孟峰 靳學(xué)慧 張亞玲

摘要 根據(jù)已公布的PWL家族基因序列設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，對(duì)329個(gè)采自2016年及2017年黑龍江省各稻區(qū)的水稻稻瘟病菌單孢菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增與序列分析，研究了水稻稻瘟病菌中PWL家族基因的組成及變異特征。結(jié)果顯示，PWL2與PWL4在黑龍江省各稻區(qū)稻瘟菌中均有分布且穩(wěn)定存在，出現(xiàn)頻率分別為73.86%與73.25%;PWL3出現(xiàn)頻率為40.73%;PWL1在329個(gè)菌株DNA中均未擴(kuò)增出目的條帶，再次驗(yàn)證了PWL1在水稻的稻瘟病菌中顯示為完全缺失。對(duì)部分菌株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，PWL2、PWL3和PWL4基因編碼區(qū)在黑龍江省水稻稻瘟病菌株中的主要變異為點(diǎn)突變，且引起氨基酸的突變。

關(guān)鍵詞 黑龍江省; 水稻稻瘟病菌; PWL基因家族

中圖分類號(hào)： S 435.111.41

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019432

Abstract Four pairs of specific primers were designed based on the published sequences of the PWL gene family. The DNAs of 329 isolates of rice blast fungi isolated from different rice regions in Heilongjiang province in 2016 and 2017 were used as templates to amplify and sequence the target genes by PCR. The composition and variation of the PWL gene family in rice blast fungi were studied. The results showed that PWL2 and PWL4 were distributed and existed stably in all rice areas of Heilongjiang with an occurrence frequency of 73.86% and 73.25%， respectively. The frequency of PWL3 was 40.73%. The target band of PWL1 could not be amplified from 329 strains， confirming that the PWL1 gene was completely deleted in the rice blast fungi tested. Sequencing analysis of the PCR products of some strains showed that the main mutations of PWL2， PWL3 and PWL4 genes in physiological races of rice blast in Heilongjiang were point mutations with abundant mutation sites leading to amino acid mutations.

Key words Heilongjiang province; Magnaporthe oryzae; PWL gene family

稻瘟病菌Magnaporthe oryzae B.Couch引起的稻瘟病是世界水稻生產(chǎn)中最具有毀滅性的病害之一[1-2]，稻瘟病菌變異快，導(dǎo)致抗病品種應(yīng)用3～5年后便“喪失”抗性，變?yōu)楦叨鹊母胁∑贩N。稻瘟病系統(tǒng)是一個(gè)經(jīng)典的基因?qū)蛳到y(tǒng)[3]，只有在稻瘟病菌的無(wú)毒基因與寄主的抗性基因相互作用時(shí)，水稻品種才能表現(xiàn)出抗瘟性[4]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已有12個(gè)無(wú)毒基因被克隆，包括PWL2、PWL1、AVR-Pita、ACE1、Avr1-CO39、AvrPiz-t、AVR-Pia、AVR-Pii、AVR-Pik/kp/km、AVR-Pi9、PWL2D和AVR-Pib[5-14]。其中PWL1、PWL2屬于PWL基因家族，該家族包含4個(gè)成員，PWL1、PWL2、PWL3和PWL4[6]。PWL2是最早被克隆的稻瘟病菌無(wú)毒基因[5]，有很強(qiáng)的寄主特異性。PWL1來(lái)源于龍爪稷病原菌WGG-FA40，也有寄主特異性，氨基酸序列與PWL2有75%相似[5]。PWL3和PWL4在正常情況下是沒(méi)有功能的，分別與PWL2有51%和57%的同源性，PWL4要在PWL1或PWL2的啟動(dòng)子啟動(dòng)下才會(huì)表現(xiàn)出阻止侵染畫(huà)眉草的功能。而PWL3在彎葉畫(huà)眉草中無(wú)毒功能喪失。PWL家族編碼的蛋白有以下共同特征：末端甘氨酸序列具有真核生物序列的共同特征，均是親水性蛋白且甘氨酸位點(diǎn)在整個(gè)蛋白中均勻分布。穆慧敏等[15]對(duì)PWL1、PWL2、PWL3和PWL4進(jìn)行分布與變異的分析，結(jié)果顯示PWL家族的主要變異為缺失，并且具有豐富的擴(kuò)增多態(tài)性;張崎峰等[16]對(duì)2006年黑龍江省19個(gè)稻區(qū)204個(gè)稻瘟病菌菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示PWL2出現(xiàn)頻率為52.94%，PWL3出現(xiàn)頻率為0。張科等[17]對(duì)2015年黑龍江省7塊田中采集的124個(gè)稻瘟病菌菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果表明PWL2出現(xiàn)頻率為72.8%，PWL3出現(xiàn)頻率為66.7%。本研究結(jié)合PWL家族的基因擴(kuò)增與測(cè)序結(jié)果，對(duì)黑龍江省2016年及2017年不同稻區(qū)的水稻稻瘟病菌進(jìn)行分析，研究不同菌株中PWL家族的分布與變異情況。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2016年和2017年在黑龍江省10個(gè)市19個(gè)縣水稻種植區(qū)內(nèi)采集稻瘟病穗頸瘟標(biāo)樣，經(jīng)單孢分離獲得單孢菌株329個(gè)（2016年127個(gè)菌株，2017年202個(gè)菌株）（表1）。

