張 席

上海工微所科技有限公司， 上海 200233

細菌總數(shù)是評價水質(zhì)污染程度的主要衛(wèi)生指標，長期以來，國內(nèi)多采用異養(yǎng)菌平板計數(shù)法[1,2]來測定水中的活菌數(shù)，現(xiàn)今對生活飲用水中的菌落總數(shù)檢測主要是根據(jù)《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標(GB/T 5750.12—2006)》中的平板計數(shù)法[3]來做，但由于飲用水中的貧營養(yǎng)環(huán)境有別于傳統(tǒng)培養(yǎng)基提供的富營養(yǎng)環(huán)境，大多數(shù)在顯微鏡下觀察到的細菌不能在傳統(tǒng)培養(yǎng)基中生長，致使活菌計數(shù)結(jié)果偏低。吖啶橙染色直接計數(shù)、活菌直接計數(shù)等方法可快速提高飲用水中的活菌計數(shù)[4]，但這些方法要求高，需配備昂貴的儀器設(shè)備及專業(yè)技術(shù)人員。大部分小實驗室還是會選擇比較簡單的平板計數(shù)法，所以提高現(xiàn)有平板計數(shù)法的活菌檢出率是很有必要。

GB/T 5750.12—2006檢測水中菌落總數(shù)使用營養(yǎng)瓊脂(36±1) ℃培養(yǎng)48 h，而《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定(GB 4789.2—2016)》中菌落總數(shù)檢測[5]采用平板計數(shù)瓊脂，并規(guī)定一般食品為(36±1) ℃培養(yǎng)(48±2)h，水產(chǎn)品是在(30±1) ℃培養(yǎng)(72±3) h，這是因水產(chǎn)品在溫度較低的水底生長，兼受海洋細菌與陸地細菌的污染，故以30 ℃作為培養(yǎng)溫度[6]。

本文將通過培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)溫度、實驗操作方法等條件和方法的比較，探討影響水中菌落總數(shù)檢測結(jié)果的影響因素，篩選合適的檢測參數(shù)，采用營養(yǎng)修復(fù)和實樣統(tǒng)計分析等手段研究縮短檢測時間的可能性，以提高平板計數(shù)法的檢出率的同時減少檢測時間，為GB/T 5750.12—2006中菌落總數(shù)檢測方法的改進提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

培養(yǎng)箱(型號LRH-250，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司);滅菌鍋(型號LDZX-50FBS，上海申安醫(yī)療器械廠);水浴鍋(型號DK-S28，上海精宏實驗設(shè)備有限公司);顯微鏡(型號BX-53，奧林巴斯) ;溫度計(型號0-100℃，上海華辰醫(yī)用儀表有限公司);氣浴恒溫振蕩器(型號THZ-82A，金壇市萬華實驗儀器廠);光學(xué)放大菌落計數(shù)器(型號 YLN-30，北京市亞力恩科學(xué)器材公司)。

1.2 供試培養(yǎng)基及樣品

葡萄糖(批號20180403，江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司);營養(yǎng)瓊脂(批號20190102，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司);平板計數(shù)瓊脂(批號20191127，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司);腦心浸液肉湯(批號20180726，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司);硫代硫酸鈉(批號20181101，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司);樣品：生活飲用水(由某食品加工生產(chǎn)企業(yè)送檢提供或?qū)嶒炇易詡?。

1.3 實驗方法

1.3.1兩種培養(yǎng)基在不同培養(yǎng)條件下對菌落總數(shù)檢測結(jié)果的影響比較

在每125 mL生活飲用水樣品中加入0.1 mL的1%硫代硫酸鈉滅菌溶液進行除氯，振蕩搖勻后立即吸取1 mL分別置于8塊無菌平皿中，其中4塊倒入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，另外4塊倒入平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后每種培養(yǎng)基的其中2塊置于36 ℃培養(yǎng)2 d～10 d，另2塊置于30 ℃培養(yǎng)2 d～10 d，分別觀察結(jié)果。同時平行三次試驗，取其平均值來比較分析。

1.3.2添加不同比例的葡萄糖對檢測結(jié)果的影響比較

在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中各加入0.0%、0.1%、0.3%、0.6%和1%的葡萄糖；在平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中加入0.0%、0.2%、0.5%和0.9%的葡萄糖，使兩種培養(yǎng)基中葡萄糖含量保持一致，將樣品除氯后，吸取1 mL分別置于36塊無菌平皿中，分別倒入這兩種含有不同比例葡萄糖的培養(yǎng)基，待平板凝固冷卻后分別置于36 ℃和30 ℃培養(yǎng)2 d～10 d。

