李潤(rùn)根 盧其能 何咪

摘要 假短孢彎孢Curvularia pseudobrachyspora是我國(guó)新記錄種，首次在龍牙百合貯藏期腐爛鱗莖上發(fā)現(xiàn)，并能引起龍牙百合葉斑病。為明確其生物學(xué)特性及其對(duì)藥劑的敏感性，研究了不同碳源、氮源、pH、光照、溫度等處理對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響，并采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定該病原菌對(duì)9種殺菌劑的敏感性。研究表明，最適合菌絲生長(zhǎng)的碳源為麥芽糖和木糖，氮源為牛肉浸膏，pH為7.0～8.0，最適溫度為30℃，致死溫度為52℃，黑暗條件有利于菌絲生長(zhǎng)，病原菌可以侵染馬鈴薯、甘薯、薺菜，不能侵染蒜、蔥。在9種參試殺菌劑中，1%申嗪霉素SC對(duì)該病原菌的毒力最高，相應(yīng)的抑制中濃度EC50為0.012 mg/L;68%精甲霜·錳鋅WG的毒力最低，EC50為15.820 mg/L。

關(guān)鍵詞 百合; 假短孢彎孢; 形態(tài)特征; 生物學(xué)特性; 藥劑敏感性

中圖分類號(hào)： S 436.44

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019414

Abstract Curvularia pseudobrachyspora is a new record in China. It was found for the first time on the rotten bulbs of Longya lily during storage and could cause the leaf spot of Lilium brownii var. viridulum. The biological responses of the pathogen to different carbon sources， nitrogen sources， pH and light treatments were also studied. The results showed that the most suitable carbon sources were xylose and maltose; the most suitable nitrogen source was beef extract; the optimum temperature for the mycelium growth was 30℃，and the mycelium lethal temperature was 52℃; the optimum pH for the mycelium growth was 7.0-8.0， and the suitable light condition for the mycelium growth was 24 h dark. The sensitivity of the pathogen to nine fungicides was tested， and the results showed that the inhibitory effects of six fungicides on the mycelium growth of the pathogen were significant. The fungicide shenqinmycin 1% SC had the strongest inhibitory effect among the fungicides tested， with an EC50 value of 0.012 mg/L. The fungicide metalaxyl-M·mancozeb 68% WG had the minimum inhibitory effect， with an EC50 value of 15.820 mg/L.

Key words Lilium brownii var. viridulum; Curvularia pseudobrachyspora; morphological characters; biological characteristics; sensitivity to fungicide

百合Lilium spp.在中國(guó)栽培歷史悠久，其具有作為花卉的觀賞價(jià)值，而地下鱗莖又可食用，營(yíng)養(yǎng)豐富，藥用價(jià)值突出，屬藥、食兼用型植物，因此有著很高的開發(fā)利用價(jià)值[1]。龍牙百合是我國(guó)三大食用百合之一，在江西、湖南、廣西等地廣泛栽種，取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益。但是龍牙百合是一種較易感病的作物，特別是連作時(shí)病害嚴(yán)重。隨著龍牙百合栽培面積的不斷擴(kuò)大，病害發(fā)生越來(lái)越多，已經(jīng)成為百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要問(wèn)題之一[2]。已有報(bào)道，江西田間百合種植的主要病害有鐮孢枯萎病、疫病、灰霉病、炭疽病、病毒病和葉斑病等26種[3]。

百合葉斑病為百合葉點(diǎn)霉Phyllosticta lilicola Saccarda引起[3]，截至2017年尚未見彎孢屬真菌引起百合葉斑病的相關(guān)報(bào)道。2017年，假短孢彎孢Curvularia pseudobrachyspora最先在泰國(guó)的牛筋草Eleusine indica上被發(fā)現(xiàn)[4];2018年，筆者在龍牙百合貯藏期腐爛鱗莖上發(fā)現(xiàn)該彎孢菌，并證明它能引起龍牙百合鱗莖腐爛和葉斑病[5]，是我國(guó)新記錄種，NCBI登錄號(hào)分別為：MH819562（ITS1/4）、MH822836（TEF1-α：EF1-983F/EF1-2218R）、MH822837 （GAPDH）、MN061051（LSU：LROR/LR5）和MN061045（18S：NS1/NS4）。為進(jìn)一步掌握假短孢彎孢的生物學(xué)特性和室內(nèi)篩選適宜的防治藥劑，為有效防治百合葉斑病提供理論基礎(chǔ)，特進(jìn)行本試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌假短孢彎孢C.pseudobrachyspora為本實(shí)驗(yàn)室于2017年10月分離自江西省萬(wàn)載縣高城鎮(zhèn)綠泉合作社冷庫(kù)（0～4℃）貯藏的龍牙百合Lilium brownii var. viridulum的腐爛鱗莖，病原菌已進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子鑒定。

