李周容 龍海波 孫燕芳

摘要 2014年-2018年，對海南省蔬菜根結(jié)線蟲病害進(jìn)行了田間隨機(jī)采樣調(diào)查和病原種類分子鑒定。結(jié)果顯示，蔬菜根結(jié)線蟲病在海南18市縣均有發(fā)生，且大部分旱田連作地塊病株率達(dá)到80%以上。進(jìn)一步對采集的295份根結(jié)線蟲樣本種類進(jìn)行了分子鑒定，共鑒定出象耳豆根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲3種病原種。其中，象耳豆根結(jié)線蟲單一檢出率達(dá)到62.37%，南方根結(jié)線蟲單一檢出率為23.39%，爪哇根結(jié)線蟲的檢出率僅為576%，象耳豆根結(jié)線蟲和南方根結(jié)線蟲復(fù)合侵染檢出率為8.47%。除五指山市樣本以外，海南其余17市縣樣本均檢測到象耳豆根結(jié)線蟲侵染為害。本研究顯示象耳豆根結(jié)線蟲為海南省蔬菜上的優(yōu)勢病原根結(jié)線蟲種類，該結(jié)果對指導(dǎo)品種布局、制定根結(jié)線蟲病害的防治策略具有重要意義。

關(guān)鍵詞 海南; 根結(jié)線蟲; 蔬菜; 發(fā)生種類; 分布

中圖分類號： S 436.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019440

Abstract A systemic investigation of the root-knot nematodes （Meloidogyne spp.） occurring on vegetables in Hainan province was conducted during 2014-2018. The results showed that root-knot nematodes are commonly found in all 18 cities and counties of Hainan province， and the rate of diseased plant was exceeded 80% in most of continuous cropping uplands. A total of 295 samples were collected and assayed for presence of Meloidogyne spp. M.enterolobii， M.incognita and M.javanica were detected at incidences of 62.37%， 23.39% and 5.76%， respectively. In addition， 8.47% samples were M.enterolobii and M.incognita mixtures. Moreover， M.enterolobii was widely distributed in 17 out of 18 counties/cities in Hainan province. These results indicated M.enterolobii now become the predominant specie in vegetables in Hainan， which is helpful for making proper strategies of root-knot nematode diseases control.

Key words Hainan; root-knot nematode; vegetable; species; distribution

根結(jié)線蟲Meloidogyne spp.是全球農(nóng)作物生產(chǎn)上重要的病原物之一，危害包括蔬菜、果樹和糧食作物在內(nèi)的3 000多種植物[1-2]。目前，國際上已報(bào)道的根結(jié)線蟲有100余種，其中經(jīng)濟(jì)上最為重要，分布最為廣泛的主要有南方根結(jié)線蟲M.incognita、爪哇根結(jié)線蟲M.javanica、花生根結(jié)線蟲M.arenaria、北方根結(jié)線蟲M.hapla和象耳豆根結(jié)線蟲M.enterolobii等5種病原根結(jié)線蟲[3]。在我國，北方溫帶地區(qū)蔬菜上最常見的為南方根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲，而南方熱帶亞熱帶地區(qū)最常見的有南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲[4-5]。

海南省地處熱帶，冬季露地蔬菜種植面積近20萬hm2，是我國重要的南菜北運(yùn)基地。陳綿才等[6]2001年對海南主要蔬菜基地抽樣調(diào)查結(jié)果表明，幾乎所有瓜類、茄果類和豆類蔬菜均遭受根結(jié)線蟲危害，鑒定種類主要為南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲，其中南方根結(jié)線蟲為優(yōu)勢種。近些年來，隨著種植年限不斷增加和重茬連作，海南蔬菜根結(jié)線蟲危害日趨加重，且象耳豆根結(jié)線蟲已發(fā)展成為主要的病原根結(jié)線蟲種類[7-8]。為進(jìn)一步明確海南蔬菜根結(jié)線蟲發(fā)生及其分布， 2014年-2018年對海南蔬菜根結(jié)線蟲進(jìn)行了田間采樣調(diào)查和種類鑒定，以期為根結(jié)線蟲病害綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 取樣調(diào)查

