徐小丹 王二強 劉 坪 孟娟娟 桂顯偉 武 杰 侯 雋 王 仙 吳向未 陳雪玲

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，石河子 832002)

包蟲病或稱棘球蚴病(hydatid disease)是由細粒棘球蚴絳蟲的幼蟲寄生于中間宿主引起的一種嚴重影響人畜健康的寄生蟲疾病，主要分布于牧區(qū)，以細粒棘球蚴引起的囊性包蟲病為多見[1]。棘球蚴感染早期無明顯癥狀，但隨著包囊體積增大，在感染后期會引起組織、臟器的物理性損傷，進而影響組織器官正常功能的發(fā)揮[2]。蟲體之所以能在宿主體內(nèi)長期生存，主要依賴于對宿主的免疫逃逸[3]。

髓源性抑制細胞(myeloid derived suppressor cells,MDSCs)是髓系來源的異質(zhì)細胞群，在腫瘤、炎癥、寄生蟲感染等病理情況下可急劇增加，具有強大的免疫抑制功能，主要通過高表達精氨酸酶1(Arginase 1，Arg1)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抑制T細胞增殖[4-6]。小鼠體內(nèi)的MDSC主要分為2個亞群，分別是單核細胞型MDSCs(monocytic-MDSCs,M-MDSC)和粒細胞型MDSCs(polymorphonuclear-MDSCs,PMN-MDSC)，在細粒棘球蚴感染小鼠模型中已發(fā)現(xiàn)M-MDSC表達，并且高表達精氨酸酶[7,8]。Th17和Treg是有別于Th1和Th2的效應(yīng)T細胞亞群。研究發(fā)現(xiàn)，在包蟲感染早期Th17表達升高，在包蟲感染中后期患者外周血中發(fā)現(xiàn)Th17/Treg表達失衡，出現(xiàn)以Treg表達升高為主的免疫抑制狀態(tài)，進一步促使包蟲的免疫逃逸[9-11]。同時有研究表明，在小鼠包蟲感染晚期脾臟M-MDSC與Th17呈負相關(guān)，但M-MDSC對Th17、Treg的作用尚未見報道[12]。故本文在建立細粒棘球蚴肝臟感染C57BL/6小鼠模型的基礎(chǔ)上，利用磁珠分選和流式細胞術(shù)初步探索感染后1個月和3個月小鼠脾臟中M-MDSC對Th17和Treg的作用，為進一步研究細粒棘球蚴感染的免疫機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及細粒棘球蚴原頭蚴的來源 原頭蚴采集于新疆維吾爾自治區(qū)昌吉州屠宰場病羊肝臟。雌性6～8周C57BL/6小鼠(A2017-068-01)購自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心。

1.1.2主要試劑和儀器 流式抗體Anti-mouseCD11b-PE、Anti-mouse GR-1-FITC、Anti-mouseLy-6G-FITC、Anti-mouseLy-6C-APC、Anti-mouseIL-17A-perc-psy5.5、Anti-mouseFoxP3-PE、anti-mouseCD4-PE、CD4-PECy、Fixation/Permeabiliz-ation Buffer和CFSE染液購自eBioscience公司；流式細胞儀(FACS AriaⅢ)購自BD 公司；Anti-mouse CD3、Anti-mouse CD28購自Biolegend公司；小鼠淋巴細胞分離液購自Solarbio 公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自BI。Myeloid-Derived Suppressor Cell Isolation Kit購自MiltenyiBiotec公司；Arg1抑制劑nor-NOHA和 iNOS抑制劑 L-NMMA 購自Sigma-Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1細粒棘球蚴原頭蚴的采集及懸液的制備 從感染細粒棘球蚴病的羊肝上無菌抽取無鈣化、無感染、完整的單囊型細粒棘球蚴包囊內(nèi)容物置于無菌離心管，原頭節(jié)(protoscole,PSC)自然沉淀，再用含有100 U/ml 青霉素和鏈霉素雙抗的無菌PBS(pH7.3)漂洗3次，除去育囊碎片使其自然沉淀，經(jīng)0.5%伊紅染色5 min,顯微鏡下鑒定具有活性的蟲體數(shù)(>90%)，用含雙抗的無菌PBS稀釋制成含有PSC 1 000個/ml的PSC懸液備用。