室內(nèi)抑菌試驗(yàn)供試藥劑及生產(chǎn)廠家見表1。

1.2 假短孢彎孢形態(tài)特征觀察

將分離純化獲得的菌株轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）上，置于25℃培養(yǎng)7 d。觀察菌落整體形態(tài)特征，并挑取生長(zhǎng)旺盛的菌絲制成玻片，在顯微鏡下觀察分生孢子和分生孢子梗形狀，測(cè)量孢子大小，觀察產(chǎn)孢量和產(chǎn)孢特性;采用常規(guī)的玻片培養(yǎng)法，25℃下培養(yǎng)7 d，觀察并記錄分生孢子的著生狀態(tài)并拍照。

1.3 假短孢彎孢生物學(xué)特性

1.3.1 病原菌生長(zhǎng)溫度和pH測(cè)定

將直徑5 mm的病原菌菌塊接種到馬鈴薯蔗糖瓊脂（potato saccharose agar，PSA）平板培養(yǎng)基中央，設(shè)置5、10、15、20、25、30、35、40℃等8個(gè)不同培養(yǎng)溫度處理。以PSA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用0.1%的NaOH和HCl溶液調(diào)配pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)。

1.3.2 光照對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

將直徑5 mm的病原菌菌塊接種到PSA平板中央，25℃培養(yǎng)，光照條件分別為連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、L∥D=12 h∥12 h光暗交替和自然光照。

1.3.3 適宜病原菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基碳、氮源篩選

以查氏（Czapek）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以KNO3為氮源，碳源總質(zhì)量濃度為12.63 g/L，選擇6種不同的碳源：乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉，用不加碳源作對(duì)照。以蔗糖為碳源，氮源總質(zhì)量濃度為0.33 g/L，選擇11種不同的氮源：硝酸鈉、精氨酸、酵母浸膏、氯化銨、天冬酰胺、硝酸銨、硝酸鉀、尿素、硫酸銨、牛肉浸膏、蛋白胨，以無(wú)氮源培養(yǎng)基為對(duì)照。兩種處理均25℃培養(yǎng)。

1.3.4 病菌致死溫度測(cè)定

將直徑5 mm的病原菌菌塊放置于裝有1 mL無(wú)菌水的滅菌離心管中，分別置于45～75℃（設(shè)置梯度5℃）的恒溫水浴中處理10 min（先預(yù)熱1 min）后取出迅速冷卻。將處理過(guò)的菌塊置于PSA平板培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d。先以相隔5℃梯度確定致死溫度范圍，然后相隔1℃設(shè)置梯度重復(fù)以上試驗(yàn)，確定菌絲致死溫度。

1.3.5 病原菌對(duì)不同作物的致病性

取自大田的馬鈴薯、薺菜、甘薯、蒜、蔥等作物的健康葉片，用流水沖洗后，70%乙醇消毒30 s，再用2%次氯酸鈉消毒5 min，切取適宜長(zhǎng)度用無(wú)菌濾紙吸干水分，放在事先滅過(guò)菌的墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，背面朝上，每皿放3片，保濕培養(yǎng)，將菌餅接種在葉片背面，以接種無(wú)菌PSA塊為對(duì)照，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察葉片被浸染的情況。

所有處理均設(shè)4次重復(fù)。

1.4 假短孢彎孢對(duì)殺菌劑的敏感性

選用9種藥劑（表1）對(duì)病原菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，采用菌絲生長(zhǎng)法測(cè)定其對(duì)龍牙百合葉斑病病原菌的抑制作用。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)后，對(duì)假短孢彎孢菌絲生長(zhǎng)抑制率在5%～95%范圍內(nèi)的6個(gè)質(zhì)量濃度（精甲霜·錳鋅稀釋1 000、10 000、50 000、100 000、200 000、500 000倍;己唑醇、唑醚·啶酰菌、肟菌·戊唑醇、咪鮮胺錳鹽、腈菌唑、嘧菌酯稀釋1 000、10 000、50 000、200 000、400 000、1 000 000倍;申嗪霉素、抑霉唑稀釋50 000、100 000、200 000、500 000、1 000 000、2 000 000倍），制作含藥介質(zhì)培養(yǎng)基，藥劑需要在培養(yǎng)基冷卻至55℃以下時(shí)加入。將5 mm菌餅接種到含殺菌劑的平板中央，每處理重復(fù)3次，以加入滅菌蒸餾水的培養(yǎng)基平板為對(duì)照，于25℃下倒置培養(yǎng)，對(duì)照處理的菌絲生長(zhǎng)直徑大于70 mm后，量取各平板中菌落的直徑，計(jì)算抑菌率。將抑菌率換算為幾率值、藥劑濃度換算為對(duì)數(shù)值進(jìn)行計(jì)算[6-7];利用SPSS 22.0軟件求出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 假短孢彎孢形態(tài)特征