2014年-2018年，對海南省18個市縣（除三沙市以外）的冬季瓜菜主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行隨機(jī)取樣調(diào)查，每田塊調(diào)查10株根系，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。將具有“根結(jié)”癥狀的病根編號，標(biāo)注采集信息帶回實(shí)驗(yàn)室分離根結(jié)線蟲。

1.2 線蟲分離

將病根表面泥土清洗干凈，置于1%食用色素亮藍(lán)液中浸泡染色1 min[9]，隨后用清水輕輕沖洗去掉染色液，在解剖鏡下挑取卵囊和雌成蟲。雌蟲用于會陰花紋的制作和DNA的提取，卵囊接種于感病番茄（品種為‘特級大明星）上進(jìn)行種群活體保存。

1.3 線蟲DNA提取

參照萬新龍等[10]所描述的方法，略有修改。挑取單雌蟲置于含有10 μL滅菌雙蒸水的PCR管中，點(diǎn)動離心后放入液氮中速凍30 s，用滅菌玻璃棒將雌蟲研磨破碎。加入8 μL10×PCR Buffer（TaKaRa），2 μL蛋白酶K（20 mg/mL），輕彈混勻后在PCR儀中65℃溫育90 min，接著95℃保溫10 min。樣品于13 000 r/min離心1 min，取其上清液用于PCR擴(kuò)增或者于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 線蟲SCAR標(biāo)記特異性引物擴(kuò)增

利用根結(jié)線蟲的SCAR標(biāo)記引物擴(kuò)增特異性條帶，其中南方根結(jié)線蟲MiF/MiR引物（5′-GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3′/5′-ACGAGGAACATACT-

TCTCCGTCC-3′）退火溫度為62℃[11];爪哇根結(jié)線蟲MjF/MjR 引物（5′-ACGCTAGAATTCGACCCTGG-3′/5′-GGTACCAGAAGCAGCCATGC-3′）

退火溫度為60℃[11];象耳豆根結(jié)線蟲MeF/MeR引物（5′-AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG-3′/5′-TCAGTTCAGGCAGGATCAACC-3′）退火溫度為58℃[12];花生根結(jié)線蟲引物MaF/MaR（5′-TCGAGGGCATCTAATAAAGG-3′/5′-GGGCTGAATATTCAAAGGAA-3′）退火溫度為56℃[13]。擴(kuò)增總體系為50 L，其中10×PCR Buffer 5 μL， dNTPs 4 μL，Mg2+ 3 μL， 上、下游引物各1 μL， rTaq 酶0.25 μL，DNA 模板5 μL，滅菌雙蒸水30.75 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南冬季蔬菜根結(jié)線蟲病發(fā)生情況

根結(jié)線蟲病害在海南冬季蔬菜上普遍發(fā)生，18市縣均采集到根結(jié)線蟲樣本，受害寄主包括茄科、豆科、葫蘆科和十字花科在內(nèi)的多種瓜菜和葉菜（圖1）。在發(fā)病率上，蔬菜連作田（旱地/坡地）高于稻菜輪作田（水田），大部分連作地塊株發(fā)病率達(dá)到100%，而稻菜輪作田發(fā)病率均低于50%（表1）。

2.2 根結(jié)線蟲種類分子鑒定

通過提取采集的各根結(jié)線蟲種群單雌蟲DNA，結(jié)合利用不同種類根結(jié)線蟲的特異性引物，共鑒定出象耳豆根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲3種根結(jié)線蟲。表2為本研究根結(jié)線蟲代表性種群的鑒定結(jié)果。利用象耳豆根結(jié)線蟲特異引物（MeF/MeR）擴(kuò)增，DZ5、SY7、WC3和LG3種群獲得長度約為300 bp的單一條帶（圖2a）;HK3、SY9、WC5和WC6種群獲得南方根結(jié)線蟲特異性條帶，長度約為900 bp（圖2b）;利用爪哇根結(jié)線蟲特異引物（MjF/MjR）擴(kuò)增，僅DA5種群獲得長度約為500 bp的單一條帶（圖2c）。此外，利用花生根結(jié)線蟲特異引物（MaF/MaR）擴(kuò)增，所有種群均無條帶（圖2d）。