1.3.3涂布平板法與倒平板法對檢測結(jié)果的影響比較

5個樣品除氯、搖勻后，分別吸取0.5 mL置于4塊無菌平皿中，其中2塊倒入(45±1) ℃平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，另外2塊倒入(40±1) ℃平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，同時置于30 ℃培養(yǎng)2 d～10 d。同時，分別吸取0.5 mL置于2塊已傾注好平板計數(shù)瓊脂的無菌平皿中，用涂布法將樣品涂布均勻后，置于30 ℃培養(yǎng)2 d～10 d。

涂布的無菌平皿應(yīng)提前制備，平板計數(shù)瓊脂傾注到無菌平皿中后做去水汽處理，避免涂布后細菌混在一起無法計數(shù)。本實驗所用無菌平皿，是當天傾注好后打開平皿蓋子，放置在生物安全柜內(nèi)通風2 h～4 h后，取出備用。

1.3.4營養(yǎng)修復(fù)后再培養(yǎng)對檢測結(jié)果的影響

加強充足的營養(yǎng)環(huán)境來復(fù)蘇或修復(fù)[7]細胞，可能會提高生活飲用水中的活菌檢出率。批量樣品除氯后，按樣品: 腦心浸液肉湯(BHI)為1∶1、1∶5、5∶1、1∶10和10∶1的量加入BHI液體培養(yǎng)基中，25 ℃下分別修復(fù)培養(yǎng)0 h、2 h、4 h和6 h后，平板計數(shù)瓊脂30 ℃培養(yǎng)2 d～7 d，計數(shù)，分析營養(yǎng)修復(fù)對計數(shù)的影響。

1.3.5按改進后方法對批量樣品檢測結(jié)果的統(tǒng)計分析

采用改進后的方法，即平板計數(shù)瓊脂、涂布平板、30 ℃、培養(yǎng)7 d，對自備的實驗室自來水管道用水20個、企業(yè)送檢的水樣42個進行檢測，記錄培養(yǎng)2 d、3 d和7 d時的計數(shù)。用SPSS 17.0對計數(shù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種培養(yǎng)基不同培養(yǎng)條件的計數(shù)比較

采用營養(yǎng)瓊脂和平板計數(shù)瓊脂在30 ℃、36 ℃下培養(yǎng)2 d～10 d后的計數(shù)結(jié)果見圖1，可看出，GB/T 5750.12—2006中使用營養(yǎng)瓊脂(36±1) ℃培養(yǎng)48 h(2 d)的數(shù)據(jù)明顯較低；相同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間下，平板計數(shù)瓊脂上生長的菌落總數(shù)明顯高于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)的實驗結(jié)果；從第3 d開始，30 ℃條件下的菌落總數(shù)明顯高于36 ℃培養(yǎng)的結(jié)果，說明平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、30 ℃更適合生活飲用水中菌落總數(shù)的生長。

圖1 兩種培養(yǎng)基分別在36 ℃、30 ℃培養(yǎng)2 d～10 d的菌落總數(shù)

表1 平板計數(shù)瓊脂在30 ℃培養(yǎng)2 d～10 d的菌落數(shù)日增長率及與10 d計數(shù)的比值

表1是平板計數(shù)瓊脂在30 ℃下培養(yǎng)2 d～10 d的菌落計數(shù)的每日增長率及其與10 d計數(shù)的比值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，平板計數(shù)瓊脂30 ℃培養(yǎng)2 d后，在培養(yǎng)基上形成的肉眼可見的菌落，僅占10 d可見菌落的11.2% 左右，3 d后提高至40.8%，3 d的增長率達到了263.6%，而后開始逐步下降，直到6 d還有19.4%以上的增長率，從7 d開始增長率下降至7.0%以下，說明水中細菌總數(shù)在2 d～6 d增長幅度很大。對2 d～9 d與10 d成對實驗數(shù)據(jù)平均數(shù)進行t檢驗[8]，2 d～6 d與10 d的實驗結(jié)果有顯著差異，而7 d～9 d與10 d實驗結(jié)果沒有顯著差異。說明水中菌落總數(shù)在平板計數(shù)瓊脂中、30 ℃條件下需要培養(yǎng)7 d才能達到生長峰值。

