周 丹 于園超 洪明陽 朱曉彤 崔立旺

(中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，沈陽 110122)

蛋白質(zhì)可逆磷酸化修飾是存在于所有生物體的重要生理機(jī)制，在細(xì)胞信號通路傳導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)控中至關(guān)重要。蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化過程分別由激酶和磷酸酶調(diào)控。近年來磷酸化修飾中相關(guān)蛋白磷酸酶和激酶已作為藥物靶點(diǎn)進(jìn)行廣泛研究[1，2]。蛋白磷酸酶(phosphoprotein phosphatases，PPase)根據(jù)序列同源性和三維結(jié)構(gòu)相似性可分為絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(phosphoserine and phospho-threonine residues phosphatases，PPPs)、Mg2+依賴的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(PPMs)和酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPs)3個家族[3]。PPPs的主要成員包括：PP1、PP2A、PP2B和PP7等[4，5]。惡性瘧原蟲PP1和PP2A在紅內(nèi)期表達(dá)，且PP1可影響瘧原蟲DNA的合成[6]；惡性瘧原蟲PP7在不同階段表達(dá)水平具有明顯差異：在早期滋養(yǎng)體中幾乎不表達(dá)，在晚期裂殖體階段表達(dá)水平達(dá)到峰值[7]。

絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶5(PP5)屬于PPP家族成員，PP5的主要結(jié)構(gòu)特征包括高度保守的PP2Ac結(jié)構(gòu)域以及四肽重復(fù)序列(TPRs)的N末端延伸，這3個四肽重復(fù)序列是PP5蛋白特有的[8，9]。TPR結(jié)構(gòu)域由一系列反平行的α螺旋組成，它們通過疏水相互作用聚集在一起形成一個搖籃狀的溝槽，被認(rèn)為參與了許多重要調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合，如熱休克蛋白90(heat shock proteins 90,Hsp90)[10，11]。TPR和蛋白C端可形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，抑制PP2Ac結(jié)構(gòu)域功能，因此在PP5蛋白發(fā)揮去磷酸修飾時起調(diào)控作用。已有研究表明，PP5在多種原蟲生長過程中起作用：PP5表達(dá)水平降低可導(dǎo)致柔嫩艾美耳球蟲原蟲(eimeriatenellaPP5，EtPP5)二代裂殖子凋亡[11]；敲除布魯氏錐蟲PP5(trypanosomabruceiPP5，TbPP5)基因可抑制錐蟲生長[7]；伯氏瘧原蟲(plasmodiumbergheiPP5，PbPP5)基因缺失可抑制有性階段發(fā)育[12]；惡性瘧原蟲PP5(plasmodiumfalciparumPP5，PfPP5)在紅內(nèi)期表達(dá)，并與Hsp90相互作用[13]。綜上，PP5蛋白在原蟲生長發(fā)育中具有重要作用。

鑒于PP5蛋白在各種屬原蟲生長發(fā)育中發(fā)揮的重要作用，本文通過生物信息學(xué)方法預(yù)測約氏瘧原蟲PyPP5(Py04697)優(yōu)勢抗原表位，擴(kuò)增后克隆至原核表達(dá)載體，獲得PyPP5重組蛋白后免疫小鼠獲得抗血清。觀察發(fā)現(xiàn)，PyPP5蛋白具有免疫原性和免疫反應(yīng)性。同時，抗-PyPP5免疫血清在體內(nèi)外均具有傳播阻斷效果。上述研究結(jié)果為高效瘧原蟲傳播阻斷疫苗的研發(fā)奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 BALB/c小鼠(6～8周齡，雌性)；約氏瘧原蟲基因組DNA(gDNA，中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室)；KOD-Plus(Toyobo)；FastDigest BamHⅠ(Thermo Fisher Scientific)；FastDigest NotⅠ(Thermo Fisher Scientific)；ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit(Vazyme)；快速質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN)；LB Broth(Solarbio)；RPMI1640(Gibco)；TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit v2.0(TaKaRa)；PierceTMECL Plus Western blot Substrate、HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads、6×His Tag Monoclonal Antibody,HRP(Thermo Fisher Scientific)；胎牛血清(Hyclone)。

1.2方法

1.2.1約氏瘧原蟲絲/蘇氨酸磷酸酶5(Py04697，PyPP5)基因合成及原核表達(dá)載體構(gòu)建 以約氏瘧原蟲gDNA為模板擴(kuò)增PyPP5目的片段，瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收純化。pET32a(+)原核表達(dá)載體經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶37℃孵育2 h后，采用Exnase Ⅱ(Vazyme)重組酶與純化后的PyPP5目的片段37℃ 30 min進(jìn)行重組反應(yīng)。將連接后的pET32a(+)-PyPP5表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中，篩選酶切鑒定和測序正確的陽性克隆株進(jìn)行rPyPP5誘導(dǎo)。