2.3 不同種類根結(jié)線蟲的檢出率

由表3可知，總共鑒定295份根結(jié)線蟲樣本，象耳豆根結(jié)線蟲和南方根結(jié)線蟲分別有184份和69份（不包含混合發(fā)生種群），檢出率分別為62.37%和23.39%。爪哇根結(jié)線蟲的檢出率僅為5.76%。此外，象耳豆根結(jié)線蟲和南方根結(jié)線蟲混合發(fā)生的樣本檢出率為8.48%。

2.4 不同種類根結(jié)線蟲分布區(qū)域

由表3可知，象耳豆根結(jié)線蟲在海南各市縣廣泛發(fā)生分布，除五指山縣采集的樣品以外，其余17市縣均檢測到象耳豆根結(jié)線蟲的寄生為害。南方根結(jié)線蟲在?？?、文昌、澄邁、儋州、昌江、三亞和定安等7個市縣發(fā)生分布。而爪哇根結(jié)線蟲僅在定安和五指山有檢出。

3 討論

由于獨(dú)特的熱帶氣候條件，根結(jié)線蟲在海南無越冬休眠期，造成世代重疊現(xiàn)象普遍。根結(jié)線蟲一旦發(fā)生，在短時間內(nèi)可大量繁殖累積，并持續(xù)危害造成作物重大產(chǎn)量損失，嚴(yán)重時可達(dá)80%以上[6]。本研究在海南全省范圍的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線蟲除了危害葫蘆科、茄科和豆科蔬菜等高感寄主以外，還擴(kuò)散至葉菜類蔬菜，表明根結(jié)線蟲病危害范圍不斷擴(kuò)大，已成為海南蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展不可忽視的限制因子。而水稻-蔬菜輪作田病株率明顯低于蔬菜連作地塊，表明水旱輪作是防治根結(jié)線蟲病害非常有效的農(nóng)業(yè)措施，在條件允許的情況下，可采取水旱輪作制度，降低土壤中根結(jié)線蟲基數(shù)，從而減輕病害的發(fā)生。

本研究共鑒定出象耳豆根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲3種根結(jié)線蟲危害海南冬季蔬菜。其中，象耳豆根結(jié)線蟲檢出率超過60%，已取代南方根結(jié)線蟲成為蔬菜上的優(yōu)勢根結(jié)線蟲種類。象耳豆根結(jié)線蟲具備高度致病性和極其廣泛的寄主范圍，被國際公認(rèn)為是最具危害性的病原根結(jié)線蟲種類[14]。目前，生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的番茄（Mi）和辣椒（N）抗性品種，主要對南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲具有抗性作用[15]。象耳豆根結(jié)線蟲能夠克服Mi和N基因介導(dǎo)的抗性反應(yīng)，在抗性辣椒和番茄品種上侵染和快速繁殖，而且至今仍然缺乏對該線蟲有效的抗性品種資源[16]。因此，象耳豆根結(jié)線蟲比南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲等種類具有更好的寄主適應(yīng)性和種間競爭優(yōu)勢，這也很可能是其快速擴(kuò)散并演替成為優(yōu)勢種類的原因之一。

當(dāng)前，海南種植戶生產(chǎn)上對蔬菜根結(jié)線蟲的防控主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，例如辛硫磷和二嗪磷等毒性較高的殺蟲劑。但是，長期單一使用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染和抗藥性等問題突出，不符合現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展需求。本研究結(jié)果明確了海南蔬菜根結(jié)線蟲種類及其分布，對于指導(dǎo)農(nóng)戶采取適宜的輪作制度、品種布局等綠色防控措施具有重要的指導(dǎo)意義。在此基礎(chǔ)上，還需進(jìn)一步結(jié)合輪作倒茬[17]、土壤陽光消毒[18]、生物熏蒸[19]和生防菌劑[20]等有效措施綜合防控根結(jié)線蟲危害，從而確保海南蔬菜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）