蒲思思 周朝輝 賈能勤

摘要：癌癥死亡患者中有90%由癌癥轉(zhuǎn)移引起，研究表明：患者的外周血、胸腔液等體液中的循環(huán)腫瘤細胞（CTC）與癌癥轉(zhuǎn)移及腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期密切相關(guān).因此，CTC檢測在實體腫瘤前期診斷、預后及療效評估等方面扮演著舉足輕重的角色，該綜述基于CTC區(qū)別于正常細胞的物理學、電學、生物學特征，總結(jié)了目前CTC分離富集及分析檢測技術(shù)的研究進展，并就國內(nèi)外CTC檢測面臨的挑戰(zhàn)進行了討論，對其未來發(fā)展趨勢進行了展望.

關(guān)鍵詞：循環(huán)腫瘤細胞（CTC）;CTC檢測;分離富集

中圖分類號：O6-1;R 730.4 文獻標志碼：A 文章編號：1000-5137（2020）02-0219-15

0引 言

在1869年，ASHWORTH[]首次報道了血液中存在與其患者腫瘤具有相同大小、形狀和外觀的上皮腫瘤細胞，即循環(huán)腫瘤細胞（CTC）.在實體腫瘤部位，腫瘤細胞發(fā)生上皮至間充質(zhì)的轉(zhuǎn)換（EMT），E-鈣黏連蛋白表達降低，腫瘤細胞脫離，隨后內(nèi)滲進入血管.多數(shù)CTC發(fā)生凋亡或被吞噬，只有不足0.01%的CTC可逃過人體自身免疫的捕殺，而腫瘤微栓子（CTM）的集體遷移及更高的存活率，使其更具有轉(zhuǎn)移和侵襲的潛力[2].CTC隨著循環(huán)系統(tǒng)到達遠端器官，再外滲出血管，找到合適的“土壤”，并發(fā)生黏附，進行間充質(zhì)至上皮的轉(zhuǎn)換（ MET），開始血管的生成及腫瘤細胞的增殖與生長，繼而發(fā)展成實體腫瘤，形成致死性轉(zhuǎn)移[3].擴散的腫瘤細胞甚至可以循環(huán)到骨髓中，并休眠于此，數(shù)年后，重新進入血液形成繼發(fā)性轉(zhuǎn)移[4].

目前，腫瘤診斷嚴重依賴于影像學檢測和組織切片，腫瘤細胞的脫落、侵襲并進入血液循環(huán)是實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，為最終形成腫瘤轉(zhuǎn)移病灶提供了可能，由此可見，CTC檢測對于癌癥的早期診斷，以及檢測患者的術(shù)后復發(fā)與轉(zhuǎn)移、評估療效與預后、選擇合適的個體化治療等方面具有重要的臨床意義，且能幫助理解CTC在外周血中的存活、吸附、侵襲等生物學行為，破譯腫瘤轉(zhuǎn)移的機制，通過綜述CTC富集技術(shù)及分析檢測技術(shù)，深入探討了CTC檢測的研究進展及其面臨的挑戰(zhàn)，并對未來發(fā)展趨勢做出展望.

1 CTC分離富集技術(shù)

1.1 物理特性富集法

1.1.1基于尺寸差異分離富集

“不死”腫瘤細胞的異常增殖，使其區(qū)別于正常細胞，具有較大的核質(zhì)比及細胞尺寸，且不同腫瘤細胞系的細胞平均直徑與白細胞直徑的比率不同[5].而白細胞和紅細胞等正常血液細胞的尺寸較腫瘤細胞小，紅細胞直徑約為4～8 um，白細胞尺寸約為6～19 um.該差異為基于細胞尺寸差異的無生物標記的分離富集提供可能，

基于尺寸的分離富集常采用8um孔徑的臨界尺寸（D），有效截留CTC，過濾除去尺寸較小的紅細胞、白細胞.2011年，TIBBE等;[6]在上皮腫瘤細胞過濾技術(shù)（ISET）平臺，采用氫氧化鈉刻蝕法制備具有8um孔徑的聚碳酸酯膜分選CTC，在4h內(nèi)成功分離肺癌患者外周血中的CTC和CTM.為避免ISET技術(shù)中孔不均勻密度分布的缺點[7]，具有體積小、易加工、無毒及易自動化優(yōu)勢的微小型裝置被廣泛研究，如新月形隔離微結(jié)構(gòu)的微裝置[8]、柔性微彈簧陣列裝置[9]、蛇紋通道的微裝置[10]等，實現(xiàn)了對CTC的高通量、高靈敏檢測.ZHENG等[11]采用濕法刻蝕設(shè)計了圓形孔（D=11 um）的聚對二甲苯膜微過濾器裝置，用于捕獲和電解人血液CTC，同時利用聚合酶鏈反應（PCR）進行基因組分析.除膜過濾，基于細胞尺寸差異捕獲的微流控芯片分離富集技術(shù)也廣受關(guān)注[12-14].如圖l所示，KIM等[15]通過離心處理血樣后，利用CAVl-EpCAM偶聯(lián)的微球，增大CTC與白細胞的尺寸差異，結(jié)合具有狹縫陣列的微流控芯片，自動化分離富集CTC.