菌落在PDA平板上呈圓形，中央隆起，初期鋪展生長(zhǎng)，顏色為灰色、淡褐色或墨綠色，邊緣和表面一層的菌絲為灰白色;菌落絨狀，生長(zhǎng)較快，7～8 d幾乎長(zhǎng)滿直徑90 mm的培養(yǎng)皿（圖1a、b）。后期菌絲形成黑色傘形子座（圖1e、f）。分生孢子梗褐色有隔膜， 單生或分支， 頂端直或彎曲。分生孢子2～5個(gè)簇生（圖1c、d），淡褐色或深褐色，具有3～4個(gè)隔膜，孢子大小和顏色不均勻，中間兩個(gè)細(xì)胞膨大且顏色較深，兩端兩個(gè)細(xì)胞較小且顏色淺，從基部向上數(shù)第3個(gè)細(xì)胞最大，顏色最深，向一側(cè)明顯彎曲。分生孢子形態(tài)多樣，有彎曲、不對(duì)稱的彎月狀，直短棒狀，梨形等，分生孢子大小為21.70（13.66～28.32）μm×9.94（5.72～15.00）μm（圖1g）。

2.2 假短孢彎孢生物學(xué)特性

不同溫度對(duì)假短孢彎孢菌絲生長(zhǎng)的影響具有一定的差異（圖2a）。病原菌在10～40℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，在20～30℃下生長(zhǎng)最快，在40℃時(shí)生長(zhǎng)極為緩慢，溫度低于5℃時(shí)菌落幾乎停止生長(zhǎng)。

在7種pH環(huán)境下菌絲均可生長(zhǎng)，但在不同pH條件下生長(zhǎng)速度不同，其中pH為7.0和8.0時(shí)最利于菌絲生長(zhǎng)（圖2b）。

在供試的7種碳源上菌絲均可生長(zhǎng)，但在不同碳源上生長(zhǎng)速度不同，其中木糖和麥芽糖最利于菌絲生長(zhǎng)（表2）。

與不加氮源的對(duì)照相比，各供試氮源除硫酸銨外其他氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)均具有顯著促進(jìn)作用（表3），7 d時(shí)各不同氮源下的菌落直徑的大小排序依次為：牛肉浸膏>蛋白胨>精氨酸>尿素>硝酸鈉>硝酸鉀>酵母浸膏>天冬酰胺>氯化銨>硝酸銨>硫酸銨>無(wú)氮源對(duì)照，以牛肉浸膏為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，以硫酸銨為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)最慢。在無(wú)氮源條件下病原菌雖然能生長(zhǎng)但菌絲很稀疏，需要在透射光下才可看見。

不同光照條件下假短孢彎孢菌絲生長(zhǎng)有些差異，黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)較好，優(yōu)于其他條件，但與光暗交替條件下菌絲的生長(zhǎng)差異不顯著（表3）。

假短孢彎孢菌株在溫度45～50℃經(jīng)10 min處理的菌絲在PSA培養(yǎng)基上均能繼續(xù)生長(zhǎng)，但在52℃ 10 min和53℃ 10 min處理的菌絲不再生長(zhǎng)。表明該菌菌絲的致死溫度是52℃，10 min。

另外，病原菌菌塊接種至馬鈴薯等其他5種植物的葉片后，第7天觀察到馬鈴薯、薺菜的葉片上菌絲生長(zhǎng)較旺盛，幾乎長(zhǎng)滿葉片，接種葉片呈水浸狀，顯示其可以侵染馬鈴薯、薺菜;甘薯葉片上的菌絲較少，但葉片出現(xiàn)失綠變褐呈水浸狀，而對(duì)照組葉片無(wú)明顯變化，因此認(rèn)為此病原菌可侵染甘薯，但不侵染蒜和蔥（圖3）。

2.3 假短孢彎孢對(duì)殺菌劑敏感性

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，9種藥劑對(duì)假短孢彎孢菌株均有一定的抑制作用。根據(jù)殺菌劑濃度與病原菌菌絲生長(zhǎng)程度相關(guān)的回歸方程可知，隨著殺菌劑濃度的增加抑制作用增強(qiáng)。根據(jù)EC50可知，不同

藥劑之間的抑制作用差異較大。其中1%申嗪霉素SC抑制作用最強(qiáng)，EC50為0.012 mg/L;其次是20%抑霉唑EW，EC50為0.190 mg/L;再次是38%唑醚·啶酰菌WG，EC50為0.277 mg/L;68%精甲霜·錳鋅WG的效果最差，EC50為15.820 mg/L（表3）。

