周亞澳 黃怡 王韻博 郭壯 張振東 李楊坤 侯強川

摘 要：采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對宜昌臘腸細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，并與之前報道的恩施臘腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明：宜昌臘腸在門水平主要由厚壁菌門（Firmicutes，64.93%）、變形菌門（Proteobacteria，32.12%）和放線菌門（Actinobacteria，1.14%）組成;在屬水平上，主要由葡萄球菌屬（Staphylococcus，16.57%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus，16.22%）、魏斯氏菌屬（Weissella，14.67%）和明串珠菌屬（Leuconostoc，11.43%）等組成。宜昌臘腸細(xì)菌豐度顯著低于恩施臘腸（P<0.05），且2 個地區(qū)臘腸的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異?；蚬δ茴A(yù)測結(jié)果表明，宜昌臘腸中細(xì)菌在碳水化合物代謝和多糖的生物合成與代謝等方面更加旺盛，這些差異與臘腸中乳酸桿菌的相對豐度存在顯著相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：臘腸;高通量測序;微生物群落結(jié)構(gòu);功能預(yù)測

Abstract： The bacterial diversity in Yichang sausage was analyzed by Illumina MiSeq high-throughput sequencing technique and compared with that previously reported for Enshi sausage. The results showed that the bacterial community in Yichang sausages were mainly composed of Firmicutes （64.93%）， Proteobacteria （32.12%） and Actinobacteria （1.14%） at the phylum level. At the genus level， it was mainly composed of Staphylococcus （16.57%）， Lactobacillus （16.22%）， Weissella （14.67%）， and Leuconostoc （11.43%）. The abundance of bacteria in Yichang sausages was significantly lower than that in Enshi sausage （P < 0.05）. Besides， there were great differences in the bacterial structure between the two sausages. The results of gene function prediction showed that bacteria in Yichang sausages were more vigorous in carbohydrate metabolism， and polysaccharide biosynthesis and metabolism， and these differences were significantly correlated with the relative abundance of Lactobacillus in sausages.

Keywords： sausages; high throughput sequencing; microbial community structure; function prediction

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200711-169

中圖分類號：TS251.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）10-0008-06

臘腸作為我國一種傳統(tǒng)的發(fā)酵肉制品，擁有悠久的制作歷史，現(xiàn)廣泛分布于我國華東、華中和華南等地區(qū)[1]。臘腸的制作主要以豬肉為原料，同時輔以食鹽、八角、花椒和白酒等調(diào)味料進(jìn)行腌制，灌入腸衣后進(jìn)行晾曬發(fā)酵[2]。因其風(fēng)味獨特、口感醇厚而深受廣大消費者的喜愛[3]。

宜昌市位于湖北省西南部，地處長江上游與中游結(jié)合部，其氣候為臘腸的發(fā)酵提供了有利條件。同時宜昌市是一個多民族雜居的城市，這在一定程度促進(jìn)了傳統(tǒng)臘腸制作工藝的融合發(fā)展。傳統(tǒng)臘腸的制作環(huán)境較為粗獷，不同的地理環(huán)境和氣候條件可能會賦予臘腸不同的微生物群系[4]。目前，一些學(xué)者針對不同品質(zhì)、原料及發(fā)酵和貯藏階段臘腸微生物群落組成和差異開展一些研究，滕安國等[5]發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬（Lactobacillus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）為正常臘腸和腸衣中的優(yōu)勢菌屬，而臘腸發(fā)黏變質(zhì)后微生物組成發(fā)生變化，菌群多樣性降低;劉長建等[6]從臘腸中分離得到多株具有降膽固醇能力的乳酸菌，其中干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）的降膽固醇效果最好;田甜等[7]發(fā)現(xiàn)在廣式臘腸發(fā)酵過程中添加復(fù)合發(fā)酵劑能加快發(fā)酵進(jìn)程，并降低亞硝酸鹽含量。Fougy等[8]發(fā)現(xiàn)減少臘腸中的食鹽添加量會導(dǎo)致腐敗菌生長和細(xì)菌多樣性下降;Li Xinfu等[9]通過高通量測序技術(shù)解析真空包裝臘腸貯藏過程中微生物群落的變化。此外，越來越多的研究表明，臘腸的發(fā)酵菌群直接影響著發(fā)酵的進(jìn)程和產(chǎn)品品質(zhì)，郭壯等[10]研究發(fā)現(xiàn)臘腸中的乳酸菌對產(chǎn)品發(fā)酵成熟和風(fēng)味品質(zhì)的形成具有至關(guān)重要的作用;黃金枝[11]研究發(fā)酵菌種與廣式臘腸產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）對廣式臘腸發(fā)酵品質(zhì)的影響大于漢遜德巴利酵母（Saccharomyces）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。上述研究的結(jié)果表明，臘腸品質(zhì)與其細(xì)菌組成之間存在密切聯(lián)系。然而，目前鮮有研究報道宜昌地區(qū)臘腸細(xì)菌多樣性及其與其他地區(qū)臘腸菌群結(jié)構(gòu)的差異，這在一定程度上限制了宜昌地區(qū)臘腸品質(zhì)的提升。