1.2.2細粒棘球蚴小鼠感染模型的建立及取材 將12只健康C57BL/6小鼠隨機分為感染組和對照組，6只/組。感染組小鼠每只于肝臟被膜下注射原頭節(jié)5 000個，對照組注射等體積PBS。于感染后的第30、90天頸椎脫臼處死小鼠，沿腹中線剪開腹腔暴露肝臟，觀察細粒棘球蚴接種后肝臟的感染情況。使用無菌器械摘取小鼠肝臟立即投入預(yù)冷的10%中性甲醛溶液中固定7 d，中間換液一次，脫水包埋后備檢。

1.2.3標本的制作及組織病理學(xué)檢查 將已固定的肝臟組織修剪成0.5 cm×0.5 cm 大小，流水沖洗，75%乙醇浸泡過夜，梯度脫水后浸蠟，采用徠卡石蠟包埋機進行組織包埋。包埋后的組織蠟塊置于石蠟切片機進行連續(xù)切片，切片厚度為4 μm。肝臟的HE染色：將肝組織切片置于烤箱中烤40 min，然后脫蠟至水；將切片置于蘇木素染液中染色2 min，流水洗去多余染液；將切片置于鹽酸乙醇分化液中1 s，自來水終止反應(yīng)；將切片置于PBS緩沖液中返藍 1 min，伊紅染色1 min，流水多次沖洗；切片浸入梯度乙醇脫水，每步各5 s；通風櫥內(nèi)風干，封片，顯微鏡下觀察并采圖。肝臟組織天狼猩紅染色：切片脫蠟后天狼猩紅染色1 h，流水沖洗后蘇木素染核5 min，流水沖洗，切片浸入梯度乙醇脫水，每步各5 s；通風櫥內(nèi)風干，封片，顯微鏡下觀察并采圖。

1.2.4脾臟單細胞懸液的制備 頸椎脫臼法處死感染30 d、90 d小鼠和na?ve小鼠，無菌摘取小鼠脾臟，剪刀剪碎后用玻璃注射器輕輕碾磨脾臟，使分散的細胞通過300目濾網(wǎng)，置于15 ml離心管，350 g離心5 min，棄上清，加入1 ml紅細胞裂解液，混勻，室溫靜置3 min。加入10 ml PBS終止裂解，350 g 離心5 min ，棄上清，加入少量PBS，制備單細胞懸液。

1.2.5免疫磁珠分離 M-MDSC 取上述制備的感染30 d、90 d小鼠的脾臟單細胞懸液，按照分離試劑盒說明書進行分離。主要步驟為：anti-GR-1-Biotin 抗體4℃孵育10 min,anti-Biotin Microbeads 4℃孵育15 min,過MACS柱后，以2 ml PBS洗脫，收集M-MDSC備用。

1.2.6na?ve小鼠脾臟淋巴細胞分離 取上述制備的na?ve 小鼠的脾臟單細胞懸液，在離心管中加入3 ml Ficoll分離液后沿試管壁緩慢加入2 ml脾細胞懸液，500 g 離心30 min。緩慢吸取血漿與分離液間的白膜層即淋巴細胞層至離心管內(nèi)，加入10 ml PBS 250 g 離心10 min 洗滌細胞2次后備用。

1.2.7體外MDSC與淋巴細胞共培養(yǎng)實驗 將上述獲得的na?ve 小鼠的淋巴細胞稀釋至1×107個/ml,每毫升細胞懸液加入1 μl CFSE 貯存液，終濃度為5 μmol/L，37℃孵育10 min，每5 min 混勻1次，用等體積滅活的胎牛血清冰上中止5 min,PBS洗滌2次后用完全培養(yǎng)基重懸細胞。計數(shù)1×105個/孔，以1∶1比例加入分選純化的M-MDSC進行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)體系中加入1 μg/ml的Anti-CD3抗體，0.5 μg/ml 的Anti-CD28抗體和2 ng/ml的IL-2，為分析MDSC誘導(dǎo)Th17和Treg的增殖機制，在共培養(yǎng)體系中加入Arg1抑制劑(nor-NOHA)和iNOS抑制劑(L-NMMA)使終濃度為500 μmol/L，共培養(yǎng)4 d后收集細胞，流式檢測Th17、Treg表達。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用兩樣本均數(shù)的t參數(shù)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細粒棘球蚴感染小鼠肝臟模型的建立 細粒棘球蚴感染30 d小鼠的肝臟出現(xiàn)乳白色包囊，稍有凸起，感染90 d包囊變大，數(shù)目增多(圖1)。

