范一靈 李瓊瓊 秦峰 劉浩 楊美成

摘 要 目的：比較《美國藥典》43版（USP43）、《歐洲藥典》10.0版（EP10.0）、《日本藥典》17版（JP17）與《中國藥典》2020年版（ChP2020）中中藥飲片微生物限度檢查方法及標準的差異，為我國中藥飲片相關微生物標準的修訂和完善提供參考。方法：比較USP43、EP10.0、JP17和ChP2020在中藥飲片的微生物計數法（包括抽樣與取樣、菌種和培養(yǎng)基選擇、微生物和耐熱菌計數等）、控制菌檢查（包括樣品前處理、增菌、分離、鑒定等）、微生物相關限度標準等方面的差異。結果與結論：在中藥飲片微生物的檢查方法上，USP43、EP10.0、JP17都有各自獨立的規(guī)定，ChP2020則新增了“通則1108”。在檢驗項目上，除需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數外，ChP2020與EP10.0規(guī)定了3種控制菌（耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門菌）的檢查方法;在此基礎上，JP17補充了金黃色葡萄球菌的檢查方法;USP43增加了梭菌的檢查方法，并最早提出不可接受微生物風險評估理念;ChP2020還新增了耐熱菌計數方法。在微生物限度標準上，USP 43對中藥飲片的分類最為細致，要求較為嚴格且高于EP10.0、JP17;ChP2020仍未對中藥飲片控制菌檢查設立統(tǒng)一的限度標準。雖然，ChP2020對“中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準”進行了修訂，但相較于美國、歐洲和日本藥典的規(guī)定還不完善。建議根據我國中藥飲片微生物污染和控制現狀，逐步完善藥典對中藥相關產品的微生物檢驗和限度標準，合理細化相應產品的微生物限度水平。

關鍵詞 中藥飲片;藥典;微生物檢查;限度標準;比較研究

中圖分類號 R921;R927.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）22-2695-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.22.02

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To compare the difference of microbiological limit test and criteria of TCM decoction pieces among 43 edition of United States Pharmacopeia? （USP43）， 10.0 edition of European Pharmacopeia? （EP10.0）， 17 edition of Japanese Pharmacopeia? （JP17） and 2020 edition of Chinese Pharmacopeia （ChP2020）， and to provide refernce for the revision and improvement of microbiological standards for TCM decoction pieces in China. METHODS： The differences in the microbial enumeration tests method （including sampling and sample preparation， selection of bacteria and culture medium， count of microorganisms and heat-resistant bacteria， etc.）， tests for specified microorganisms （including sample pretreatment， enrichment， separation and identification， etc.） and microbial related limit criteria were compared among USP43， EP10.0， JP17 and ChP2020. RESULTS & CONCLUSIONS： In terms of microbiological examination of TCM decoction pieces， USP43， EP10.0， JP17 had their own independent provisions. Chp2020 added “general rule 1108”. In terms of inspection items， in addition to the total aerobic bacteria count and total combined yeasts and molds count， ChP2020 and EP10.0 provided three methods for the inspection of control bacteria （bile-resistant Gram-negative bacteria， Escherichia coli， Salmonella）. On the basis， JP17 supplemented Staphylococcus aureus test; However， USP43 added Clostridium test method and put forward the concept of objectionable microorganisms risk assessment; ChP2020 also added a new method for counting heat-resistant bacteria. In terms of microbial limit criteria， USP43 was the most detailed in the classification of TCM decoction pieces， which was more strict than EP10.0 and JP17; ChP2020 had not set up a unified limit for the inspection of control bacteria of TCM decoction pieces. ChP2020 revised the “microbial limit standard for TCM extracts and TCM decoction pieces”， but it was not perfect compared with the Pharmacopoeia of the United States， Europe and Japan. It is suggested that according to the current situation of microbial contamination and control of TCM decoction pieces， the microbial limit test and criteria of TCM related products in Pharmacopoeia should be gradually improved， and the microbial limit level of corresponding products should be reasonably refined.

KEYWORDS? ?TCM decoction piece; Pharmacopeia; Microbial limit test; Limit criteria; Comparative study

中藥飲片是由中藥材通過炮制加工而成的可直接用于中醫(yī)臨床的產品，其大多源自天然植物、動物或礦物，通常攜帶有大量微生物[1-2]。多數中藥飲片的炮制過程簡單（如凈制、炒制等），滅菌不完全，使得具有致病力的微生物有所殘余[3-4];此外，在運輸和貯存過程中，與操作人員及外部非潔凈環(huán)境的接觸也增加了中藥飲片受致病微生物污染的可能，從而使其安全性受到影響[5]。

中藥飲片的微生物污染情況尚未得到足夠的關注，對其加工過程中微生物種群變化的研究也較為缺乏，這導致了中藥飲片微生物安全性評價的缺失。許多潛在的致病微生物（如耐熱菌和細菌毒素等）未能得到有效控制，增加了免疫力低下患者在使用中藥飲片過程中的風險[6]。雖然2015年版《中國藥典》（一部）收錄了中藥飲片品種理化性質分析的多種鑒別和檢查方法，但相關微生物的具體檢查方法和限度標準卻長期處于缺失狀態(tài);同時，在2015年版《中國藥典》（四部）通則中，除直接入口的中藥飲片外，并未規(guī)定其余形式中藥飲片的微生物相關檢查項目[7]。