近年來，伴隨分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的基于非培養(yǎng)的微生物檢測方法和技術(shù)被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品微生物檢測中。其中，Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)因其檢測速率快、通量大和結(jié)果可信度高等優(yōu)點[12-13]，在海洋、土壤、發(fā)酵食品和腸道等環(huán)境樣品微生物多樣性的研究中得到廣泛應(yīng)用[14-15]。鄧風(fēng)等[16]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-變性梯度凝膠電泳與Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)相結(jié)合的方法研究恩施地區(qū)臘腸中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)恩施臘腸樣品中含有大量的共有細(xì)菌類群，優(yōu)勢細(xì)菌屬主要包括環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、葡萄球菌（Staphylococcus）、嗜冷桿菌（Psychrobacter）等，同時恩施臘腸所有測序序列中無法鑒定到屬水平的僅為13.72%。該研究結(jié)果進(jìn)一步表明Illumina MiSeq高通量測序可以作為解析臘腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的有效技術(shù)手段。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對采集自宜昌地區(qū)的臘腸細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析。此外，通過整合恩施臘腸測序數(shù)據(jù)[17]，結(jié)合多元統(tǒng)計學(xué)分析和功能預(yù)測等手段比較分析2 個地區(qū)臘腸細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和功能的差異。以期進(jìn)一步豐富人們對不同地區(qū)臘腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臘腸采集自湖北省宜昌市五峰土家族自治縣菜市場，共計9 份，編號記為YC1～YC9，所有樣品均為手工制作，且滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：1）臘腸產(chǎn)品在宜昌地區(qū)生產(chǎn)制作完成;2）臘腸使用豬肉作為制作原料;3）臘腸產(chǎn)品無霉變、無異味且無明顯雜質(zhì)存在。樣品采集時使用無菌手術(shù)刀切取約100 g裝入無菌采樣袋，密封后置于采樣箱中，低溫冷藏運回實驗室進(jìn)行后續(xù)操作。

338F/806R引物 武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司;DNeasy Mericon Food Kit 德國Qiagen公司;FastPfu Fly DNA Polymerase、5×TransStart? FastPfu緩沖液和dNTPs Mix 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Vetiri梯度基因擴增儀 美國AB SCIEX公司;ND-2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司;Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺 美國Illumina公司;R960機架式服務(wù)器 美國Dell公司;UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)、DCode? System 美國Bio-Rad公司;CR21N型高速離心機 日本日立金屬株式會社。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理及微生物宏基因組DNA提取

將采集的臘腸切碎后，稱取5 g加入到45 mL生理鹽水中，使用拍擊器拍擊5 min，400 r/min離心8 min后取上清液，于12 000 r/min離心8 min，取沉淀備用[16]。使用基因組提取試劑盒提取沉淀物宏基因組DNA。