由毒力回歸方程可知，1%申嗪霉素SC斜率值最大，68%精甲霜·錳鋅WG其次，250 g/L嘧菌酯SC斜率值最小，說(shuō)明假短孢彎孢對(duì)申嗪霉素最敏感，對(duì)精甲霜·錳鋅較敏感，而對(duì)嘧菌酯最不敏感（表3）。

取殺菌劑稀釋50 000倍時(shí)的抑菌率進(jìn)行方差分析。結(jié)果顯示，1%申嗪霉素SC和20%抑霉唑EW的抑菌率分別為99.3%和92.3%，兩者有顯著差異，且均極顯著高于其他藥劑。38%唑醚·啶酰菌WG、50%咪鮮胺錳鹽WP、30%己唑醇SC、75%肟菌·戊唑醇WG抑菌效果較好，抑菌率都大于等于70%。40%腈菌唑WP、68%精甲霜·錳鋅WG、250 g/L嘧菌酯SC抑菌效果一般，抑菌率在50%以上;嘧菌酯和精甲霜·錳鋅抑菌效果差，極顯著低于其他藥劑（表3）。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)中的病原菌假短孢彎孢與Marin-Felix等[4]研究的病原在形態(tài)學(xué)上相近，但分生孢子稍小，子座與黃微等[8]報(bào)道的彎孢菌的相同。

研究病原菌的生物學(xué)特性對(duì)掌握病害的發(fā)生規(guī)律和提出防治措施具有非常重要的意義。在對(duì)百合假短孢彎孢的生物學(xué)特性進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在 PSA 培養(yǎng)基上 30℃ 培養(yǎng)時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率大于10 mm/d，因此百合栽培時(shí)要在溫暖季節(jié)及時(shí)防治該病菌。該菌在含有硫酸銨的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，有研究表明，百合枯萎病菌Fusarium proliferatum[9]、F.oxysporum[10]和高粱附球菌Epicoccum sorghinum[11]都有類似結(jié)果，硫酸銨又屬生理性酸性肥料，本研究也表明，pH為4.0時(shí)不利于該菌菌絲生長(zhǎng)，生產(chǎn)上施用硫酸銨是否能緩解其發(fā)病以及偏酸性土壤能否減輕龍牙百合栽培病害等均有待進(jìn)一步研究。

目前已報(bào)道的彎孢菌屬病原菌主要是新月彎孢Curvularia lunata，該菌是一種單子葉作物的兼性病原菌，引起玉米葉斑病、高粱葉枯病、大麻葉斑病、甘蔗幼苗枯萎病[12]、水稻葉斑病[13]、溫郁金葉斑病[14]，也有報(bào)道引起辣椒葉斑病[15]、再力花葉枯病[16]等。假短孢彎孢是我國(guó)新記錄種，試驗(yàn)表明，該菌不僅侵染百合（單子葉作物），還能侵染馬鈴薯、甘薯、薺菜等雙子葉作物，對(duì)其他作物致病情況有待進(jìn)一步研究。

菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定結(jié)果表明，選用的9種殺菌劑對(duì)假短孢彎孢菌絲生長(zhǎng)都有一定的抑制作用。1%申嗪霉素SC在EC50、毒力回歸方程斜率和抑菌率等方面均表現(xiàn)效果最好，徐輝[13]在水稻彎孢葉斑病防治試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)申嗪霉素防效較好，申嗪霉素是由熒光假單胞菌M18經(jīng)生物培養(yǎng)分泌的一種抗菌素，具有廣譜、高效、安全的特點(diǎn)，能有效控制真菌性根腐和莖腐，其作為一種新型微生物源綠色農(nóng)藥，對(duì)百合鐮刀菌枯萎病[9]、百合米根霉腐爛病[17]等均防效良好，推薦百合生產(chǎn)中選用;咪鮮胺錳鹽對(duì)于彎孢霉的抑菌效果較好，與黃嫻等[18]對(duì)溫郁金彎孢霉葉枯病病原菌的藥劑篩選結(jié)果相似。本試驗(yàn)也首次得出申嗪霉素和抑霉唑?qū)τ趶濇呔哂休^好的抑制作用。室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果只能說(shuō)明該殺菌劑在室內(nèi)離體條件下對(duì)百合假短孢彎孢有一定的殺菌活性，而田間防治效果受很多因素的影響，因此在應(yīng)用于大田防治前還需進(jìn)一步的田間試驗(yàn)證實(shí)其效果。

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（責(zé)任編輯：田 喆）