基于細胞尺寸差異進行過濾富集CTC的技術(shù)避開了依賴于腫瘤細胞表面特異性抗原EpCAM的分離富集技術(shù)的局限，但在臨床應用中也有缺陷.COUMANS等[16]研究發(fā)現(xiàn)，從轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者、直腸癌患者、前列腺癌患者的全血中捕獲的CTC平均直徑為13.1，11.0，10.7 um，比相應腫瘤細胞系的細胞直徑小.PARK等[17]研究發(fā)現(xiàn)，相比于實驗室培養(yǎng)的前列腺癌（prostate）細胞（13.38+2.54 um），從前列腺癌患者外周血中分離出來的CTC具有更小的尺寸（7.97+1.81 um），并且形狀更細長，核質(zhì)比也更高，因此，腫瘤細胞尺寸及其形變能力的異質(zhì)性，使得基于細胞尺寸差異的分選方法具有較低的特異性及靈敏性，且過濾高濃度的顆粒物容易導致堵塞.

1.1.2密度梯度分離（DGC）

對于復雜的人類外周血，在每毫升約l07～109個血液細胞中，除了極少量的CTC以外，還有大量的紅細胞、中性粒細胞和單核細胞，其密度各有不同，紅細胞密度為1.10—1.15 g ·mL-1，白細胞密度為1.07—1.09 g·mL-1，而腫瘤細胞的密度相對白細胞較低，基于Stokes-Einstein公式，采用一定密度的等滲溶液，如Ficoll或Percoll細胞分離液，進行密度梯度離心，將目標細胞分離開來.

作為標準化的血液細胞分離方法，密度梯度離心雖操作簡單、成本低廉，但回收率低，且CTC純度低.GERTLER等[18]將新型密度梯度離心系統(tǒng)OriCoQuiCkTM與標準密度梯度離心系統(tǒng)Ficoll進行比較，發(fā)現(xiàn)改良的OncoQuickTM密度梯度離心系統(tǒng)，結(jié)合基于CTC尺寸差異分離方法，于離心管中放人多孔的過濾膜，從10 mL血液中分離出9.5 xl04個單核細胞，只需轉(zhuǎn)移到1～2個載玻片上進行免疫細胞化學評估，極大地減少了工作量，且提高了CTC檢出率.2004年，LARA等[19]研究者結(jié)合密度梯度離心、陰性磁分選及過濾法富集CTC.先密度梯度離心除去大量的紅細胞，再用免疫磁分選除去大量的白細胞，最后通過過濾法過濾得到目標細胞CTC，如圖2所示.該方法有效避免了腫瘤細胞的密度異質(zhì)性，將白細胞與腫瘤細胞成功地區(qū)分開來.

1.1.3介電泳場流分級分離（depFFF）

腫瘤細胞的特殊組成、形態(tài)及表型使其介電特性異于紅細胞、T淋巴細胞等血液細胞的介電性質(zhì).當腫瘤細胞與血液細胞暴露在交變電場中，會發(fā)生不同的極化現(xiàn)象，從而具有不同的電動效應，導致細胞出現(xiàn)區(qū)域分布，此時若再施加適當?shù)耐獠苛ΓǔＭㄟ^流體流動，洗除陰性細胞，便可截留下目標細胞，這樣的方法即是基于CTC介電異質(zhì)性分離富集CTC的介電泳場流分級分離.

1995年，BECKER等[20]采用17.6 mmX55.O mm電極陣列的depFFF腔室，如圖3所示，利用介電親和力成功分離MDA-231乳腺癌細胞，實現(xiàn)了95%以上的回收率.通過斷開電壓釋放被電泳力（DEP）截留的CTC，釋放的CTC細胞活性大于98%，并且對CTC的生長能力幾乎沒有影響.1997年，GASCOYNE等[21]細化并擴展了通過介電親和力進行細胞分選的原理，并得出了可以評估最佳細胞分選條件和效率的表達式.2009年，GASCOYNE等[22]設(shè)計了帶有3 000個相互交錯的銅金電極元件的depFFF腔室（0.6 mmx25 mmx300mm），實現(xiàn)了模擬小樣本的90%以上的腫瘤細胞回收率，并且能在15 min內(nèi)完成細胞分離.

基于腫瘤細胞介電特性，可以實現(xiàn)對腫瘤細胞不同亞型的分離，且不需要對細胞進行任何的修飾或處理，對CTC下游分析來說，這是關(guān)鍵且重要的.depFFF相比于磁分選，其分選效率、回收率都較高，通過該方法分離富集的未經(jīng)標記的活腫瘤細胞可用于培養(yǎng)，并進行所有分子類型的分析檢測.depFFF也可作為常規(guī)方法的輔助手段，以提高診斷和細胞分離應用的總體分辨率、速度和效率.