1.2 稻瘟病菌基因組DNA提取

將分離的稻瘟病菌單孢菌株于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取適量菌絲塊放在酵母液體培養(yǎng)基中，于28℃搖床，120 r/min 振蕩3～5 d，將菌絲體分別置于1.5 mL離心管中，使用真菌DNA提取試劑盒（D3390-01 Omega Bio-Tek公司）提取稻瘟病菌基因組DNA，微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，并將DNA原液稀釋成60 ng/μL的工作液備用。

1.3 引物設(shè)計(jì)

于NCBI上查找PWL1、PWL2、PWL3基因序列，在CDS區(qū)設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，PWL4引物序列參照穆慧敏等[15]的CDS區(qū)序列。4對(duì)序列均委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成（表2）。

1.4 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：rTaq酶0.1 μL，dNTPs 1.6 μL（各2.5 mmol/L），10×Buffer（Mg+）2.0 μL，正反向引物各0.3 μL，DNA模板1 μL，超純水補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性45 s，55～60℃退火45 s，72℃延伸30～90 s，32個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存待檢測(cè)。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳150 V，20 min，電泳液為 0.5×TBE，在電泳成像系統(tǒng)下拍照并統(tǒng)計(jì)無(wú)毒基因出現(xiàn)頻率。

1.5 無(wú)毒基因的基因序列測(cè)序分析

在黑龍江省2016年和2017年的稻瘟病菌菌株中挑選包含所有地區(qū)的部分菌株（60株）送上海生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAMAN軟件對(duì)核苷酸的序列進(jìn)行比對(duì)分析，并通過(guò)MEGA7軟件對(duì)PWL家族構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以確認(rèn)變異類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 PWL家族在黑龍江省稻瘟病菌生理小種中的分布

以水稻稻瘟病菌329個(gè)菌株的DNA為模板，根據(jù)PWL家族序列設(shè)計(jì)的引物（表2）來(lái)進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖1）。結(jié)果顯示，PWL1在所有供試DNA中均未檢測(cè)到目的片段，頻率為0;PWL2在243個(gè)DNA中檢測(cè)出目的片段，出現(xiàn)頻率為73.86%;PWL3在134個(gè)菌株DNA中擴(kuò)增出目的條帶，出現(xiàn)頻率為40.73%;PWL4在241個(gè)DNA中檢測(cè)到目的條帶，出現(xiàn)頻率為73.25%（表3）。