2.2 添加不同比例葡萄糖對計數(shù)結(jié)果影響的比較

比較平板計數(shù)瓊脂和營養(yǎng)瓊脂兩種培養(yǎng)基的配方成分，發(fā)現(xiàn)前者比后者多0.1%的葡萄糖。平板計數(shù)瓊脂更適合水中菌落總數(shù)生長是否是因為多了葡萄糖，因此，在兩種培養(yǎng)基中添加不同比例的葡萄糖，研究葡萄糖對計數(shù)的影響。

圖2是兩種培養(yǎng)基添加不同比例的葡萄糖后在36 ℃、30 ℃下培養(yǎng)2 d～10 d的計數(shù)結(jié)果?？梢钥吹?，在同一種培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)結(jié)果明顯高于36 ℃培養(yǎng)結(jié)果，與圖1顯示的結(jié)果一致；添加葡萄糖后的營養(yǎng)瓊脂，36 ℃下培養(yǎng)的檢出數(shù)有少量提高，30 ℃下的培養(yǎng)結(jié)果反而降低；添加葡萄糖后的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，兩個培養(yǎng)溫度下的檢出率均沒提高，說明原有的0.1%葡萄糖已能滿足微生物生長的需要。

2.3 倒平板法與涂布平板法對檢測結(jié)果的影響比較

表2是涂布平板法與倒平板法對檢測水中菌落總數(shù)的影響比較。發(fā)現(xiàn)兩個方法在2 d～6 d菌落總數(shù)累積增長率都在700%以上，說明在2 d～6 d菌落總數(shù)呈大幅生長趨勢，7 d～10 d累積增長率只有18.0% 以下，說明生長開始趨于平穩(wěn)；倒平板法在30 ℃培養(yǎng)2 d后，在培養(yǎng)基上形成肉眼可見的菌落僅占10 d可見菌落的5.6%～6.4%，3 d后約占10 d平板上菌落總數(shù)的23.9%～25.4%；用涂布平板法在30 ℃培養(yǎng)2 d后，在培養(yǎng)基上形成肉眼可見的菌落僅占10 d可見菌落的8.6%左右，3 d后約占10 d平板上菌落總數(shù)的30.3%，說明兩種方法相差不大，涂布平板法沒有顯著提高檢出率。

倒入(40±1) ℃、(45±1) ℃兩種溫度的培養(yǎng)基經(jīng)10 d培養(yǎng)后的計數(shù)結(jié)果無顯著性差異，說明倒入40 ℃～45 ℃的培養(yǎng)基對水中微生物的影響不大。通過2 d～9 d與10 d成對實驗數(shù)據(jù)平均數(shù)比較t檢驗[8]，2 d～6 d與10 d檢測結(jié)果有明顯的差異，7 d～9 d與10 d實驗結(jié)果都沒有顯著差異。從圖3中也可明顯看出涂布平板法與倒平板法檢測菌落總數(shù)結(jié)果無差異性。

圖4是涂布平板法與倒平板法在30 ℃培養(yǎng)3 d的照片，可看出，涂布平板比倒平板上的生長菌落明顯大，計數(shù)方便。倒平板法在傾注培養(yǎng)基時要控制好培養(yǎng)基的溫度，避免溫度太高殺死部分不耐熱細菌致使計數(shù)偏低，或溫度太低無法與樣品均勻混合使細菌生長不均等問題[9]，涂布平板是提前配制，不存在這些影響因素。因此確定水中菌落總數(shù)的檢測采用平板計數(shù)瓊脂、涂布平板、30 ℃培養(yǎng)7 d的方法。

圖2 兩種培養(yǎng)基添加不同比例葡萄糖后在36 ℃、30 ℃培養(yǎng)2 d～10 d的計數(shù)結(jié)果

表2 涂布平板法與倒平板法對水中菌落總數(shù)檢測的影響比較

圖3 涂布平板法與倒平板法用平板計數(shù)瓊脂30 ℃培養(yǎng)2 d～10 d的計數(shù)結(jié)果

圖4 涂布平板法(左)與倒平板法(右)30 ℃培養(yǎng) 3 d的照片

2.4 營養(yǎng)修復(fù)后再培養(yǎng)對檢測計數(shù)的影響

改進后的生活飲用水中菌落總數(shù)的檢測方法已確定，但該方法需培養(yǎng)7 d，時間較長。一般生活飲用水中的營養(yǎng)貧乏，而還有含氯的抑菌物質(zhì)存在，對水中的微生物細胞都會有影響，通過鏡檢觀察到有芽孢菌存在，說明有細胞受損等情況，所以水中微生物生長緩慢，需要較長的培養(yǎng)時間。通過加強充足的營養(yǎng)環(huán)境來復(fù)蘇修復(fù)受損的細胞，可能可以加快細胞生長，縮短培養(yǎng)時間。