1.2親和性富集法

1.2.1磁分選富集技術(shù)

區(qū)別于正常細胞，腫瘤細胞表面會上調(diào)或下調(diào)相關(guān)抗原、蛋白質(zhì)表達量，如上皮腫瘤細胞表面的上皮細胞黏附分子（EpCAM）、乳腺癌細胞表面人類表皮生長因子受體2（HER2）、非小細胞肺癌細胞表面表皮生長因子受體（EGFR）等，而正常細胞表面低表達，甚至不表達.再如白細胞表面特異性表達白細胞共同抗原（如CD45抗原），則在腫瘤細胞中不表達.磁分選富集技術(shù)，即基于這樣的生物學特征，在具有超順磁性的顆粒表面偶聯(lián)特異性抗體，如抗一上皮細胞黏附分子（EpCAM抗體/anti-EpCAM）、靶向腫瘤細胞，在外加磁場的作用下，腫瘤細胞被吸引而滯留在磁場中，從而分離出目標細胞（陽性分選），或是通過抗白細胞共同抗原的CD45抗體移除血液中的白細胞、巨核細胞及血小板（陰性分選）.基于免疫學方法對CTC進行富集，具有極高的特異性.

唯一被美國食品藥品管理局（FDA）批準的CellSearchTM（ Veridex）半白動檢測系統(tǒng)，通過免疫鐵磁流體靶向CTC表面的EpCAM抗原，從全血中分選CTC，然后對CTC進行腫瘤標記染色并使用熒光顯微鏡計數(shù)，能可靠地檢測出血液中的CTC，適用于臨床實驗室對轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌患者的常規(guī)評估[23-24].且聯(lián)合抗一細胞角蛋白（CK抗體）、EpCAM抗體捕獲，能顯著提升CellSearch系統(tǒng)的靈敏度[24].此外，亦有多種技術(shù)平臺基于免疫磁分選技術(shù)富集CTC，如MagSweeper[25]、磁激活細胞分選技術(shù)（ MACS）[26].除了anti-EpCAM特異性識別分子，周朝輝等[27]設(shè)計了anti-EGFR抗體偶聯(lián)的免疫磁珠，結(jié)合磁分選技術(shù)與免疫熒光技術(shù)實現(xiàn)了對非小型肺癌細胞A549的檢測，

以上方法均在體外捕獲CTC，2008年哈佛醫(yī)學院的VERMESH等[28]開發(fā)了柔性磁力“魚線”（MagWIRE），希望能直接在患者靜脈血管中富集CTC，如圖4所示，他們選擇在活豬的耳靜脈血管中模擬“磁釣”癌細胞，MagWIRE成功捕獲了循環(huán)腫瘤細胞，并且回收了34%的免疫磁珠，該“磁釣”CTC的回收率是體外磁分選CTC的10～80倍.

中國科學院國家納米科學中心研究院PENG等[29-31]開發(fā)了擁有獨立知識產(chǎn)權(quán)的新技術(shù)“腫瘤捕手”，通過篩選特異性多肽，并巧妙地組裝到納米磁珠表面，克服了抗體磁珠的位點少、方向性差、靶向性差的缺點，實現(xiàn)了在模擬血液中大于80%的CTC捕獲率，而傳統(tǒng)的抗體磁珠捕獲率僅在30%左右.2015年，中國科學院HUANG等[32]以免疫活細胞為生物模板，并結(jié)合表面化學，仿生制備了“Smart”免疫磁珠，實現(xiàn)對CTC的高靶向效率，比商業(yè)化的磁珠（Dynabeads M280，Invitrogen）具有更高的捕獲率，并通過可切割的二硫鍵，按需釋放捕獲的活腫瘤細胞.

綜上所述，基于抗體一抗原識別的免疫磁分選技術(shù)具有極高的特異性，但也較為耗時耗財，由于其依賴于腫瘤細胞表面特異性抗原的表達，CTC的異質(zhì)性也影響了該技術(shù)對CTC的分選效率.

1.2.2微流控芯片技術(shù)

近年來，基于CTC物理特性和生化特性的免疫微流控芯片受到廣泛重視.2007年，NAGRATH等J33j構(gòu)筑了微柱“CTC-chip”芯片，通過化學方法將anti-EpCAM抗體修飾到微柱陣列表面，在116個癌癥患者中成功檢測出115個癌癥轉(zhuǎn)移患者，并在7例早期癌癥患者的外周血中均檢測到CTC，每毫升外周血中CTC數(shù)量在5～1 281個變化（純度為50%）.STOTT等[34]設(shè)計的人骨形免疫（anti-EpCAM）芯片“HB-Chip”，從15位轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中檢測出14位的外周血中有CTC（檢出率為93%）.麻省理工學院的PARK等J35J將金納米顆粒應用到HB-Chip芯片中（NP-HBCrC-C}iip），采用谷胱甘肽（GSH）通過化學配體交換實現(xiàn)競爭反應，釋放高活性的CTC，為后續(xù)的RNA基因測序等研究提供便利.改良的人骨形芯片的微通道使流體產(chǎn)生微渦流，以增加腫瘤細胞與芯片表面抗體的接觸機會，從而實現(xiàn)了高通量、高靈敏及高特異性的捕獲CTC，且能檢出之前不被重視的細胞團簇.2014年，KARABACAK等[36]設(shè)計的CTC-iChip芯片利用確定性側(cè)向位移（DLD）原理及慣性聚焦，在一個平臺上實現(xiàn)兩步法分選CTC，如圖5所示，在模組1利用確定性側(cè)向位移（DLD）原理，將血液紅細胞進行分離棄除;在模組2使用磁泳法分離出CD45功能化磁珠標記的白細胞，分選CTC.CTC-iChip可處理8 mL·h-1全血，回收（97±2.7）%的癌細胞，