1.3.2 PCR擴增和Illumina MiSeq測序

使用338F/806R引物（帶有7 個堿基核苷酸標(biāo)簽）對細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴增，擴增條件參照王玉榮等[17]方法。使用1.00%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計對擴增產(chǎn)物的純度和濃度進(jìn)行檢驗，將合格DNA產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

依照郭壯等[18]研究中序列質(zhì)控所約束的參數(shù)對下機序列進(jìn)行質(zhì)量控制，并依照核苷酸標(biāo)簽進(jìn)行序列的分配，將質(zhì)控后的序列分配到不同的樣本中。參照Yang Chengcong等[19]的方法，使用QIIME V1.9.1平臺對宜昌和恩施臘腸中的細(xì)菌組成和多樣性進(jìn)行解析。具體的生物學(xué)分析過程如下：1）采用PyNAST軟件對序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比對和校準(zhǔn)[20];2）使用UCLUST分別通過100%和97%相似度對校準(zhǔn)后的序列進(jìn)行劃分[21]，分別得到非冗余數(shù)據(jù)集和操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）;3）使用ChimeraSlayer軟件識別OTU中的嵌合體序列[22]，并對相應(yīng)的嵌合體序列進(jìn)行刪除;4）挑選每個OTU中的代表性序列分別使用Greengene（Version 13.8）[23]、RDP（Relace 11.5）[24]和Sliva（Version 132）數(shù)據(jù)庫[25]進(jìn)行同源性比對，確定各OTU的分類學(xué)地位，使用內(nèi)部腳本整合3 個數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果，確定各OTU的最終分類學(xué)地位;5）使用FastTree軟件構(gòu)建基于OTU代表性序列的系統(tǒng)發(fā)育樹[26];6）依據(jù)最大序列數(shù)計算每個臘腸樣本的α多樣性指數(shù)（Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Observed species指數(shù)和Simpson指數(shù)）;7）依據(jù)最小序列數(shù)計算樣品間的β多樣性。

使用PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）軟件對臘腸中細(xì)菌微生物的基因功能進(jìn)行預(yù)測[27]，并參照京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋。

1.3.4 多元統(tǒng)計學(xué)分析

使用非參數(shù)的Mann-Whitney秩和檢驗對不同地區(qū)臘腸樣品菌群組成進(jìn)行差異顯著性分析;使用LefSe軟件分析并基于LDA Effect Size判別組間豐度有顯著差異的微生物;基于Pearson相關(guān)性分析臘腸中優(yōu)勢菌屬和差異代謝通路之間的相關(guān)性。使用R軟件（v3.5.0）、STAMP軟件和Origin 2019b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 宜昌臘腸序列豐富度和多樣性分析

宜昌臘腸所有樣品共測得序列427 570 條，每個樣品的平均測序量為26 009 條（12 215～40 828，標(biāo)準(zhǔn)偏差3 192），上述序列在97%相似度劃分得到5 330 個非嵌合體OTU，每個樣本平均OUT數(shù)為931。

由表1可知，YC9臘腸的OTU數(shù)和Chao 1指數(shù)最大，而YC2臘腸的Shannon指數(shù)最大。通過對OTU數(shù)、Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)的變異系數(shù)進(jìn)行計算發(fā)現(xiàn)，宜昌臘腸在α多樣性指數(shù)上存在較大的組內(nèi)差異。相關(guān)研究顯示，Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)常分別用來評估環(huán)境中微生物的豐度和多樣性[28]。表明YC9臘腸中微生物豐度最高，而YC2臘腸的微生物多樣性最高，且宜昌臘腸中的微生物豐度和多樣性存在較大差異。

進(jìn)一步分析宜昌臘腸中的細(xì)菌菌落組成，所有樣品共注釋得到15 個菌門。由圖1可知，宜昌臘腸中優(yōu)勢菌門（平均相對豐度大于1.00%）共有3 個，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），平均相對豐度分別為64.93%、32.12%和1.14%?？梢?，宜昌臘腸中的主要菌門為厚壁菌門和變形菌門，這與鄧風(fēng)等[16]研究得到的恩施臘腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)結(jié)果基本一致。