中藥在歐洲被稱為植物藥，在日本被稱為生藥，在美國被歸為營養(yǎng)補充劑，雖然其概念與我國的中藥飲片不完全相同[8-9]，但在《歐洲藥典》10.0版（EP10.0）[10]、《日本藥典》17版（JP17）[11]和《美國藥典》43版（USP43）[12]中都分別明確收載了相關產品（植物藥、生藥或營養(yǎng)補充劑）的微生物檢查方法及限度標準。2020年版《中國藥典》（ChP2020）（四部）[13]增加了“中藥飲片微生物限度檢查法”（通則1108），但相關的微生物限度標準還不完善，而且對煎煮類中藥飲片的微生物限度標準亦未作出統(tǒng)一、明確的規(guī)定。本文通過比較USP43、EP10.0、JP17和ChP2020在中藥飲片微生物檢查方法和限度標準等方面的差異，了解中藥飲片微生物標準的修訂方向，探討對中藥飲片按其風險等級設立微生物限度的必要性，以期為我國中藥飲片微生物控制相關標準的修訂和完善提供參考。

1 中藥飲片微生物計數

筆者通過對EP10.0、JP17、USP43和ChP2020中與中藥飲片相關的微生物檢驗方法進行比較后發(fā)現，雖然前3部藥典在非無菌產品微生物檢查部分進行了國際間的協調與融合，但在中藥飲片微生物的檢查上，三者均有各自獨立的章節(jié)規(guī)定，如EP10.0“2.6.12”和“2.6.31”、 JP17“5.02”、USP43“2021”和“2022”，而ChP2020則新增了“通則1108”用于檢測中藥飲片中的微生物。在檢測項目上，4部藥典均規(guī)定了需氧菌總數（Total aerobic microbial count，TAMC）、霉菌和酵母菌總數（Total combined yeasts and moulds count，TYMC）的檢查方法，其主要區(qū)別體現在抽樣與取樣、菌種和培養(yǎng)基、微生物計數方法等方面，詳見表1。

1.1 抽樣與取樣

中藥飲片種類繁多，形狀、質地和大小各異，加之微生物污染具有不均勻的特點，因此抽樣和檢驗取樣的代表性至關重要[14]。4部藥典在“抽樣與取樣”的規(guī)定上有明顯區(qū)別。其中，EP10.0“2.6.12”[10]和USP43“2021”[12]對中藥飲片抽樣的要求與化學藥品相同，取樣量為10 g或10 mL。JP17“5.02”[11]規(guī)定了4種針對中藥飲片的抽樣方式，分別為：（1）小體積或粉末狀樣品，取50～250 g樣品混勻;（2）大體積樣品，取250～500 g樣品混勻并切碎;（3）單個樣品不少于100 g，至少取5個或500 g，切碎后混勻;（4）以溶液或制劑形式的樣品混勻后直接取樣。從上述混勻的樣品中取10 g或10 mL作為樣品檢驗。ChP2020“通則1108”[13]則指出，“除另有規(guī)定外，參照藥材和飲片取樣法（‘通則0211）抽取試驗樣品，大包裝飲片每批抽取100～500 g，混勻;獨立小包裝飲片按裝量抽取100～500 g的包裝數;檢驗量除另有規(guī)定外均為25 g或25 mL，貴重品種或密度較小品種可酌減”。

1.2 菌種和培養(yǎng)基選擇

在菌種選擇方面，USP43列出了包含金黃色葡萄球菌ATCC 6538、大腸埃希菌ATCC 8739、枯草芽孢桿菌ATCC 6633、白色念珠菌ATCC 10231和巴西曲霉ATCC 16404在內的5種微生物用于培養(yǎng)基適用性和方法適用性檢查[12]。EP10.0和JP17將大腸埃希菌更換為銅綠假單胞菌ATCC 9027，并對上述各菌種給出了英國食品工業(yè)與海洋細菌菌種保藏中心（National Collections of Industrial，Food and Marine Bacterial，NCIMB）、法國巴斯德研究所菌種保藏中心（Collection de LInstitut Pasteur Of Institut Pasteur，CIP）和日本生物資源中心（NITE Biological Resource Center，NBRC）的等效菌株編號，該規(guī)定與人用藥品注冊技術要求國際協調會議（International Council for Harmonization，ICH）的協調案一致[10-11]。ChP2020的菌種種類與EP10.0和JP17相同，但僅允許使用CMCC菌種[13]。

在培養(yǎng)基的選擇上，除采用TSA培養(yǎng)基和SDA培養(yǎng)基作為常規(guī)計數培養(yǎng)基外，考慮到中藥飲片常常存在較多的不溶性物質和較高的細菌、真菌污染概率，上述因素均有可能影響TAMC和TYMC計數結果，JP17還規(guī)定可在TSA培養(yǎng)基中可添加一定濃度的TTC以用于區(qū)分細菌菌落和其他雜質;如真菌生長影響樣品TAMC計數結果，可在TSA培養(yǎng)基中添加兩性霉素B以抑制真菌生長;如真菌在含抗生素的SDA培養(yǎng)基中蔓延生長，則可添加玫瑰紅成分以抑制蔓延現象[11]。ChP2020規(guī)定當TYMC計數受細菌生長影響時，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的SDA培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）[13]。但USP43和EP10.0均未明確提及相關要求。

