jù)庫[20]。使用R語言進行多元統(tǒng)計分析。使用QIIME軟件計算α多樣性指數(shù)。使用Graphpad Prism軟件（版本8.0.1）進行雙因素方差分析，判定表面和內(nèi)部真菌與細(xì)菌的差異，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異，判斷為差異顯著;P<0.01判斷為差異極顯著。

微生物菌群在干腌火腿加工過程中起著極其重要的作用。大量研究表明，霉菌、酵母菌、葡萄球菌、微球菌和乳酸菌等是干腌火腿的優(yōu)勢微生物[23]。黃占旺等[24]發(fā)現(xiàn)，霉菌和酵母菌是安福火腿表層的主要微生物，酵母菌和球菌則是內(nèi)部的主要微生物。Battilani等[25]從意大利Parma火腿表面檢測出曲霉菌和青霉菌，青霉菌占大多數(shù)，其中納地青霉占青霉屬總量的60%。在本研究中，曲霉菌是撒壩火腿表面和內(nèi)部真菌中的優(yōu)勢菌群，Yamadazyma和青霉菌也是表面的主要菌群。曲霉菌在我國金華火腿、諾鄧火腿和盤縣火腿及意大利San Daniele火腿中同樣為優(yōu)勢真菌[14，22，26-27]，具有隔絕空氣、抑制有害菌生長等多種功能[28]。Cebrián等[29]研究表明，青霉菌和酵母菌聯(lián)合使用能防治干腌火腿黃曲霉素的危害。葡萄球菌是撒壩火腿表面和內(nèi)部細(xì)菌中的優(yōu)勢菌群，但內(nèi)部存在許多未知的微生物。其次，酸桿菌和鏈球菌是撒壩火腿表面微生物的主要差異菌群，放線菌屬、桿菌屬、酸微菌綱及球菌屬則是內(nèi)部的主要差異菌群。其中，葡萄球菌屬在我國宣威火腿、劍門火腿和三川火腿及西班牙火腿中同樣為優(yōu)勢菌群[6，13，30-31]，具有較高的蛋白酶和脂肪酶活性，在維持火腿顏色、品質(zhì)和抑制不良?xì)馕懂a(chǎn)生方面起著重要作用[32]。Mu Yu等[33]研究表明，葡萄球菌屬、嗜色桿菌屬、曲霉屬和青霉菌屬等對盤縣火腿的感官品質(zhì)和安全性至關(guān)重要。說明不同工藝和環(huán)境會導(dǎo)致不同火腿中的優(yōu)勢微生物不盡相同，這也促使不同種類火腿品質(zhì)各具特色。

4 結(jié) 論

本研究對云南撒壩火腿表面和內(nèi)部微生物多樣性進行分析，結(jié)果表明，微生物菌群種類存在差異，細(xì)菌多樣性和豐富度高于真菌，內(nèi)部的微生物組成相比表面較為豐富，曲霉菌和葡萄球菌是表面和內(nèi)部的優(yōu)勢菌群。本研究結(jié)果為撒壩火腿的風(fēng)味結(jié)構(gòu)、發(fā)酵菌群的變化、病原菌的存在及微生物安全性提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王燕， 吉杰麗， 朱仁俊. 撒壩火腿成熟過程中游離氨基酸的變化研究[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2013， 29（5）： 1010-1013. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2013.05.036.

[2] 朱春賢， 趙桂英， 俞英. 提升撒壩火腿產(chǎn)業(yè)水平的意義和措施[J]. 當(dāng)代畜牧， 2016（10）： 71-77.

[3] 黃盼盼， 蔣先芝， 田建卿. 火腿微生物研究進展[J]. 生物工程學(xué)報， 2018， 34（9）： 1410-1418. DOI：10.13345/j.cjb.170496.

[4] SHAN Luying， LI Yinjiao， ZHANG Shi， et al. Analysis of the bacterial floral structure and diversity of Xuanwei ham by 16S rDNA sequencing[J]. Journal of Food Safety， 2020， 40： e12800. DOI：10.1111/jfs.12800.

[5] 李平蘭， 沈清武， 呂燕妮， 等. 宣威火腿成熟產(chǎn)品中主要微生物菌相構(gòu)成分析[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志， 2003， 15（5）： 12-13. DOI：10.13381/j.cnki.cj m.2003.05.007.

[6] 胡永金， 陳紅， 薛橋麗， 等. 云南三川火腿加工中微生物區(qū)系變化規(guī)律研究[J]. 輕工學(xué)報， 2017， 32（5）： 8-15. DOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2017.5.002.

[7] 張詩意， 唐楠， 黃攀， 等. 威寧火腿中微生物的分離鑒定及其耐受特性[J]. 肉類研究， 2019， 33（8）： 12-17. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190625-147.

[8] ALAPONT C， MART?NEZ-CULEBRAS P V， L?PEZ-MENDOZA M C. Determination of lipolytic and proteolytic activities of mycoflora isolated from dry-cured teruel ham[J]. Journal of Food Science and Technology， 2015， 52（8）： 5250-5256. DOI：10.1007/s13197-014-1582-5.

[9] 王燕， 朱仁俊. PCR-DGGE技術(shù)及其在云南傳統(tǒng)火腿微生物研究中的應(yīng)用展望[J]. 肉類工業(yè)， 2012（9）： 50-52.

[10] 曹榮， 張井， 孟輝輝， 等. 高通量測序與傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法在牡蠣微生物群落分析中的應(yīng)用對比[J]. 食品科學(xué)， 2016， 37（24）： 137-141. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201624021.