圖1 細粒棘球蚴感染小鼠肝臟中產(chǎn)生的包囊Fig.1 Cysts in liver of mice infected with Echinoco-ccus granulous

2.2細粒棘球蚴感染小鼠肝臟組織病理變化 HE結(jié)果顯示對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細胞排列整齊，未見炎癥細胞浸潤。實驗組小鼠感染30 d后可見肝細胞水腫，病灶處可見大量細粒棘球蚴堆積，此時并未形成完整的角質(zhì)層和生發(fā)層，病灶周圍有大量淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤。感染90 d可見肝細胞明顯水腫，病灶處形成了完整的生發(fā)層和角質(zhì)層，病灶周圍有大量淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，同時有多核巨、異物巨細胞以及上皮樣細胞存在。天狼猩紅染色結(jié)果顯示對照組小鼠僅肝血竇處有部分膠原沉積，實驗組感染小鼠30 d病灶周圍可見疏松的纖維組織形成，隨著感染時間延長，在感染90 d時可在病灶處見致密纖維包囊形成(圖2)。

圖2 細粒棘球蚴感染小鼠肝臟HE 和天狼猩紅染色Fig.2 HE staining and sirius red staining of liver tissue in mice infected with Echinococcus granulousNote:A.HE staining;B.Sirius red staining.

2.3細粒棘球蚴感染小鼠脾臟中MDSCs表達升高 流式細胞術(shù)檢測感染小鼠脾臟中CD11b+Gr1+細胞的表達水平。結(jié)果顯示，小鼠感染30、90 d后MDSCs表達水平與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

圖3 細粒棘球蚴感染小鼠不同時間小鼠脾臟MDSCs比例Fig.3 Percentage of MDSCs in spleen of mice with Echinococcus granulous at different timeNote:A.Expression level of CD11b+Gr-1+ cells detected by FACS at 30 d，90 d after Echinococcus granulous infection;B.Statistical analysis of percentages of MDSCs.**.P<0.01.

2.4細粒棘球蚴感染小鼠30 d脾臟中的M-MDSC促進Th17增殖但對Treg作用不明顯 結(jié)果顯示感染30 d小鼠脾臟中的M-MDSC與na?ve組相比促進小鼠淋巴細胞Th17增殖(P<0.05)，但Treg的增殖與na?ve 組相比無明顯差異(圖4)。

圖4 感染后30 d M-MDSC促進Th17細胞增殖Fig.4 M-MDSC promoted proliferation of Th17 at 30 d after infectionNote:A.Proliferation level of CFSEloCD4+IL-17A+ cells and CFSEloCD4+Foxp3+ cells from lymphocytes that co-cultured with M-MDSCs；B.Statistical analysis of percentages of CFSEloCD4+IL-17A+ from lymphocytes that co-cultured with M-MDSC.*.P<0.05；C.Statistical analysis of percentages of CFSEloCD4+Foxp3+ from lymphocytes that co-cultured with M-MDSC.

2.5細粒棘球蚴感染小鼠90 d 脾臟中M-MDSC 抑制Th17增殖， 促進Treg增殖 感染90 d小鼠脾臟中M-MDSC與na?ve組相比抑制小鼠淋巴細胞Th17增殖，促進Treg增殖(P<0.05，圖5)。

圖5 感染后90 d M-MDSC抑制Th17增殖，促進Treg增殖Fig.5 M-MDSC suppressed proliferation of Th17 and promoted proliferation of Treg at 90 d after infectionNote:A.Proliferation level of CFSEloCD4+IL-17A+ cells and CFSEloCD4+FoxP3+ cells from lymphocytes that co-cultured with M-MDSC；B.Statistical analysis of percentages of CFSEloCD4+IL-17A+ from lymphocytes that co-cultured with M-MDSC.***.P<0.001；C.Statistical analysis of percentages of CFSEloCD4+Foxp3+ from lymphocytes that co-cultured with M-MDSC.*.P<0.05.

