嚴玉晶 崔婷 丁青 洪婉敏 李秀枝 孫冬梅

摘 要 目的：建立金錢草藥材的超高效液相色譜（UPLC）特征指紋圖譜，同時測定其中3種有效成分的含量，并綜合評價不同產(chǎn)地金錢草的整體質(zhì)量。方法：采用UPLC法建立10批金錢草全草、莖及葉的特征指紋圖譜并測定山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰素的含量。色譜柱為Waters CORTECS UPLC T3，流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液（梯度洗脫），檢測波長為364 nm，柱溫為30 ℃，流速為0.2 mL/min，進樣量為1 ?L。采用《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行相似度評價，確定共有峰;以山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰素、總灰分、酸不溶性灰分、二氧化硫殘留量及醇溶性浸出物為指標，采用熵權(quán)優(yōu)劣解距離法（TOPSIS）對金錢草藥材的整體質(zhì)量進行綜合評價。結(jié)果：10批金錢草全草、莖及葉共有7個共有峰，指認了其中3個峰分別為山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰素。同一部位不同批次金錢草全草的相似度均不低于0.830;同一批次金錢草莖與葉的相似度為0.504～0.859，全草與莖的相似度為0.593～0.904，全草與葉的相似度為0.885～0.995。山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰素檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.392 0～39.197 0、0.397 0～39.703 4、0.380 9～38.093 0 μg/mL（r均大于0.999 0）;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于2%;加樣回收率分別為96.43%（RSD=0.63%，n=9）、100.32%（RSD=0.46%，n=9）、101.80%（RSD=0.32%，n=9）。金錢草中上述3種成分的含量分別為0.006 3%～0.041 1%、0.002 9%～0.008 6%、0.004 4%～0.017 5%（莖）， ?0.024 8%～0.290 5%、0.000 9%～0.009 0%、0.001 3%～0.012 4%（葉），0.007 9%～0.118 0%、0.001 5%～0.008 8%、0.002 8%～0.012 5%（全草）。不同產(chǎn)地樣品間3種成分含量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;金錢草不同部位中山柰酚-3-O-蕓香糖的含量大小順序依次為葉>全草>莖，槲皮素與山柰素的含量大多以莖中含量較高。熵權(quán)TOPSIS法結(jié)果顯示，四川省中江縣、雙流縣以及重慶市石柱縣產(chǎn)金錢草的最優(yōu)解歐氏貼近度均值分別為0.446、0.512、0.287。結(jié)論：所建特征指紋圖譜和含量測定方法穩(wěn)定、可行，結(jié)合熵權(quán)TOPSIS法所建的多指標評價模型可用于金錢草藥材質(zhì)量的綜合評價;四川省產(chǎn)金錢草藥材質(zhì)量較優(yōu)。