本研究進(jìn)一步在屬水平對宜昌臘腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，由圖2可知，宜昌臘腸中優(yōu)勢菌屬（平均相對豐度大于1.00%）共有14 個，其中葡萄球菌屬（Staphylococcus，16.57%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus，16.22%）、魏斯氏菌屬（Weissella，14.67%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，11.43%）和環(huán)絲菌屬（Brochothrix，2.54%）隸屬于厚壁菌門;拉恩菌屬（Rahnella，7.91%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，5.74%）、泛菌屬（Pantoea，3.16%）、克呂沃爾氏菌屬（Kluyvera，2.76%）、腸桿菌屬（Enterobacter，2.21%）、乳球菌屬（Lactococcus，1.67%）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter，1.43%）、拉烏爾菌屬（Raoultella，1.21%）和沙雷菌屬（Serratia，1.14%）隸屬于變形菌門?？梢?，宜昌臘腸中相對豐度最高的是葡萄球菌屬和乳酸桿菌屬，這與恩施臘腸中的優(yōu)勢菌屬不盡相同，后者優(yōu)勢菌屬除葡萄球菌屬和乳酸桿菌屬外，還包括環(huán)絲菌屬，三者在樣品中的平均相對豐度分別為9.79%、2.80%和38.34%[16]。宜昌臘腸中細(xì)菌主要以乳酸菌為主，其平均相對豐度接近60%（主要以乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬和明串珠菌屬為主）。乳酸菌作為發(fā)酵肉制品中常見的發(fā)酵菌種，在一定程度上決定著發(fā)酵制品最終品質(zhì)。值得注意的是，本研究在宜昌臘腸中檢測到大量的機會性致病微生物如葡萄球菌屬和沙雷菌屬等，提示需要進(jìn)一步規(guī)范化臘腸制作過程的安全管理和質(zhì)量控制。

2.2 宜昌和恩施臘腸中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較分析

由圖3可知，宜昌臘腸中細(xì)菌的Chao 1指數(shù)極顯著低于恩施臘腸（P<0.01），Observed species指數(shù)顯著低于恩施臘腸（P<0.05），Shannon指數(shù)低于恩施臘腸，且差異不顯著，而Simpson指數(shù)略高于恩施臘腸。Chao 1指數(shù)和Observed species指數(shù)常用于評估環(huán)境樣本中微生物的豐度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)常用于評估環(huán)境中微生物的多樣性[28]?？梢姡瞬D腸中微生物的豐度明顯低于恩施臘腸，而多樣性沒有明顯差異。

本研究進(jìn)一步通過基于非加權(quán)和加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析比較2 個地區(qū)臘腸菌群的組間差異。由基于非加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析結(jié)果（圖4A）可知，宜昌和恩施臘腸的微生物菌群在空間排布上呈現(xiàn)明顯的分離趨勢，宜昌臘腸和恩施臘腸分別位于X軸的正方向和負(fù)方向，多元方差分析結(jié)果也表明二者的微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著（P<0.05）;而基于加權(quán)UniFrac距離的分析結(jié)果（圖4B）表明，雖然2 個地區(qū)的臘腸樣品整體存在分離趨勢，但部分樣品在空間排布上出現(xiàn)一定的重疊。上述結(jié)果表明，宜昌和恩施臘腸中優(yōu)勢菌群組成較為相似，但二者均含有較多獨特的低豐度菌群，這部分菌群對臘腸的整體菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。