3 討論

逃避宿主的免疫效應(yīng)是維持寄生的關(guān)鍵因素。細粒棘球蚴在宿主體內(nèi)長期生存主要依賴于有效的免疫逃逸機制。其中CD4+T細胞起主要的免疫調(diào)節(jié)作用，前期研究表明細粒棘球蚴感染的小鼠機體的免疫應(yīng)答感染早期以CD4+T細胞為主的抗感染免疫，而在感染后期逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐訡D8+T細胞為主的抑制性免疫[13]。與此同時CD4+T細胞的亞群也隨著感染進程發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為由早期的Th1和Th17為主的保護性免疫逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐訲h2和Treg為主的抑制性免疫，進一步為蟲體的免疫逃逸提供機會[14]。

既往研究表明寄生蟲感染會誘導(dǎo)宿主MDSCs大量增加[15]。例如在剛果錐蟲(Trypanosomacongolense)、和利什曼原蟲(Leishmaniaspp.)、剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)等感染后可誘導(dǎo)M-MDSC在體內(nèi)的聚集進而抑制CD4+T增殖和功能[16,17]。在錐蟲(Trypanosomacruzi)急性感染小鼠中，小鼠脾臟的MDSCs與Th17細胞比例呈負相關(guān)，在特異性去除MDSC后，會導(dǎo)致強烈的Th17反應(yīng)并產(chǎn)生嚴重的寄生蟲血癥[18]。在實驗性腦脊髓膜炎中發(fā)現(xiàn)MDSCs和CD4+T 細胞共培養(yǎng)可通過釋放細胞因子促進Th17分化[19,20]。以上實驗均可證明MDSC能夠影響Th細胞的增殖分化。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)細粒棘球蚴感染早期(30 d)小鼠脾臟中的M-MDSC能促進Th17增殖，而對Treg無明顯作用；而在纖維包囊形成期(90 d)，脾臟中的M-MDSC能促進Treg增殖，并抑制Th17增殖。這一結(jié)果與患者體內(nèi)Th17/Treg失衡相符合。同時研究中給予Arg1和iNOS的抑制劑并未起到明顯作用。Th17和Treg都是由 na?ve CD4+T增殖分化而來的T細胞亞群，在TGF-β信號通道介導(dǎo)下，IL-6、IL-21等促炎因子會誘導(dǎo)na?ve CD4+T向Th17分化，當缺乏促炎因子時則會分化為Treg。而本文中并未分選出Na?ve CD4+T 特異性誘導(dǎo)Th17和Treg增殖，而是非特異性誘導(dǎo)T細胞增殖，因此不能排除其他細胞分泌的因子誘導(dǎo)Th17和Treg增殖的現(xiàn)象，同時也從側(cè)面反映出M-MDSC可能分泌大量細胞因子誘導(dǎo)Th17和Treg分化。這也可能是在實驗中給予Agr1抑制劑和iNOS抑制劑未起到明顯作用的原因。

本實驗感染早期(30 d)脾臟中M-MDSC能夠促進Th17增殖，而纖維包囊形成期(90 d)M-MDSC抑制Th17增殖。Th17細胞主要分泌IL-17細胞因子，其可以誘導(dǎo)上皮細胞、內(nèi)皮細胞、纖維原細胞分泌IL-1β、IL-6、GM-CSF等吸引大量中性粒細胞浸潤，同時也有文獻表明在結(jié)腸癌中IL-17能夠促進PMN-MDSC的聚集，因此在細粒棘球蚴感染早期M-MDSC是否通過分泌細胞因子誘導(dǎo)Th17的高表達進一步促進M-MDSC的聚集尚需進一步研究[21]。

綜上所述，細粒棘球蚴感染小鼠MDSCs的表達升高，隨著感染時間的延長，M-MDSC能誘導(dǎo)Th17/Treg表達失衡，形成以Treg表達為主的免疫抑制狀態(tài)，從而抑制宿主的免疫殺傷，產(chǎn)生免疫逃逸作用。