關(guān)鍵詞 金錢草;不同部位;超高效液相色譜法;含量測定;特征指紋圖譜;熵權(quán)優(yōu)劣解距離法

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish UPLC characteristics fingerprints of Lysimachia christinae， and to simultaneously determine 3 effective components and to comprehensively evaluate the quality of L. christinae from different production areas. METHODS： UPLC method was adopted to establish characteristics fingerprint of the whole plant， stem and leaves of 10 batches of L. christinae， and determine the contents of kaemperfol-3-O-rutinoside， quercetin， kaemperfol. The determination was performed on Waters CORTECS UPLC T3 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid aqueous solution （gradient elution） at the flow rate of 0.2 mL/min. The detection wavelength was set at 364 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 1 ?L. Similarity Evaluation System for TCM Chromatographic Fingerprint（2012 edition） was adopted to evaluate its similarity， and common peaks were confirmed. Using the contents of kaemperfol-3-O-rutinoside， quercetin， kaemperfol， total ash， acid-insoluble ash and sulfur dioxide residue， the ethanol-soluble extract as index， entropy weight TOPSIS was used to evaluate the overall quality of L. christinae comprehensively. RESULTS： There were 7 common peaks in the whole plant， stem and leaves of 10 batches of L. christinae， among which 3 peaks were identified as kaemperfol-3-O-rutinoside， quercetin and kaemperfol. The similarity of same part in the whole plant of L. christinae from different batches were not lower than 0.830. The similarity between stem and leaves of L. christinae in same batch was 0.504-0.859; the similarity between whole plant and stem was 0.593-0.904; the similarity between whole plant and leaves was 0.885-0.995. The linear ranges were 0.392 0-39.197 0 μg/mL for kaempferol-3-O-rutinoside， 0.397 0- 39.703 4 μg/mL for quercetin， 0.380 9-38.093 0 μg/mL for kaempferol （r>0.999 0）. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all lower than 2%. The recoveries were 96.43% （RSD=0.63%， n=9）， 100.32% （RSD=0.46%， n=9）， 101.80% （RSD=0.32%， n=9） ，respectively. The content range of above components in L. christinae were 0.006 3%-0.041 1%， 0.002 9%-0.008 6%， 0.004 4%-0.017 5%（stem）; 0.024 8%-0.290 5%， 0.000 9%-0.009 0%， 0.001 3%-0.012 4%（leaves）; ?0.007 9%-0.118 0%， 0.001 5%-0.008 8%， 0.002 8%-0.012 5%（whole plant）. There was no significant difference in the contents of 3 components in L. christinae among different producing areas （P>0.05）. The order of the contents of kaempferol-3-O- rutinoside in different parts of L. christinae was leaves>whole plant>stem. The contents of quercetin and kaempferol were high relatively in the stem. Results of entropy weight TOPSIS method showed that mean values of Ci for L. christinae from Zhongjiang county and Shuangliu county of Sichuan province， Shizhu county of Chongqing city were 0.446，0.512，0.287. CONCLUSIONS： Established fingerprint and content determination method are stable and feasible， and multi-index evaluation model constructed by characteristic chromatogram combined with entropy weight TOPSIS analysis method can be used for comprehensive quality evaluation of L. christinae. The quality of L. christinae from Sichuan province is better.

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以槲皮素為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，7個共有峰相對保留時間的RSD≤0.48%（n=6），相對峰面積的RSD≤1.14%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取金錢草樣品粉末（編號：S1）約1.0 g，精密稱定，共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以槲皮素為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，7個共有峰相對保留時間的RSD≤0.49%（n=6），相對峰面積的RSD≤1.98%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 特征指紋圖譜的建立 取金錢草全草及不同部位樣品各10批，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》建立特征指紋圖譜。分別以S1、J1、Y1樣品色譜圖為參照圖譜，設(shè)置時間窗寬度為0.1 min，通過多點校正、全譜峰匹配分別生成共有特征指紋圖譜，同時采用中位數(shù)法分別生成對照特征指紋圖譜。結(jié)果，每批金錢草全草及不同部位樣品均有7個共有峰，不同批次的金錢草相同部位間的色譜峰相似，化學(xué)成分整體差異較小，詳見圖1。

2.1.8 共有峰的指認 取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。通過與混合對照品圖譜比對，共指認3個共有峰，分別為山柰酚-3-O-蕓香糖苷（5號峰）、槲皮素（6號峰）、山柰素（7號峰）。因6號峰槲皮素的分離度較優(yōu)、峰形較好，故以其為參照，計算其他各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見圖2。

2.1.9 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行相似度評價，結(jié)果見表2、表3。由圖1、表2可知，同一部位不同批次金錢草的特征圖譜基本相似，與其對照特征指紋圖譜一致性較好，相似度均不低于0.830，表明同一部位各批次間金錢草的化學(xué)成分差異較小。由表3可知，同一批次金錢草莖與葉的相似度為0.504～0.859，全草與莖的相似度為0.593～0.904，全草與葉的相似度為0.885～0.995，表明同一批次不同部位間金錢草的化學(xué)成分含量存在較大差異，其中金錢草全草與莖的相似度較低，而全草與葉的相似度較高，提示葉的化學(xué)成分與全草相似。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項。