[11] DE FILIPPIS F， PARENTE E， ERCOLINI D. Metagenomics insights into food fermentations[J]. Microbial Biotechnology， 2017， 10（1）：?91-102. DOI：10.1111/1751-7915.12421.

[12] KUCZYNSKI J， LAUBER C， WALTERS W， et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome[J]. Nature Reviews Genetics， 2012， 13： 47-58. DOI：10.1038/nrg3129.

[13] 郭明亮. 火腿菌群分析及優(yōu)良菌株對發(fā)酵香腸中菌群構(gòu)成的影響[D]. 揚州： 揚州大學(xué)， 2015： 1-3.

[14] 黨喜軍. 諾鄧火腿化學(xué)成分測定及表面微生物多樣性研究[D]. 昆明：?云南大學(xué)， 2018： 1-2.

[15] 中華人民共和國衛(wèi)生部， 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會. 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 肉與肉制品檢驗： GB/T 4789.17—2003[S]. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2003.

[16] GUO Mengjiao， WU Fahao， HAO Guangen， et al. Bacillus subtilis improves immunity and disease resistance in rabbits[J]. Frontiers in Immunology， 2017， 8（2）： 354. DOI：10.3389/fimmu.2017.00354.

[17] TOJU H， TANABE A S， YAMAMOTO S， et al. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples[J]. PLoS One， 2012， 7（7）： e40863. DOI：10.1371/journal.pone.0040863.

[18] EDGAR R C， HAAS B J， CLEMENTE J C， et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J]. Bioinformatics， 2011， 27（16）： 2194-2200. DOI：10.1093/bioinformatics/btr381.

[19] PRUESSE E， QUAST C， KNITTEL K， et al. SILVA： a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB[J]. Nucleic Acids Research， 2007， 35（21）： 7188-7196. DOI：10.1093/nar/gkm864.

[20] DESANTIS T Z， HUGENHOLTZ P， LARSEN N， et al. Greengenes， a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2006， 72（7）： 5069-5072. DOI：10.1128/AEM.03006-05.

[21] GOSTINAR C， SUN Xiaohuan， ZAJC J， et al. Population genomics of an obligately halophilic basidiomycete Wallemia ichthyophaga[J]. Frontiers in Microbiology， 2019， 10： 1-12. DOI：10.3389/fmicb.2019.02019.

[22] 母雨， 蘇偉， 母應(yīng)春. 盤縣火腿微生物多樣性及主體揮發(fā)性風(fēng)味解析[J]. 食品研究與開發(fā)， 2019， 40（15）： 77-85. DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2019.15.013.

[23] 王磊. 干腌火腿生產(chǎn)中微生物作用研究進展[J]. 肉類研究， 2008， 22（10）： 16-18.

[24] 黃占旺， 徐明生， 湯凱潔， 等. 安福火腿發(fā)酵微生物分離與發(fā)酵工藝研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)）， 2003， 25（4）： 635-638. DOI：10.13836/j.jjau.2003145.

[25] BATTILANI P， PIETRI A， GIORNI P， et al. Penicillium populations in dry-cured ham manufacturing plants[J]. Journal of Food Protection， 2007， 70： 975-980. DOI：10.4315/0362-028X-70.4.975.

[26] 賀稚非， 甄宗圓， 李洪軍， 等. 金華火腿發(fā)酵過程中微生物區(qū)系研究[J]. 食品科學(xué)， 2008， 29（1）： 190-195.

[27] COMI G， IACUMIN L. Ecology of moulds during the pre-ripening and ripening of San Daniele dry cured ham[J]. Food Research International， 2013， 54（1）： 1113-1119. DOI：10.1016/j.foodres.2013.01.031.

[28] NUNES C， COIMBRA M A， SARAIVA J， et al. Study of the volatile components of a candied plum and estimation of their contribution to the aroma[J]. Food Chemistry， 2008， 111（4）： 897-905. DOI：10.1016/j.foodchem.2008.05.003.

[29] CEBRI?N E， RODR?GUEZ M， PEROMINGO B， et al. Efficacy of the combined protective cultures of Penicillium chrysogenum and Debaryomyces hansenii for the control of ochratoxin A hazards in dry-cured ham[J]. Toxins， 2019， 11（12）： 710. DOI：10.3390/toxins11120710.

[30] 李欣蔚， 遲原龍， 賈冬英， 等. 劍門火腿菌相構(gòu)成及主要腐敗菌特性分析[J]. 中國釀造， 2012， 31（11）： 132-134. DOI：10.3969/j.issn.0254-5071.2012.11.035.

[31] CORDERO M R， ZUMALACARREGUI J M. Characterization of Micrococcaceae isolated from salt used for Spanish dry-cured ham[J]. Letters in Applied Microbiology， 2010， 31（4）： 303-306. DOI：10.1046/j.1472-765x.2000.00818.x.

[32] 王橋美， 楊瑞娟， 嚴(yán)亮. 微生物多樣性與宣威火腿品質(zhì)關(guān)系的研究進展[J]. 食品安全導(dǎo)刊， 2016（33）： 137-139. DOI：10.16043/j.cnki.cfs.2016.33.102.

[33] MU Yu， SU Wei， MU Yingchun， et al. Combined application of high-throughput sequencing and metabolomics reveals metabolically active microorganisms during Panxian ham processing[J]. Frontiers in Microbiology， 2020， 10： 3012. DOI：10.3389/fmicb.2019.03012.