此外，捕獲界面的納米結(jié)構(gòu)在微流控芯片中也被廣泛研究.如利用混沌混合器使流體產(chǎn)生垂直流向，結(jié)合二氧化硅（ Si02）三維納米結(jié)構(gòu)高效捕獲CTC[37].2018年CUI等[38]通過正硅酸四乙酯原位水解法，在生物芯片表面生長Si02納米陣列，以促進生物芯片與CTC微絨毛及絲狀偽足之間的地形相互作用，協(xié)同特異性靶向作用捕獲CTC.實驗證明，相比光滑的表面，納米線修飾的具有納米結(jié)構(gòu)的表面對CTC具有更高的捕獲率（85.4±8.3）%.如圖6所示，人體前列腺癌細胞PC-3與光滑表面的接觸面積很小，而在納米三維結(jié)構(gòu)的界面上，PC-3伸出更多偽足與界面相互作用，并鋪展開來，

相比于傳統(tǒng)方法，微流控芯片結(jié)合親和分選方法，利用流體動力學分離細胞，具有更高的分辨率和靈敏度，易實現(xiàn)單個CTC分選及檢測工作，操作簡單高效，且盡可能地避免了人為誤差，但該方法與免疫磁分選類似，篩選靶向目標細胞的特異性抗體是該技術(shù)難點及瓶頸.

2 CTC的分析檢測技術(shù)

2.1 免疫熒光染色檢測

免疫熒光檢測法作為傳統(tǒng)CTC鑒定方法，即將熒光素偶聯(lián)的熒光抗體與腫瘤細胞進行抗體抗原特異性反應，在熒光顯微鏡下觀察，借此對腫瘤細胞進行鑒定及定位.在CeIISearch系統(tǒng)中，通過結(jié)合CD45綠色熒光抗體（靶向白細胞）、CK8/18/19紅色熒光抗體（靶向腫瘤細胞）與細胞核DAPI藍色熒光染色劑對CTC進行熒光識別鑒定[23-24].具有紅色和藍色熒光，無綠色熒光（CK+/CD45-/DAPI+）的細胞鑒定為CTC，具有綠色和藍色熒光，無紅色熒光（CK-/CD45+/DAPI+）的細胞則是白細胞，如圖7所示[39].該方法是大部分實驗室采用的CTC鑒定方法，通過免疫熒光鑒定CTC表面相關(guān)特異性蛋白的表達，該檢測方法具有耐污染的優(yōu)勢，但易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，且操作復雜、耗時耗力，因此不宜大規(guī)模使用.

2.2核酸分析檢測

近年來，基于CTC中核酸的分子分析方法被不斷開發(fā)用于CTC鑒定，定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）作為一種被廣泛使用的檢測手段，可在106個白細胞的復雜背景下檢測到一個CTC，并定量CTC相關(guān)基因的表達情況.CK-19-mRNA作為CTC的特異性核酸序列，是RT-qPCR定量檢測的普遍目標[40].STATHOPOULOU等[41-42]采用LightCyclerTM（Roche）系統(tǒng)，通過優(yōu)化擴增引物，實時地定量檢測外周血中CK-19-mRNA，極大提高了檢測的特異性和靈敏性.Multiplex-RT-qPCR可以在一個樣本中同時評估多個目標分子（如：EpCAM，MUC-1，HER2等），這有利于對有限的CTC進行更高靈敏度的檢測[43]，如圖8所示，甲基化特異性基因聚合酶鏈式反應（MSP）的出現(xiàn)也證明了CTC多參數(shù)檢測的重要性[44]，

通過熒光素標記的DNA探針與CTC細胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，從而獲得核內(nèi)染色體或基因拷貝狀態(tài)的相關(guān)信息的熒光原位雜交（FISH）法，可用于評估乳腺癌、前列腺癌患者CTC中的HER2的表達情況[45-46]，及ALK基因的復制數(shù)量[47].相比于PCR，F(xiàn)ISH具有較高的抗污染能力，且重復性好.

總之，相比于免疫熒光成像，核酸分析更客觀、可量化、成本低，不需要專門的檢驗師評估，易實現(xiàn)自動化及標準化.核酸檢測可以確定與治療相關(guān)的分子靶標，如：基因突變、染色體易位等，從而指導患者的個性化治療.但是，由于CTC的異質(zhì)性，分子分析法無法對CTC個數(shù)進行絕對定量.

2.3光學分析檢測

稀土發(fā)光材料的熒光信號亦被應用于CTC檢測.2015年，WANG等[37]結(jié)合上轉(zhuǎn)換磁性復合免疫材料（NaYF4-Fe3O4-Ab）及硅納米線整合的芯片，進行CTC捕獲，實現(xiàn)近紅外（980 nm）上轉(zhuǎn)換熒光（UCL）成像.2019年，GUO等[48]結(jié)合時間分辨光致發(fā)光技術(shù)（TRPL技術(shù)）和稀土納米材料（NaEuF4-Ab）溶解增強熒光放大技術(shù)，通過100us的延遲，大大消除了短周期背景信號，提高了信噪比，首次實現(xiàn)了全血中CTC的高靈敏直接檢測，如圖9所示.