為揭示宜昌和恩施臘腸的菌群結(jié)構(gòu)差異，通過LefSe分析比較兩地區(qū)臘腸存在顯著差異的菌群。由圖5可知，共有7 個細(xì)菌類群（判別得分>3）在2 組臘腸樣品中存在顯著差異（P<0.05），其主要為果膠桿菌屬（Pectobacterium）、腸桿菌屬和假單胞菌屬，值得注意的是，甄別出的所有差異菌均在恩施臘腸中的相對豐度顯著較高（P<0.05）。相關(guān)報道顯示，腸桿菌屬和假單胞菌屬廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，能夠有效促進(jìn)發(fā)酵制品的發(fā)酵進(jìn)程，其中假單胞菌屬與發(fā)酵制品的顏色密切相關(guān)，且對酪胺和組胺的產(chǎn)生具有一定的影響[29]。同時，發(fā)酵制品中的菌群結(jié)構(gòu)與地理環(huán)境、制作工藝和原材料等有直接的關(guān)系，不同菌群結(jié)構(gòu)可能是造成不同地區(qū)臘腸色澤、滋味和風(fēng)味差異的主要原因之一。通過對不同地區(qū)發(fā)酵制品中微生物多樣性進(jìn)行解析和菌株的收集及保藏，將對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的工業(yè)化和個性化生產(chǎn)具有重要意思。

2.3 PICRUSt功能預(yù)測

本研究利用PICRUSt軟件對宜昌和恩施臘腸中細(xì)菌類群的基因功能進(jìn)行預(yù)測，使用KEGG數(shù)據(jù)庫對預(yù)測基因進(jìn)行功能注釋，在此基礎(chǔ)上對差異代謝通路進(jìn)行分析。Z值是用于衡量樣本均值偏離整體均值的方差倍數(shù)，當(dāng)用于差異代謝通路查找時，Z值越大，則相應(yīng)的代謝通路在兩組間的差異越大。本研究選擇Z值>1.6（95%置信區(qū)間）[30]，同時代謝通路中的基因在某一地區(qū)樣品高表達(dá)概率>80%作為判定2 個地區(qū)差異代謝通路的條件。

由圖6A可知，宜昌和恩施臘腸中的細(xì)菌菌群在4 條代謝通路上存在顯著差異，且所有差異代謝通路均隸屬于與代謝相關(guān)的一級功能層。其中與碳水化合物和多糖生物合成及代謝的相關(guān)基因在宜昌臘腸微生物中顯著富集，而與能量代謝和氨基酸代謝的相關(guān)基因在恩施臘腸微生物中顯著富集。由圖6B可知，魏斯氏菌屬與氨基酸代謝呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），而乳酸桿菌屬與多糖生物合成及代謝呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與碳水化合物代謝呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。可見，宜昌地區(qū)臘腸中微生物對碳水化合物的代謝更為旺盛，并且這與臘腸中的乳酸桿菌密切相關(guān)。乳酸桿菌屬對碳水化合物的利用效率受到環(huán)境的溫度、濕度等因素的強烈影響[31]。宜昌地區(qū)相較恩施地區(qū)空氣濕度更低，且平均溫度更高，上述環(huán)境因素均有利于臘腸中乳酸桿菌的生長和代謝，這可能是宜昌臘腸中微生物碳水化合物代謝相關(guān)基因富集的原因之一。亮氨酸和異亮氨酸均為人體的必需氨基酸，由于人體無法合成，因此必須從飲食中攝取。恩施臘腸中微生物亮氨酸和異亮氨酸生物合成通路更為活躍，提示該地區(qū)生產(chǎn)的臘腸中這2 種必需氨基酸的含量可能會更為豐富。

3 結(jié) 論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對湖北宜昌臘腸中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，并和恩施臘腸進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，宜昌臘腸中的細(xì)菌主要隸屬于厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，總相對豐度98.19%;而優(yōu)勢菌屬主要以葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬和明串珠菌屬等為主。宜昌臘腸中的微生物豐度顯著低于恩施臘腸，且果膠桿菌屬、腸桿菌屬和假單胞菌屬等菌屬在宜昌地區(qū)的相對豐度顯著低于恩施地區(qū)。功能預(yù)測結(jié)果表明，宜昌和恩施地區(qū)臘腸與代謝相關(guān)的通路存在差異顯著，宜昌臘腸中細(xì)菌碳水化合物代謝和多糖生物合成與代謝更加旺盛，這些差異可能與2 個地區(qū)的氣候不同存在一定關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

[1] 龍強， 聶乾忠， 劉成國. 發(fā)酵肉制品功能性發(fā)酵劑研究現(xiàn)狀[J]. 食品科學(xué)， 2016， 37（17）： 263-269. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201617044.