批量樣品經(jīng)營養(yǎng)修復(fù)實驗后，發(fā)現(xiàn)水樣中微生物主要有兩種類型，A類是營養(yǎng)修復(fù)后對其活菌生長速率沒影響；B類是自身能正常生長，營養(yǎng)修復(fù)后，生長速率加快。

A類樣品，除氯后在25 ℃條件中增加不同濃度的營養(yǎng)物質(zhì)BHI修復(fù)0 h～6 h，結(jié)果均沒有出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，在較高營養(yǎng)物質(zhì)濃度中出現(xiàn)隨著修復(fù)時間加長而生長下降的趨勢，增加營養(yǎng)對細胞修復(fù)有限，不能提高活菌生長速率，見圖5。

B類樣品，除氯后在25 ℃環(huán)境條件中修復(fù)0 h～6 h，隨著修復(fù)時間的增加，樣品原液(1∶0)和不同修復(fù)營養(yǎng)濃度下的樣品的菌落總數(shù)均出現(xiàn)大幅度增殖，見圖6，說明此類細菌易生長，無需修復(fù)。如圖7所示，B類樣品經(jīng)修復(fù)后，在30 ℃下培養(yǎng)2 d、3 d和7 d的檢測結(jié)果無明顯差別，說明B類樣品只需培養(yǎng)2 d～3 d就能達到最高峰值。

圖5 A類樣品經(jīng)在不同修復(fù)營養(yǎng)濃度中25 ℃修復(fù)0 h～6 h后檢測結(jié)果

圖6 B類樣品經(jīng)在不同修復(fù)營養(yǎng)濃度中25 ℃修復(fù)0 h～6 h后檢測結(jié)果

從圖8、圖9中看出，兩類水樣中的菌落形態(tài)不一樣，A類水樣菌落形態(tài)為灰白色、暗黃色、橘紅色為主要菌落，而B類水樣生長在平板計數(shù)瓊脂表面的是比較大且較粘稠的乳白色菌落、表層里的為乳白色細小菌落。

進一步鏡檢結(jié)果見圖10。A類水樣檢測平板上的三種細菌分別為以弧菌、長桿菌與短桿菌，并有少量芽孢菌存在，如圖10-1、10-2、10-3所示。有芽孢菌說明水中的部分細菌由于各種原因受抑制、損傷而在短時間內(nèi)尚未形成肉眼可見的菌落，需繼續(xù)培養(yǎng)后使其復(fù)蘇并繁殖形成菌落[10]，培養(yǎng)剛開始2 d形成的菌落比較少，此類菌生長緩慢需培養(yǎng)7 d。而B類水樣檢測平板上的兩種看似大小不一的細菌，經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)都是球菌，見圖10-4，說明B類水樣生長的菌，在需氧條件下生長比厭氧條件下生長形成的菌落更快速，總的來說，此類細菌是一種容易生長的優(yōu)勢菌，培養(yǎng)2 d～3 d即可。

圖8 A類樣品修復(fù)0 h～6 h后培養(yǎng)7 d的照片(從上右順時針0 h、2 h、4 h和6 h)

圖9 B類樣品的0 h～6 h后培養(yǎng)7 d的照片(從上右順時針0 h、2 h、4 h和6 h)

因此加強充足的營養(yǎng)物質(zhì)，只會讓某類易生長的優(yōu)勢菌大幅生長，沒能讓所有細菌達到同步生長繁殖，反而出現(xiàn)增殖或減少，影響檢測結(jié)果，故生活飲用水中菌落總數(shù)的檢測不宜采用營養(yǎng)修復(fù)方式進行預(yù)處理，一般水樣收到后應(yīng)盡快開始檢驗，以盡量減少細菌群的變化，零星送檢的瓶裝采樣，若未經(jīng)冷卻，采樣后6 h之內(nèi)應(yīng)行檢驗[11]。