2.2 PWL家族基因的序列分析

2.2.1 PWL2基因的序列分析

從243個(gè)擴(kuò)增出目的條帶的菌株中挑選涵蓋所有地區(qū)的20個(gè)菌株測(cè)序。將測(cè)序的PWL2序列與已克隆的PWL2序列比對(duì)，結(jié)果顯示，20個(gè)菌株的PWL2堿基序列可分為5類，第一類與已克隆的PWL2基因序列完全一致;第二類與已克隆的基因序列比對(duì)有1處差異，即268（A/G），本試驗(yàn)將該種類命名為PWL2-1;第三類與已克隆的序列比對(duì)有4處差異，即64（T/G）、65 T（插入）、268（A/G）、398（T/G），將該類命名為PWL2-2;第四類與已克隆的序列比對(duì)有3處差異，即142（T/A）、143 T（插入）、268（A/G），本試驗(yàn)將其命名為PWL2-3;第五類與已克隆的序列比對(duì)差異較大，有16處差異，52（G/T）、65 T（插入）、99 C （缺失）、107（G/A）、108（G/A）、150（G/T）、151（A/T）、152（A/T）、154 G（插入）、220（T/A）、221 C（插入）、223（T/C）、224（T/C）、225（A/G）、228（A/G）、229 A（插入），將該類命名為PWL2-4（圖2）。

PWL2的5類堿基所翻譯氨基酸與已克隆的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖3，PWL2-1序列存在一處錯(cuò)義突變，即90（Y/D）;而PWL2-2與PWL2-4均在22位處開(kāi)始出現(xiàn)突變，PWL2-3在49位處出現(xiàn)突變，PWL2-2、PWL2-3、PWL2-4均導(dǎo)致翻譯提前終止。

2.2.2 PWL3基因的序列分析

從134個(gè)擴(kuò)增出目的條帶的菌株中挑選涵蓋所有地區(qū)的20個(gè)菌株測(cè)序。將測(cè)序得到的PWL3與已克隆的PWL3序列比對(duì)。結(jié)果顯示，20個(gè)菌株的PWL3堿基序列可分為5類，一類為與已克隆的PWL3基因序列完全一致;其他4類其差異主要體現(xiàn)在305 T（缺失）、367（A/G）、404（C/A）、412（A/C）、413（T/G）和415（G/C）。其中有堿基的差異和上述6處差異相同，本試驗(yàn)命名為PWL3-1;第三類與PWL3-1相比在167位處增加了堿基C的插入，本試驗(yàn)將其命名為PWL3-2;第四類與PWL3-1相比又增加了6處差異，即155 A（插入）、161 G（插入）、162 A（插入）、163（C/A）、167 C（插入）和184 C（插入），本研究將其命名為PWL3-3;第五類與PWL3-1相比又多有4處差異，即155 A（插入）、162 A（插入）、163（C/A）、167 C（插入），本試驗(yàn)命名為PWL3-4（圖4）。

PWL3的5類堿基序列所翻譯氨基酸與已克隆的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖5，PWL3-1在101位處出現(xiàn)移碼突變導(dǎo)致后面氨基酸發(fā)生變化;PWL3-2在57位處發(fā)生突變導(dǎo)致后面均發(fā)生變化;PWL3-3在52位處發(fā)生移碼變異導(dǎo)致后面氨基酸均發(fā)生變化;PWL3-4氨基酸在52位處發(fā)生移碼突變，但在57位處發(fā)生同義突變，在101位處再次發(fā)生移碼突變導(dǎo)致后面氨基酸均發(fā)生變化。

2.2.3 PWL4基因的序列分析

從241個(gè)擴(kuò)增出目的條帶的菌株中挑選涵蓋所有地區(qū)的菌株20個(gè)送去測(cè)序。將測(cè)序得到的PWL4與已克隆的PWL4序列比對(duì)。結(jié)果顯示，20個(gè)菌株的PWL4堿基序列可分為3種類型，且與已克隆的PWL4基因序列均有多處差異，其主要差異有42處，其中第一類與這42處差異相同，本試驗(yàn)命名為PWL4-1;第二類與PWL4-1相比除了42處共同差異外又增加了一處，即在54位處堿基G的缺失，本試驗(yàn)命名為PWL4-2;第三類與PWL4-2相比增加了一處變異，即在58位處堿基C的缺失，本試驗(yàn)命名為PWL4-3（圖6）。