基于材料的熒光信號檢測，極大簡化了操作過程，精準靈敏，且較為客觀.但由于該方法需要對細胞進行特異性熒光材料的孵育，易造成樣品污染，細胞存活率也低.

2.4拉曼檢測

拉曼檢測多用于分子層面的檢測，近年來，由于拉曼檢測具有信號穩(wěn)定、檢測限低、靈敏度高的優(yōu)勢，其在CTC檢測領(lǐng)域被廣泛關(guān)注.利用特異性靶向磁珠及表面增強拉曼（SERS）探針與CTC形成三明治夾結(jié)構(gòu)是研究者普遍選擇的方法，實現(xiàn)對CTC的拉曼檢測[49-50].XUE等[51]則合成金納米粒子（Au NPs）包裹的超順磁性納米球（SPION-PEI），并采用巰基苯甲酸（MBA）、還原性牛血清蛋白（r-BSA）與葉酸（FA）進行層層修飾，巧妙設(shè)計了SPION-PEI@Au NPs-MBA-r-BSA-FA復合SERS探針，實現(xiàn)了對宮頸癌患者的CTC（檢測限為1個·mL-I）的捕獲檢測及釋放，如圖10所示.

研究表明，該方法有效避開了免疫熒光檢測的光降解及光漂白劣勢，靈敏度可以與RT-qPCR相媲美，制樣簡單，測量高效準確，但由于CTC在外周血中極少，這對SERS探針的設(shè)計提出了更高的要求，且設(shè)備昂貴.

2.5其他分析檢測方法

除上述CTC檢測方法，研究者亦將電化學傳感器應用于CTC檢測.如圖11所示，HU等[52]將通過生物模板法合成的牛血清蛋白包裹的銀納米微球（ Ag@BSA）負載于金電極上，構(gòu)筑了新型的細胞傳感器，靈敏檢測了人口腔表皮樣癌細胞（KB瘤細胞），實現(xiàn)了電化學方法檢測CTC（檢測限：20個·mL-l KB細胞）.為提高電化學檢測靈敏度，QU等[53]構(gòu)建了一個兩種特異性適配體修飾（ss-TLSlc，ds-TLSlla）的超靈敏電化學傳感器.電化學檢測具有檢測方便、靈敏度高的優(yōu)勢，且易實現(xiàn)便攜式儀器檢測，在CTC檢測的臨床應用中具有廣闊的應用前景.此外，其他檢測方法如酶聯(lián)免疫檢測（ ELISA）也被應用于CTC檢測[54].KIM等[55]利用四氧化三鐵（Fe304）納米顆粒及鉑（Pt）納米顆粒的協(xié)同催化效應，將兩者負載在氧化石墨烯（GO）上，制備特異性抗體修飾的納米復合材料，通過3，3，5，5一四甲基聯(lián)苯胺（TMB）催化顯色，實現(xiàn)比色檢測CTC.但該方法靈敏度有限，且對樣品純度要求高，其捕獲效率還有待提高，總的來說，以上檢測方法為CTC檢測開拓了新思路.

3 CTC檢測面臨的挑戰(zhàn)及展望

目前，基于腫瘤細胞的物理電學特性進行分離的技術(shù)缺乏特異性，因此聯(lián)合利用CTC的物理及生物特性，結(jié)合蛋白及核酸分析，可實現(xiàn)對CTC的高效精準捕獲及檢測.

然而，CTC檢測面臨的挑戰(zhàn)也不容忽視.首先，CTC在復雜的血液背景下，含量極少.且CTC具有異質(zhì)性，沒有一種抗體能特異性100%靶向某種腫瘤細胞，只有約60%的CTC攜帶著生源實體腫瘤的生物信息.由于CellSearch僅適用于少數(shù)類型的癌癥，且檢測靈敏度不高，無法分離活的CTC，因而較大程度地限制了其在臨床檢測中的有效應用，為應對該挑戰(zhàn)，有研究聯(lián)合使用多種抗體，對腫瘤細胞表面抗原進行表達分型，實現(xiàn)更高靈敏性檢測，或是尋找新的蛋白，如肌動蛋白結(jié)合蛋白（ plastin-danbai） [56].最后，抗體定向偶聯(lián)亦是CTC檢測面臨的一項技術(shù)挑戰(zhàn)，抗體取向決定著抗原結(jié)合位點的活性，也就決定著材料或設(shè)備對腫瘤細胞的靶向能力[57-58]，抑或是用分子更小的特異性靶向多肽替換抗體，實現(xiàn)更高靈敏度的檢測[29-30].此外，尋找具有腫瘤特異性的其他生物標志物也是研究的熱點.腫瘤來源外泌體相比于CTC，是具有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，尺寸?。?0～150 nm），且量多.外泌體參與細胞通信、遷移，促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過程，與多種疾病的發(fā)生和進程密切相關(guān)[59].2016年，在液體活檢領(lǐng)域，基于一種新的生物標志物，外泌體的腫瘤診斷產(chǎn)品首次在美國上市[60].因此，作為CTC的替代與補充，腫瘤來源的外泌體的檢測對于腫瘤早期預警具有很大的臨床應用前景.

總的來說，CTC檢測具有很大潛力，基于理論技術(shù)和深入探索，仍有望實現(xiàn)對CTC的高靈敏度、高特異性、高通量及高活性的分選，達到精準檢測.