[2] 楊江， 楊成聰， 凌霞， 等. 基于電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)評價襄陽地區(qū)臘腸風(fēng)味品質(zhì)[J]. 肉類研究， 2018， 32（8）： 46-50. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201808008.

[3] 劉琨毅， 王琪， 王衛(wèi)， 等. 茶多酚對低鹽中式臘腸防腐保鮮的影響[J]. 肉類研究， 2018， 32（3）： 34-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201803007.

[4] 杜莎， 李柯， 黃晴， 等. 人工發(fā)酵劑對湘西臘腸微生物菌群和理化特性的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2017， 33（4）： 241-247. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.4.037.

[5] 滕安國， 齊曉娜， 張芹， 等. 高通量測序技術(shù)分析天然腸衣香腸的菌群組成[J]. 食品研究與開發(fā)， 2016， 37（11）： 113-116. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.027.

[6] 劉長建， 蔣本國， 姜波， 等. 臘腸中降膽固醇乳酸菌的篩選及鑒定[J]. 中國釀造， 2011， 30（8）： 35-37. DOI：10.3969/j.issn.0254-5071.2011.08.011.

[7] 田甜， 詹銳琪， 張雅琳， 等. 微生物發(fā)酵技術(shù)對廣味香腸安全性提升的研究[J]. 中國調(diào)味品， 2019， 44（12）： 26-30. DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2019.12.006.

[8] FOUGY L， DESMONTS M， COEURET G， et al. Reducing salt in raw pork sausages increases spoilage and correlates with reduced bacterial diversity[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2016， 82（13）： 3928-3939. DOI：10.1128/aem.00323-16.

[9] LI Xinfu， LI Cong， YE Hua， et al. Changes in the microbial communities in vacuum-packaged smoked bacon during storage[J]. Food Microbiology， 2019， 77（2）： 26-37. DOI：10.1016/j.fm.2018.08.007.

[10] 郭壯， 王玉榮， 葛東穎， 等. 臘腸發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性評價及其對風(fēng)味的影響[J].食品科學(xué)， 2020. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20191121-255.

[11] 黃金枝. 發(fā)酵廣式臘腸加工菌種優(yōu)選及品質(zhì)變化研究[D]. 南昌： 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.

[12] LIANG Huipeng， YIN Liguo， ZHANG Yahao， et al. Dynamics and diversity of a microbial community during the fermentation of industrialized Qingcai paocai， a traditional Chinese fermented vegetable food， as assessed by Illumina MiSeq sequencing， DGGE and qPCR assay[J]. Annals of Microbiology， 2018， 68（2）： 111-122. DOI：10.1007/s13213-017-1321-z.

[13] SCHIRMER M， IJAZ U Z， DAMORE R， et al. Insight into biases and sequencing errors for amplicon sequencing with the Illumina MiSeq platform[J]. Nucleic Acids Research， 2015， 43（6）： e37. DOI：10.1093/nar/gku1341.

[14] WALSH A M， FIONA C， KIERAN K， et al. Microbial succession and flavor production in the fermented dairy beverage kefir[J]. mSystems， 2016， 1（5）： 2379-5077. DOI：10.1128/mSystems.00052-16.

[15] HE Guoqing， LIU Tongjie， ASADIQ F， et al. Insights into the microbial diversity and community dynamics of Chinese traditional fermented foods from using high-throughput sequencing approaches[J]. Journal of Zhejiang University-Science B， 2017， 18（4）： 289-302. DOI：10.1631/jzus.b1600148.