2.2.2 溶液的制備 混合對照品溶液的制備同“2.1.2”項，供試品溶液的制備同“2.1.3”項。取80%甲醇溶液，經(jīng)0.22 ?m 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得陰性對照溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各待測成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰素計均大于200 000，且陰性對照無干擾，詳見圖3。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項下混合對照品溶液各0.1、0.5、1、2.5、5、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋并定容，搖勻，得系列線性工作溶液。取上述工作溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以各待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標（X，μg/mL）、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果，山柰酚-3-O-蕓香糖苷的回歸方程為Y=5 360.4X-70.392（r=0.999 9），槲皮素的回歸方程為Y=18 957.0X-8 616.700（r=0.999 8），山柰素的回歸方程為Y=23 319.0X-10 425.000（r=0.999 9），表明上述3種成分檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.392 0～39.197 0、0.397 0～39.703 4、0.380 9～38.093 0 μg/mL。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.4”項下線性工作溶液（山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰素的質(zhì)量濃度分別為26.131 3、26.468 9、25.395 3 μg/mL），按“2.2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰素峰面積的RSD分別為0.82%、0.51%、0.70%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰素峰面積的RSD分別為1.11%、0.99%、1.02%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取金錢草樣品粉末（編號：S1），約1.0 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結(jié)果，山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰素的平均含量分別為0.033 6%、0.001 9%、0.003 4%，RSD分別為1.52%、1.43%、1.60%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量（含山柰酚-3-O-蕓香糖苷0.033 6%、槲皮素0.001 9%、山柰素0.003 4%）的金錢草樣品粉末（編號：S1），約0.5 g，共9份，按對照品與供試品中指標成分質(zhì)量之比0.5 ∶ 1、1 ∶ 1、1.5 ∶ 1，分別加入一定量的混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果，3個成分的平均加樣回收率分別為96.43%（RSD=0.63%，n=9）、100.32%（RSD=0.46%，n=9）、101.80%（RSD=0.32%，n=9）。

2.2.9 樣品含量測定 取金錢草全草及不同部位樣品粉末各10批，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量（按干燥品計）。每批樣品平行操作2次。采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。樣品含量測定結(jié)果見表4、表5。

由表5可知，不同產(chǎn)地金錢草全草及不同部位樣品中3種成分含量分別比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明不同產(chǎn)地金錢草整體質(zhì)量較穩(wěn)定;不同部位金錢草中山柰酚-3-O-蕓香糖的含量大小順序依次為葉>全草>莖;槲皮素與山柰素的含量大多以莖中含量較高。這提示，金錢草的莖為槲皮素和山柰素的富集部位，而葉則是山柰酚-3-O-蕓香糖的富集部位。

2.3 熵權(quán)TOPSIS法分析

2.3.1 歸一化處理 取10批金錢草藥材（全草），分別按照2015年版《中國藥典》（四部）通則“2302灰分測定法”[19]測定總灰分、酸不溶性灰分，按照通則“2331二氧化硫殘留量測定法”第一法[19]測定二氧化硫殘留量，按照通則“2201浸出物測定法”熱浸法[19]測定醇溶性浸出物（用75%乙醇作溶劑）。同時，根據(jù)含量測定結(jié)果（表4），按公式（1）（2）對原始試驗數(shù)據(jù)進行歸一化處理[16-17]：

式中，Rij表示不同指標類型;Xij表示多目標決策矩陣，其中i表示樣本值（i=1，2，……m），j表示指標值（j=1，2，……m） 。各指標歸一化處理結(jié)果見表6。