2.5 按改進后方法對批量樣品檢測結(jié)果的統(tǒng)計分析

按改進后方法對62個水樣進行檢測，記錄培養(yǎng)2 d、3 d和7 d時的計數(shù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)7 d計數(shù)與2 d和3 d計數(shù)有一定的關(guān)系，采用SPSS 17.0對這些數(shù)據(jù)進行線性回歸擬合。

62個水樣中有7個樣品(占比11.3%)，3 d與2 d計數(shù)的比值<2，7 d檢測結(jié)果與3 d計數(shù)接近，擬合后得線性回歸方程(1)：Y=-0.387+1.155X(R=0.989)，其中Y為7 d檢測結(jié)果，X為3 d計數(shù)。這類樣品的菌落易生長且單一，培養(yǎng)2 d～3 d就達到生長峰值，與B類水樣相似。

另外55個樣品(占比88.7%)，3 d與2 d計數(shù)的比值≥2，3 d時計數(shù)與7 d時檢測結(jié)果有顯著性差異，培養(yǎng)2 d時菌落較少，3 d時生長速率加快，7 d時達到生長高峰，與A類水樣的特征比較相似，生長緩慢且有色素菌，需培養(yǎng)7 d后才能達到峰值。對這55個樣品7 d檢測結(jié)果和3 d計數(shù)進行擬合，得線性回歸方程(2)：Y=27.455+2.525X(R=0.928)，其中Y為7 d檢測結(jié)果，X為3 d計數(shù)。

改進后的方法需要培養(yǎng)7 d才能得到檢測結(jié)果，但經(jīng)過以上統(tǒng)計分析，可根據(jù)培養(yǎng)2 d、3 d計數(shù)以及相應(yīng)的回歸方程，預(yù)測7 d計數(shù)，從而預(yù)判樣品的檢測結(jié)果。

3 結(jié) 論

參考GB 4789.2—2016，對生活飲用水中菌落總數(shù)的檢測方法進行了改進，發(fā)現(xiàn)GB/T 5750.12—2006中使用營養(yǎng)瓊脂(36±1) ℃培養(yǎng)2 d的計數(shù)結(jié)果偏低，采用平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、30 ℃下培養(yǎng)2 d時，計數(shù)結(jié)果達到生長最高峰值的0%～11.2%，培養(yǎng)3 d計數(shù)結(jié)果能達到32.6%～40.8%，培養(yǎng)7 d達到生長最高峰值。

涂布平板法與倒平板法的計數(shù)結(jié)果無明顯差異，但涂布平板法在相同培養(yǎng)時間下菌落形態(tài)更大，更易于計數(shù)。

營養(yǎng)修復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)水樣中的菌落有兩種類型，A類特點是生長緩慢且有多種色素菌，需培養(yǎng)7 d才能達到峰值；B類特點是易生長且單一，培養(yǎng)2 d～3 d即可。營養(yǎng)修復(fù)不能加快菌落總數(shù)的檢測時間，不建議對水樣進行營養(yǎng)修復(fù)前處理，應(yīng)立即檢測。

采用平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)7 d的方法檢測水樣的菌落總數(shù)，可根據(jù)培養(yǎng)3 d與2 d時計數(shù)的比值以及相應(yīng)的回歸方程，預(yù)測7 d時的計數(shù)結(jié)果。當樣品培養(yǎng)3 d與2 d計數(shù)的比值<2時，7 d 檢測結(jié)果Y=-0.387+1.155X(R=0.989，X為3 d計數(shù))；當培養(yǎng)3 d與2 d計數(shù)的比值≥2時，7 d檢測結(jié)果Y=27.455+2.525X(R=0.928，X為3 d計數(shù))。

今后生活飲用水中菌落總數(shù)測定標準GB/T 5750.12—2006的改版，可參照國標GB4789.2—2016中的水產(chǎn)品要求，用平板計數(shù)瓊脂30 ℃培養(yǎng)3 d～7 d，這樣更能接近反映水中菌落總數(shù)的真實數(shù)值。另外，采用改進后方法計數(shù)時有相當比例的計數(shù)結(jié)果大于100 CFU/mL，故建議對現(xiàn)有生活飲用水的菌落總數(shù)判定限值進行合理的修訂。