PWL4的3類堿基所翻譯氨基酸與已克隆的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖7，PWL4-1、PWL4-2和PWL4-3氨基酸序列均在18位處發(fā)生移碼突變導(dǎo)致后面氨基酸發(fā)生變化。

2.3 PWL家族進(jìn)化分析

黑龍江省稻瘟病菌PWL家族變異類型的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，15個(gè)基因型共分為2大支系，一個(gè)支系為PWL1、PWL2、PWL2-1、PWL2-2、PWL2-3、PWL2-4，其親緣關(guān)系較近;另一個(gè)支系為PWL3、PWL3-1、PWL3-2、PWL3-3、PWL3-4、PWL4、PWL4-1、PWL4-2、PWL4-3。其中PWL3與PWL4-1、PWL4-2、PWL4-3的親緣關(guān)系要近于PWL4（圖8）。

3 討論

探索無(wú)毒基因在自然菌株群體中的分布，可以了解稻瘟病菌群體中菌株的組成及變異特點(diǎn)[18]。本研究通過(guò)對(duì)329個(gè)單孢菌株DNA進(jìn)行PWL家族的PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，PWL1在329個(gè)菌株中均未檢測(cè)出目的條帶，與穆慧敏等[15]研究結(jié)果一致，PWL1僅存在于牛筋草來(lái)源的稻瘟菌菌株中，而在分離于水稻的稻瘟病菌中表現(xiàn)為完全缺失;PWL2出現(xiàn)頻率為73.86%，且在黑龍江省各稻區(qū)均有分布;PWL3出現(xiàn)頻率相對(duì)較低，為40.73%;PWL4在黑龍江省各地區(qū)也都有分布，出現(xiàn)頻率為73.25%。

病原菌無(wú)毒基因不穩(wěn)定，常常引發(fā)變異，變異機(jī)制主要包括缺失、插入、點(diǎn)突變、復(fù)制、移碼突變等[19]。據(jù)報(bào)道PWL家族旁側(cè)序列的DNA重結(jié)合常導(dǎo)致PWL基因的異位、缺失、復(fù)制或倒位[6]。因此，PWL 家族的基因序列經(jīng)常發(fā)生變異。穆慧敏等[15]采用12對(duì)特異性引物對(duì)來(lái)源于水稻的28株菌株檢測(cè)到PWL2、PWL3和PWL4基因18種類型;余歡等[20]研究發(fā)現(xiàn)PWL2基因上游出現(xiàn)多位點(diǎn)現(xiàn)象，PWL3基因上游出現(xiàn)插入類型，PWL4基因上游和下游區(qū)域出現(xiàn)了部分缺失。本試驗(yàn)主要針對(duì)PWL家族基因的編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增與序列比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PWL2檢測(cè)出5種基因型（2、2-1、2-2、2-3、2-4）;PWL3也檢測(cè)出5種基因型（3、3-1、3-2、3-3、3-4）;PWL4檢測(cè)到4種基因型（4、4-1、4-2、4-3）。研究結(jié)果表明PWL 家族基因編碼區(qū)的主要變異類型為點(diǎn)突變，且變異位點(diǎn)豐富。但新變異類型能否影響無(wú)毒功能的喪失還需進(jìn)行致病性的測(cè)定來(lái)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] COUCH B C， KOHN L M. A multilocus gene genealogy concordant with host preference indicates segregation of a new species， Magnaporthe oryzae， from M.grisea [J]. Mycologia， 2002， 94（4）： 683-693.

[2] OU S H. Rice diseases [M]. Kew Commonwealth Mycological Institute， 1985.