參考文獻：

[1] ASHWORTH T R.A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death [J].Australasian Medical Journal， 1869， 14： 146 - 149.

[2]HOU J M，KREBS M G，LANCASHIRE L，et al.Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumorcells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer[J].Journal of Clinical Oncology， 2012， 30（5）：525 - 532.

[3] MICALIZZI D S，F(xiàn)ARABAUGH S M，F(xiàn)ORD H L.Epithelial-mesenchymal transition in cancer： parallels hetween normaldevelopment and tumor progression [J].Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia ，2010，15（2）：117 - 134.

[4]RIETHDORF S，WIKMAN H，PANTEL K.Biological relevance of disseminated tumor cells in cancer patients[J].International Journal of Cancer，2008 ，123（9）：1991 - 2006.

[5] VONA G，SABILE A，LOUHA M， et al_Isolation by size of epithelial tumor cells：a new method for theimmunomorphological and molecular characterization of circulating tumor cells [J].The American Journal of Pathology，2000，156（1）：57 - 63.

[6]TIBBE A G，DE GROOTH B G，GREVE J，et al.Optical tracking and detection of immunomagnetically selected andaligned cells [J].Nature Biotechnology， 1999 ，17（ 12）： 1210 - 1213.

[7] ROSTAGNO P，MOLL J， BISCONTE J， et al.Detection of rare circulating breast cancer cells by filtration cytometry andidentification by DNA content： sensitivity in an experimental model [J].Anticancer Research， 1997， 17（ 4A）： 2481 -2485.

[8] TAN S J，YOBAS L，LEE G Y，et al.Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood [J].BiomedMicrodevices，2009，1 1（4）：883 - 892.

[9] HAROUAKA R A，ZHOU M D，YEH Y T，et al.Flexible micro spring array device for high-throughput enrichment ofviable circulating tumor cells [J].Clinical Cheruistry ，2014 ，60（2）：323 - 333.

[10]KUO J S，ZHAO Y，SCHIRO P G，et al.Deformability considerations in filtration of biological cells[J].Lah on a Chip，2010，10（7）：837- 842.

[11] ZHENG S， LIN H， LIU J Q，et al.Membrane microfilter device for selective capture， electrolysis and genomic analysis ofhuman circulating tumor cells[J].Journal of ChromatographyA ，2007， 1162（2）： 154 - 161.

[12]DONG Y， SKELLEY A M， MERDEK K D，et al.Microfluidics and circulating tumor cells [J].The Journal of MolecularDiagnostics，2013，15（2）：149 - 157.

[13] HUANG T，JIA C P， SUNW J，etal.Highly sensitive enumeration of circulating tumor cells in lung cancer patients usinga size-based filtration microfluidic chip[J].Biosensors and Bioelectronics ，2014， 51： 213 - 218.

[14] YAMADA M， NAKASHIMA M， SEKI M.Pinched flow fractionation： continuous size separation of particles utilizing alaminar flow profile in a pinched microchannel[J].Analytical Chemistry ，2004 ，76（ 18）： 5465 - 5471.

[15] KIM Y J，KOO G B， LEE J Y， et al.A microchip filter device incorporating slit arrays and 3-D flow for detection ofcirculating tumor cells using CAV l-EpCAM conjugated microbeads[J].Biomaterials ，2014，35（ 26）： 7501 - 7510.

[16] COUMANS F A，VAN DALVM G，BECK M，et al.Filter characteristics influencing circulating tumor cell enrichment fromwhole blood[J ].PLoS ONE ，2013， 8（4）： e61770.

[17] PARK S，ANG R R， DUFFY S P，et al.Morphological differences between circulating tumor cells from prostate cancerpatients and cultured prostate cancer cells[J ].PLoS ONE ，2014，9（1）：e85264.

[18] GERTLER R， ROSENBERG R， FUEHRER K， et al.Detection of circulating tumor cells in blood using an optimizeddensity gradient centrifugation [C]//ALLGAYER H， HEISS M M， SCHILDBERG F W.Molecular Staging of Cancer.Berlin：Springer，2003.

[19] LARA O，TONG X，ZBOROWSKI M ，et al.Enrichment of rare cancer cells through depletion of normal cells using densityand flow-through ，immunomagnetic cell separation[J].Experimental Hematology，2004， 32（ 10）： 891 - 904.

[20] BECKER F F，WANG X B，HUANG Y， et al.Separation of human breast cancer cells from blood by differential dielectricaffinity [J].Proceedings of the National Academy of Sciences， 1995，92（3）：860 - 864.

[21]GASCOYNE P R， WANG X B， HUANG Y， et al.Dielectrophoretic separation of cancer cells from blood [J].IEEETransactions on Industry Applications，1997，33（3）：670 - 678.

[22] GASCOYNE P R， NOSHARI J， ANDERSONT J，et al.lsolation of rare cells from cell mixtures by dielectrophoresis [J].Electrophoresis ，2009，30（8）：1388 - 1398.

[23] CRISTOFANILLI M ，BUDD G T，ELLIS M J，et al.Circulating tumor cells， disease progression ，and survival in metastaticbreast cancer[J ].New England Journal of Medicine ，2004 ，351（8）：781 - 791.