2.3.2 加權(quán)決策矩陣 熵權(quán)法是基于評價指標的信息熵大小與差異離散程度，計算獲得各指標權(quán)重（Wj），以客觀反映各批金錢草樣品在綜合質(zhì)量評價過程中的重要性[16-17]。金錢草中山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰素、總灰分、酸不溶性灰分、二氧化硫殘留量及醇溶性浸出物的權(quán)重（Wj）=（0.259，0.155，0.131，0.073，0.079，0.117，0.186）。計算方法見公式（3）[16-17]：

式中，Z表示加權(quán)決策矩陣，加權(quán)決策矩陣結(jié)果見表7。

2.3.3 最優(yōu)與最劣方案的確定 根據(jù)加權(quán)決策矩陣得到最優(yōu)方案[Z +，Z +=max（Z1，Z2，…Zm） ]和最劣方案[Z-，Z-=min（Z1，Z2，…Zm）] [16-17]。結(jié)果，Z +=（0.259，0.155，0.131，0.073，0.079，0.117，0.186），Z-=（0，0，0，0，0，0，0）。

2.3.4 歐氏貼近度的計算及質(zhì)量評價 根據(jù)最優(yōu)與最劣方案，按公式（4）（5）（6）計算金錢草樣品與最優(yōu)方案的距離（D+）、與最劣方案的距離（D-）及最優(yōu)解的歐氏貼近度（Ci）[16-17]：

D+越小、D-越大、Ci越大，則被評價樣品越優(yōu)[16-17]。金錢草質(zhì)量評價結(jié)果見表8。

由表8可知，Ci排名前3位的依次為S3、S5、S7，其中1批（S3）來自四川省中江縣、2批（S5、S7）來自四川省雙流縣。四川省中江縣、雙流縣以及重慶市石柱縣產(chǎn)區(qū)的Ci均值依次為0.446、0.512、0.287，表明四川產(chǎn)金錢草質(zhì)量優(yōu)于重慶產(chǎn)樣品。

3 討論

通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，金錢草的特征圖譜檢測波長主要集中在240 nm和360 nm 左右[20-23]，故本研究對240、310、364 nm波長進行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以240、310 nm為檢測波長時，各色譜峰響應(yīng)值相差較大且基線不平穩(wěn);而當以364 nm為檢測波長時，各色譜峰信號響應(yīng)值較高且色譜峰分離度較好、基線較平穩(wěn)，故選擇364 nm為檢測波長。同時，本研究又對不同提取方式（超聲、回流）、提取溶劑（80%甲醇、50%甲醇、甲醇、無水乙醇、稀乙醇等）和提取時間（10、20、30 min）進行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以80%甲醇、超聲處理20 min時，各指標成分含量較高，共有峰峰形較好，色譜峰分離度均大于1.5，故采用“2.1.3”項下制備方法。

為客觀評價金錢草藥材質(zhì)量，本研究建立了不同產(chǎn)地金錢草全草及不同部位的特征指紋圖譜，并對其中山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰素的含量進行了比較。結(jié)果顯示，10批金錢草全草及不同部位樣品均有7個共有峰，指認了山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山柰素3個共有峰;金錢草莖與葉相似度較低，全草與莖的相似度較低、與葉的相似度較高。不同產(chǎn)地金錢草全草及不同部位的3種成分含量在葉、全草中差異較小，在莖中差異較大，提示葉的化學(xué)成分與全草相似、含量接近。葉為山柰酚-3-O-蕓香糖的富集部位，莖為槲皮素和山柰素的富集部位，故為保證療效的一致性，在儲存該藥材時，應(yīng)注意藥材的完整性。熵權(quán)TOPSIS結(jié)果顯示，四川省雙流縣產(chǎn)金錢草藥材的Ci均值高于其余2個產(chǎn)地樣品，提示四川省雙流縣產(chǎn)金錢草藥材的整體質(zhì)量較佳。

本研究所建特征指紋圖譜與含量測定方法穩(wěn)定、可行，可用于評價和比較金錢草藥材的整體質(zhì)量及莖、葉的化學(xué)成分差異，明確有效成分的富集部位，為進一步探討金錢草不同部位化學(xué)成分引起的藥效差異及藥材資源的合理利用提供了數(shù)據(jù)支撐，也為該藥材的道地性研究提供了基礎(chǔ)，進一步促進了金錢草優(yōu)質(zhì)種源的研究與開發(fā)。

參考文獻

[ 1 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：219-220.