[3] FLOR H H. Current status of the gene-for-gene concept [J]. Annual Review of Phytopathology， 1971， 9（1）： 275-296.

[4] LIU Wende， ZHOU Xiaoying， LI Guotian， et al. Multiple plant surface signals are sensed by different mechanisms in the rice blast fungus for appressorium formation [J/OL]. PLoS Pathogens， 2011， 7（1）： e1001261. DOI： 10.1371/journal.ppat.1001261.

[5] SWEIGARD J A，CARROLL A M，KANG S，et al. Identification， cloning， and characterization of PWL2， a gene for host species specificity in the rice blast fungus [J]. Plant Cell， 1995， 7（8）：1221-1233.

[6] KANG S. The PWL host specificity gene family in the blast fungus Magnaporthe grisea [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 1995， 8（6）：939-948.

[7] ORBACH M J， FARRALL L， SWEIGARD J A， et al.A telomericavirulence gene determines efficacy for the rice blast resistance gene Pi-ta [J]. The Plant Cell， 2000， 12（11）： 2019-2032.

[8] COLLEMARE J， PIANFETTI M， HOULLE A E， et al. Magnaporthe grisea avirulence gene ACE1 belongs to an infection-specific gene cluster involved in secondary metabolism [J]. New Phytologist， 2010， 179（1）： 196-208.

[9] FARMAN M L， LEONG S A. Chromosome walking to the AVR1-CO39 avirulencegene of Magnaporthe grisea： discrepancy between the physical and genetic maps [J]. Genetics， 1998， 150（3）： 1049-1058.

[10]LI Wei， WANG Baohua， WU Jun， et al.The Magnaporthe oryzae avirulence gene AvrPiz-t encodes a predicted secreted protein that triggers the immunity in rice mediated by the blast resistance gene Piz-t [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2009， 22（4）： 411-420.

[11]YOSHIDA K， SAITOH H， FUJISAWA S， et al. Association genetics reveals three novel avirulence genes from the rice blast fungal pathogen Magnaporthe oryzae [J]. The Plant Cell， 2009， 21（5）： 1573-1591.

[12]WU Jun， KOU Yanjun， BAO Jiandong， et al. Comparative genomics identifies the Magnaporthe oryzae avirulence effector Avr-Pi9 that triggers Pi9-mediated blast resistance in rice [J].New Phytologist， 2015， 206（4）： 1463-1475.

[13]SCHNEIDER D R， SARAIVA A M， AZZONI A R， et al.Overexpression and purification of PWL2D， a mutant of the effector protein PWL2 from Magnaporthe grisea [J]. Protein Expression and Purification， 2010， 74（1）： 24-31.

[14]ZHANG Shulin， WANG Ling， WU Weihuai， et al. Function and evolution of Magnaporthe oryzae avirulence gene Avr-Pib responding to the rice blast resistance gene Pib [J/OL]. Scientific Reports， 2015， 5： 11642.DOI：10.1038/srep11642.

[15]穆慧敏， 姜華， 毛雪琴， 等. PWL基因家族在稻瘟病菌中的分布及變異初探[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 25（3）： 526-532.

[16]張崎峰， 靳學(xué)慧， 蔡鑫鑫， 等.黑龍江省稻瘟病菌無(wú)毒基因的檢測(cè)[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（12）： 70-74.

[17]張科， 劉麗， 韓俊楠， 等.黑龍江省稻瘟病菌無(wú)毒基因的組成及其頻率初析[J].種子世界， 2016（12）： 19-21.

[18]田妍， 李承夏， 邢俊杰.水稻稻瘟菌無(wú)毒基因研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013， 39（S1）： 74-79.

[19]姜華， 余歡， 王艷麗， 等. 稻瘟病菌無(wú)毒基因序列變異研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2015， 27（3）： 512-520.

[20]余歡， 姜華， 王艷麗， 等. 無(wú)毒基因在不同寄主梨孢菌中的變異研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2015， 27（8）：1414-1421.

（責(zé)任編輯：田 喆）