[16] 鄧風(fēng)， 王玉榮， 尚雪嬌， 等. 恩施地區(qū)臘腸的細(xì)菌多樣性[J]. 肉類研究， 2018， 32（9）： 18-22. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201809004.

[17] 王玉榮， 沈馨， 董蘊， 等. 鲊廣椒細(xì)菌多樣性評價及其對風(fēng)味的影響[J]. 食品與機械， 2018， 34（4）： 25-30. DOI：10.13652/j.issn.1003-5788.2018.04.005.

[18] 郭壯， 葛東穎， 尚雪嬌， 等. 退化和正常窖泥微生物多樣性的比較分析[J]. 食品工業(yè)科技， 2018， 39（22）： 93-98. DOI：0.13386/j.issn1002-0306.2018.22.018.

[19] YANG Chengcong， ZHAO Feiyan， HOU Qiangchuan， et al. PacBio sequencing reveals bacterial community diversity in cheeses collected from different regions[J]. Journal of Dairy Science， 2020， 103（2）： 1238-1249. DOI：10.3168/jds.2019-17496.

[20] CAPORASO J G， BITTINGER K， BUSHMAN F D， et al. PyNAST： a flexible tool for aligning sequences to a template alignment[J]. Bioinformatics， 2010， 26（2）： 266-267. DOI：10.1093/bioinformatics/btp636.

[21] EDGAR R C. UPARSE： highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J]. Nature Methods， 2013， 10： 996. DOI：10.1038/nmeth.2604.

[22] EDGAR R C， HAAS B J， CLEMENTE J C， et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J]. Bioinformatics， 2011， 27（16）： 2194-2200. DOI：10.1093/bioinformatics/btr381.

[23] DESANTIS T Z， HUGENHOLTZ P， LARSEN N， et al. Greengenes， a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2006， 72（7）： 5069-5072. DOI：10.1128/aem.03006-05.

[24] MAIDAK B L， COLE J R， LILBURN T G， et al. The RDP （ribosomal database project） continues[J]. Nucleic Acids Research， 2000， 28（1）： 173-174. DOI：10.1093/nar/28.1.173.

[25] MONIKA B， HUSON D H. SILVA， RDP， Greengenes， NCBI and OTT- how do these taxonomies compare？[J]. BMC Genomics， 2017， 18（Suppl 2）： 114. DOI：10.1186/s12864-017-3501-4.

[26] PRICE MORGAN N， DEHAL PARAMVIR S， ARKIN ADAM P. FastTree： computing large minimum evolution trees with profiles instead of a distance matrix[J]. Molecular Biology and Evolution， 2009， 26（7）： 1641-1650. DOI：10.1093/molbev/msp077.

[27] WILKINSON T J， HUWS S A， EDWARDS J E， et al. CowPI： a rumen microbiome focussed version of the PICRUSt functional inference software[J]. Frontiers in Microbiology， 2018， 9（5）： 1095. DOI：10.3389/fmicb.2018.01095.

[28] 姚國強. 傳統(tǒng)發(fā)酵乳中細(xì)菌多樣性及其功能基因研究[D]. 呼和浩特： 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2017.

[29] XIE Mengxi， AN Feiyu， ZHAO Yue， et al. Metagenomic analysis of bacterial community structure and functions during the fermentation of da-jiang， a Chinese traditional fermented food[J]. LWT-Food Science and Technology， 2020， 30（4）： 109450. DOI：10.1016/j.lwt.2020.109450.

[30] STADLMAYR A， FENG Qiang， HUBER-SCH?NAUER U， et al. Gut microbiome development along the colorectal adenoma-carcinoma sequence[J]. Nature Communications， 2015， 6： 6528. DOI：10.1038/ncomms7528.

[31] 張筠， 孟祥晨. 乳酸菌的脅迫應(yīng)答及其對碳水化合物代謝的影響[J].?中國食品學(xué)報， 2017， 17（6）： 145-151. DOI：10.16429/j.1009-7848.2017.06.020