[24]DENG G， HERRLER M， BURGESS D， et al.Enrichment with anti-cytokeratin alone or combined with anti-EpCAMantibodies significantly increases the sensitivity for circulating tumor cell detection in metastatic breast cancer patients[J].Breast Cancer Research ，2008， 10（4）：R69.

[25] TALASAZ A H，POWELL A A， HUBER D E，et al.lsolating highly enriched populations of circulating epithelial cells andother rare cells from blood using a magnetic sweeper device [J].Proceedings of the National Academy of Sciences， 2009，106（10）：3970-3975.

[26] HYUN K A，LEE T Y，LEE S H，et al.Two-stage microfluidic chip for selective isolation of circulating tumor cells（ CTCs）[J].Biosensors and Bioelectronics ，2015 ，67： 86 - 92.

[27] 周朝輝，付聰穎，賈能勤.基于磁分選技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)的肺癌A549細胞的分離檢測[J].上海師范大學學報（自然科學版），2017，46（4）：489 - 498.

ZHOU C H， FU C Y， JIA N Q.Isolation and detection of A549 lung cancer cells based on magnetic separation andindirectimmunofluorescence technologies[J].Journal of Shanghai Normal University（ Natural Sciences）， 2017， 46 （4）：489 - 498.

[28] VERMESH O，AALIPOUR A，GE T J，et al.An intravascular magnetic wire for the high-throughput retrieval of circulatingtumour cells in， vivo [J].Nature Biomedical Engineering，2018，2（ 9 ） ： 696 - 705.

[29]PENG J， ZHAO Q， ZHENG W， et al.Peptide-functionalized nanomaterials for the efficient isolation of HER2-positivecirculating tumor cells [J ].ACS Applied Materials & Interfaces ，2017，9（ 22） ： 18423 - 18428.

[30] BAI L，DU Y， PENG J，et al.Peptide-based isolation of circulating tumor cells by magnetic nanoparticles [J].Journal ofMaterials Chemistry B ，2014 ，2（ 26） ： 4080 - 4088.

[31] XIANG Z ， YANG X， XU J ， et al.Tumor detection using magnetosome nanoparticles functionalized with a newly screenedEGFR/HER2 targeting peptide [J] .Biomaterials ，2017， 115 ：53 - 64.

[32] HUANG C ， YANG G， HA Q， et al.Multifunctional “smart”particles engineered from live immunocytes ： toward captureand release of cancer cells [J].Advanced Materials ，2015 ，27（ 2 ） ： 310 - 313.

[33] NAGRATH S，SEQUIST L V，MAHESWARAN S，et al.lsolation of rare circulating tumour cells in cancer patients bymicrochip technology [J ].Nature ， 2007，450（ 7173 ） ： 1235 - 1239.

[34] STOTT S L， HSU C H， TSUKROV D I， et al.lsolation of circulating tumor cells using a microvortex-generatingherringbone-chip [J ] .Proceedings of the National Academy of Sciences，2010，107 （ 43 ） ： 18392 - 18397.

[35] PARK M H， REATEGUI E， LI W， et al.Enhanced isolation and release of circulating tumor cells using nanoparticlebinding and ligand exchange in a microfluidic chip [ J ] .Journal of the American Chemical Society ，2017 ， 139 （ 7） ： 2741 -2749.

[36] KARABACAK N M ， SPUHLER P S， FACHIN F， et al.Microfluidic ， marker-free isolation of circulating tumor cells fromblood samples [J].Nature Protocols ，2014，9（3 ） ： 694 - 710.

[37] WANG C， YE M， CHENG L， et al.Simultaneous isolation and detection of circulating tumor cells with a microfluidicsilicon-nanowire-array integrated with magnetic upconversion nanoprobes [J].Biomaterials，2015 ，54 ： 55 - 62.

[38] CUI H， WANG B， WANG W， et al.Frosted slides decorated with silica nanowires for detecting circulating tumor cellsfrom prostate cancer patients [J].ACS Applied Materials & Interfaces，2018， 10（ 23 ） ： 19545 - 19553.

[39] YOON H J， KIM T H，ZHANG Z， et al.Sensitive capture of circulating tumour cells by functionalized graphene oxidenanosheets [J].Nature Nanotechnology ，2013 ，8（ 11 ） ： 735 - 741.

[40]DATTA Y H，ADAMS P T，DROBYSKI W R，et al.Sensitive detection of occult breast cancer by the reverse-transcriptasepolymerase chain reaction [J] .Journal of Clinical Oncology ， 1994 ，12（ 3 ） ： 475 - 482.

[41]STATHOPOULOU A ， GIZI A ， PERRAKI M ， et al.Real-time quantification of CK-19 mRNA-positive cells in peripheralblood of breast cancer patients using the lightcycler system [J] .Clinical Cancer Research ，2003，9（ 14） ：5145 - 515 1.

[42 ] STATHOPOULOU A ， NTOULIA M ， PERRAKI M ， et al.A highly specific real-time RT-PCR method for the quantitative determination of CK-19 mRNA positive cells in peripheral blood of patients with operable breast cancer [J].InternationalJournal of Cancer，2006 ，119（ 7） ： 1654 - 1659.