3.2 JP17

JP17“G4”將中藥飲片及其提取物分成兩類：經沸水處理的樣品（Ⅰ類）和無需經過提取工藝直接使用的樣品（Ⅱ類）[11]。比較而言，JP17中Ⅰ類產品相當于EP10.0中A類產品，JP17的Ⅱ類與EP10.0中的C類相近，但JP17中未規(guī)定EP10.0中B類產品的限度標準，詳見表3。

3.3 USP43

相比于EP10.0和JP17的飲片分類，USP43在非無菌營養(yǎng)和膳食補充劑的微生物限度標準“2023”中對含有中藥（植物藥）的產品進行了較為詳細的分類，共有干燥或經磨粉植物、經磨粉植物提取物等7個類別，詳見表4。其中，干燥或經磨粉植物樣品的要求為TAMC計數≤1×105 CFU/g（或CFU/mL），TYMC計數≤1×103 CFU/g（或CFU/mL），且每10 g不得檢出大腸埃希菌和沙門菌，該要求高于EP10.0和JP17對相同分類產品的要求。

3.4 ChP2020

ChP2020“通則1108”在2015年版基礎上，修改了直接口服和泡服中藥飲片的微生物限度標準，增加了TAMC、TYMC計數和大腸埃希菌的規(guī)定，除TYMC計數要求為1×103 CFU/g外，其余與EP10.0的C類樣品的微生物限度標準（見表3）相同。但ChP2020仍未對中藥提取物的控制菌檢查設立統(tǒng)一的限度標準?？梢?，ChP2020對中藥飲片微生物限度的要求，無論是需要控制微生物的中藥分類還是微生物限量標準，都不及其余3部藥典完善。

4 討論

2015版《中國藥典》中已收載了部分中藥飲片相關微生物的限度標準，在引導中藥生產企業(yè)重視微生物污染、規(guī)范中藥飲片加工過程等方面具有積極作用[15]。但我國中藥飲片整體生產水平和技術條件還遠不及發(fā)達國家，產品仍普遍存在微生物污染的現象，并可能存在條件致病菌[16-18]。雖然中藥飲片在使用前大多需經煎煮等工藝處理，但在用藥過程中仍存在潛在風險，其殘留的致病微生物仍可能對患者造成危害[3-4，8，17-19]。目前，ChP2020雖已對“中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準”進行了修訂，但相較于USP43、EP10.0和JP17，ChP2020在樣品分類、檢驗項目和限度標準等方面的規(guī)定還有待進一步完善。

中藥飲片是初級加工產物，也是一類特殊的藥品，其檢查方法的適用性是標準制定過程中的重要環(huán)節(jié)[14]。中藥飲片微生物本底污染量高，對控制菌的檢查有較大干擾，存在漏檢風險[17]。不同檢查方法的增菌和分離效果存在較大差異，以JP17中金黃色葡萄球菌檢查為例，使用含7.5%氯化鈉的TSB培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)可有利于抑制樣品中背景微生物的生長、提高目標菌檢出率。USP43和JP17還增加了多種顯色培養(yǎng)基的使用，也是有效區(qū)分目標菌的方法。此外，4部藥典均允許使用微生物檢驗替代方法，如電化學方法、氣體檢查法、化學發(fā)光法等，而其中，基于分子生物學的檢測技術已在醫(yī)學檢驗、食品檢驗等領域體現出高靈敏度、高特異度和快速檢驗的優(yōu)點，可以在中藥飲片的微生物檢查中發(fā)揮積極作用，提高飲片控制菌檢出率[19-20]。

在限度標準上，USP43對中藥的分類最為細致，對中藥飲片產品的微生物限度標準要求也較為嚴格。雖然，USP43并未明確不可接受微生物的種類，但其要求生產企業(yè)需主動評估產品中可能存在的不可接受微生物，尤其應控制可能對產品造成不良影響、導致安全性危害的微生物[12]。這種風險評估和風險管理的理念值得我國借鑒和參考。

綜上所述，本研究對4部藥典的中藥飲片微生物計數法、控制菌檢查法和微生物相關限度標準進行了比較分析，根據我國中藥飲片微生物污染和控制現狀，有必要進一步完善藥典對中藥相關產品的微生物檢驗和限度標準，持續(xù)收集和整理基礎性微生物負載數據，合理指導中藥生產企業(yè)加強微生物污染控制和管理，最終保障中藥產品的安全。建議根據我國中藥飲片微生物污染和控制現狀，逐步完善藥典對中藥相關產品的微生物檢驗方法和限度標準，合理細化相應產品的微生物限度水平。

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（收稿日期：2020-06-29 修回日期：2020-10-15）

（編輯：羅 瑞）