[ 2 ] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草：第6冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：94-95.

[ 3 ] 劉雋，鄒國林.金錢草的研究進展[J].唐山師范學(xué)院學(xué)報，2002，24（2）：8-10.

[ 4 ] 高飛飛.金錢草的化學(xué)成分研究[D].重慶：西南大學(xué)，2013.

[ 5 ] 汪丹，蔡甜，吳志軍，等.液質(zhì)聯(lián)用分析金錢草醇提物中的化學(xué)成分[J].成都大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，34（3）：234-237.

[ 6 ] 陶婷婷，趙凡，葉妙勇，等.金錢草總黃酮對草酸鈣結(jié)石模型大鼠腎組織骨橋蛋白表達的影響[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2019，29（8）：623-626.

[ 7 ] 王洋.金錢草活性成分及藥理作用研究[D].西寧：青海師范大學(xué)，2018.

[ 8 ] 王洋，段培琪，王華清，等.小葉金錢草醇提物的抗炎、鎮(zhèn)痛及利膽作用研究[J].華西藥學(xué)雜志，2018，33（3）：267-269.

[ 9 ] 吳敦鋒.復(fù)方金錢草顆粒對腎結(jié)石患者利尿、解痙、抗炎作用效果探究[J].北方藥學(xué)，2016，13（10）：77-78.

[10] 吳學(xué)敏，顧成娟，歐文娥，等.大葉金錢草、雞內(nèi)金、桃仁治療尿石癥經(jīng)驗：仝小林三味小方擷萃[J].吉林中醫(yī)藥，2020，40（7）：868-870.

[11] 李娜.紅豆杉藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及中藥金錢草質(zhì)量評價模式探究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2018.

[12] 李可.四川省不同來源地金錢草種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[13] 李清林，陶鋒.浙江省不同產(chǎn)地金錢草總黃酮含量的測定[J].中國中醫(yī)藥科技，2017，24（1）：49-50.

[14] 王俊文，熊穎，陳曉虎，等.過路黃和廣金錢草的HPLC指紋圖譜比較研究[J].中草藥，2016，47（5）：827-831.

[15] 文晶晶，黃桂紅，韋奕，等.廣金錢草和金錢草不同部位總黃酮含量研究[J].中國民族民間醫(yī)藥，2019，28（8）：58- 60.

[16] 李運，張霽，徐福榮，等.多指標決策分析TOPSIS對三七質(zhì)量評價研究[J].中草藥，2017，48（22）：4764-4771.

[17] 馬天翔，顧志榮，許愛霞，等.基于OPLS結(jié)合熵權(quán)TOPSIS法對不同產(chǎn)地鎖陽的鑒別與綜合質(zhì)量評價[J].中草藥，2020，51（12）：3284-3291.

[18] 陳濤，胡君，呂明遠，等.基于超高效液相色譜法（UPLC）測定芪丹利心丸中丹酚酸B的含量[J].山西中醫(yī)，2018，34（11）：50-53.

[19] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：202、204、208.

[20] 周祎，郜紅利.HPLC-DAD法同時測定中藥金錢草中6種活性成分的含量[J].中國藥師，2016，19（8）：1609-1611.

[21] 郭林林，趙德，鄧君.金錢草藥材的HPLC指紋圖譜研究[J].中藥材，2012，35（3）：382-385.

[22] 金麗鑫.金錢草對照藥材標定技術(shù)標準的研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[23] 方國花.金錢草超微粉、總黃酮富集及藥材指紋圖譜研究[D].吉林：長春中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

（收稿日期：2020-09-09 修回日期：2020-11-04）

（編輯：陳 宏）