[43]SIEUWERTS A M， KRAAN J， BOLT DE VRIES J， et al.Molecular characterization of circulating tumor cells in largequantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR [J].Breast Cancer Research and Treatment， 2009，118（3）：455 -468.

[44]CHIMONIDOU M，KALLERGI G， GEORGOULIAS V，et al.Breast cancer metastasis suppressor-l promoter methylationin primary breast tumors and corresponding circulating tumor cells [J]. Molecular Cancer Research， 2013， 11 （10） ：1248 - 1257.

[45]DI CARLO D，IRIMIA D， TOMPKINS R G， et al.Continuous inertial focusing， ordering， and separation of particles inmicrochannels [J ].Proceedings of the National Academy of Sciences ，2007 ，104 （ 48） ： 18892 - 18897.

[46]LEVERSHA M A， HAN J， ASGARI Z， et al.Fluorescence in， situ hybridization analysis of circulating tumor cells inmetastatic prostate cancer [J ] .Clinical Cancer Research ，2009， 15 （ 6） ：2091 - 2097.

[47]KHOO B L，WARKIANI M E，TAN D S W，et al.Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics forthe detection and enrichment of viable circulating tumor cells [J ] .PLoS ONE ，2014 ，9（ 7） ：e99409.

[48] GUO H，SONG X，LEI W，et al.Direct detection of circulating tumor cells in whole blood using time-resolved luminescentlanthanide nanoprobes [ J ] .Angewandte Chemie ，2019 ，58（ 35） ：12195 - 12199.

[49] SHA M Y，XU H，NATAN M J， et al.Surface-enhanced Raman scattering; tags for rapid and homogeneous detection ofcirculating tumor cells in the presence of human whole blood [J].Journal of the American Chemical Society，2008， 130（ 51） ：17214 - 17215.

[50]RUAN H，WU X，YANG C，et al.A supersensitive CTC analysis system based on triangular silver nanoprisms and SPIONwith function of capture ， enrichment， detection， and release [J].ACS Biomaterials Science & Engineering ， 2018， 4 （ 3 ） ：1073 - 1082.

[51] XUE T， WANG S， OU G， et al. Detection of circulating tumor cells based on improved SERS-active magneticnanoparticles [J ].Analytical Methods ，2019 ，11（ 22） ：2918 - 2928.

[52]HU C Y，YANG D P，WANG Z H，et al.Bio-mimetically synthesized Ag@BSA microspheres as a novel electrochemicalbiosensing interface for sensitive detection of tumor cells [J].Biosensors & Bioelectronics ，2013 ，41 ： 656 - 662.

[53] QU L， XU J， TAN X， et al.Dual-aptamer modification generates a unique interface for highly sensitive and specificelectrochemical detection of tumor cells [J ].ACS Applied Materials & Interfaces ，2014 ，6（ 10） ： 7309 - 7315.

[54]SAFAEI T S， MOHAMADI R M， SARGENT E H， et al.in， situ electrochemical ELISA for specific identification ofcaptured cancer cells [J ] .ACS Applied Materials & Interfaces ，2015 ，7（ 26） ： 14165 - 14169.

[55] KIM M I， KIM M S， WOO M A， et al.Highly efficient colorimetric detection of target cancer cells utilizing superiorcatalytic activity of graphene oxide-magnetic-platinum nanohybrids [ J].Nanoscale ，2014，6 （ 3 ） ： 1529 - 1536.

[56] YOKOBORI T，IINUMA H，SHIMAMURA T， et al.Plastin3 is a novel marker for circulating tumor cells undergoing theepithelial-mesenchymal transition and is associated with colorectal cancer prognosis [J ].Cancer Research ， 2013 ， 73 （ 7 ） ：2059 - 2069.

[57]LOU D， FAN L， CUI Y， et al. Fluorescent nanoprobes with oriented modified antibodies to improve lateral flowimmunoassay of cardiac troponin I [J].Analytical Chemistry ， 2018，90（ 11） ：6502 - 6508.

[58]LOU D，JI L， FAN L，et al.Antibody-oriented strategy and mechanism for the preparation of fluorescent nanoprobes forfast and sensitive immunodetection [J ].Langmuir，2019 ，35 （ 14） ：4860 - 4867.

[59] SHARMA S，ZUNIGA F，RICE G E，et al.Tumor-derived exosomes m ovarian cancer-liquid biopsies for early detectionand real-time monitoring of cancer progression [ J].Oncotarget ，2017 ， 8 （ 61 ） ： 104687.

[ 60]SHERIDAN C.Exosome cancer diagnostic reaches market [J ].Nature Biotechnology，2016，34（4） ：359 - 360.

（責任編輯：郁慧，包震宇）

收稿日期：2019-12-12

基金項目：上海市地方院校能力建設(shè)專項（17070503000）

作者簡介：蒲思思（1993-），女，碩士研究生，主要從事納米生物技術(shù)方面的研究.E-mail：Pss_Anita@163.com

通信作者：賈能勤（1970-），男，教授，主要從事生物電化學、生物傳感器和納米生物技術(shù)方面的研究.E-mail：nqjia@shnu.edu.cn

引用格式：蒲思思，周朝輝，賈能勤.循環(huán)腫瘤細胞分離富集與分析檢測技術(shù)的研究進展[J].上海師范大學學報（自然科學版），2020，49（2）：219-233.