1.2.2重組蛋白的表達(dá)、純化與抗血清的制備 挑取pET32a(+)-PyPP5陽性克隆加入 LB培養(yǎng)基(500 ml)中，37℃搖至OD值為0.2～0.4，加入1 mmol/L IPTG 19℃過夜誘導(dǎo)。9 000 r/min離心5 min收菌，沉淀用8 ml天然結(jié)合緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4·2H2O，30 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH8.0)吹打混勻后超聲。超聲開3 s，關(guān)9 s，5 min/次，共4次，冰上進(jìn)行。超聲后12 000 r/min離心15 min，收集上清中可溶性蛋白。采用HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads純化PyPP5重組蛋白(rPyPP5)。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化后的PyPP5重組蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色檢測蛋白表達(dá)和純化情況。免疫血清制備：6～8周齡BALB/c雌性小鼠20只，PBS免疫組和rPyPP5免疫組各10只。初次免疫中，rPyPP5(50 μg/只)與完全弗氏佐劑使用三通管充分混合后皮下免疫小鼠。兩周和四周后進(jìn)行二免和三免，rPyPP5與不完全弗氏佐劑使用三通管充分混合后皮下免疫。三免后第10天眼球取血獲取抗-PyPP5免疫血清。

1.2.3ELISA檢測抗-PyPP5免疫血清中特異性抗體滴度 采用10 μg溶解在碳酸鹽緩沖液中的rPyPP5包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜。PBS-T洗6次后，將免疫血清從1∶1 000稀釋至1∶256 000，每孔加入100 μl，37℃孵育2 h后PBS-T洗3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)，37℃孵育1 h后PBS-T洗6次，加入鄰苯二胺和H2O2進(jìn)行反應(yīng)，加入濃硫酸終止反應(yīng)，波長492 nm處檢測OD值。

1.2.4提取約氏瘧原蟲不同階段的蛋白 采用1×107個Py 17XL活蟲感染昆明鼠。裂殖體純化：感染后第3天無菌心臟取血，加入到裂殖體培養(yǎng)基(25%胎牛血清+RPMI1640+鏈霉素+青霉素)中，37℃培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)后用55%的Nycodenz，2 500 r/min離心30 min，分離純化成熟裂殖體。環(huán)狀體純化：純化后的裂殖體尾靜脈回輸至小鼠體內(nèi)，涂片觀察。至環(huán)狀體時，采用80%的Nycodenz 進(jìn)行純化。滋養(yǎng)體純化：純化后的裂殖體尾靜脈回輸至小鼠體內(nèi)，涂片觀察。至滋養(yǎng)體時，采用70%的Nycodenz 進(jìn)行純化。配子體純化：感染后第3天喂食磺胺嘧啶(20 mg/L)，48 h后采用48%的Nycodenz分離純化配子體。動合子純化：感染后第3天，心臟采血，1 ml全血加9 ml動合子培養(yǎng)基(25%胎牛血清+RPMI1640+鏈霉素+青霉素，pH8.3)，19℃，24 h體外進(jìn)行動合子培養(yǎng)后，采用62%Nycodenz 分離純化動合子期原蟲。蛋白提?。荷鲜黾兓蟾麟A段約氏瘧原蟲用0.15%saponin冰上裂解8 min，13 000 r/min離心5 min，PBS-PI清洗至上清無紅色(去除血紅蛋白)，向沉淀中加入適量的M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent(ThermoFisher)。采用Western blot方法檢測約氏瘧原蟲各階段蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5抗-PyPP5免疫血清對原蟲有性階段生長抑制作用的觀察 采用1×107個Py 17XL活蟲感染已連續(xù)腹腔注射苯肼(200 μl；6 mg/ml)2 d的BALB/c小鼠。感染后第3天，將1∶5倍稀釋的rPyPP5/PBS免疫的小鼠血清加入動合子培養(yǎng)基(25%胎牛血清+RPMI1640+鏈霉素+青霉素)中，25℃條件下，尾血與動合子培養(yǎng)基1∶4混合培養(yǎng)15 min，培養(yǎng)結(jié)束后取1 μl混合液涂片，在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)配子體出絲數(shù)。取10 μl尾血加入90 μl動合子培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中加入1∶5倍稀釋的rPyPP5/PBS免疫的小鼠血清)，19℃培養(yǎng)24 h后，取1 μl涂片，用4%多聚甲醛和0.007 5%戊二醛固定?？?Pys25(1∶200)室溫孵育90 min，羊抗鼠Alexa fluor 488抗體(1∶500)室溫避光孵育60 min。采用熒光顯微鏡計數(shù)動合子數(shù)目和動合子轉(zhuǎn)化率。蚊飼實驗：直接蚊飼實驗前1 h，rPyPP5免疫組和PBS免疫組分別尾靜脈注射100 μl抗-PyPP5免疫血清和PBS免疫血清，蚊飼2 h，7 d后解剖蚊胃計數(shù)卵囊數(shù)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.01統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1重組蛋白表達(dá)純化及免疫血清特異性IgG抗體滴度檢測 本研究中通過Infusion克隆方法成功構(gòu)建了pET32a (+)-PyPP5原核表達(dá)載體。SDS-PAGE電泳分析可見rPyPP5(約50.4 kD)的表達(dá)，蛋白大小與預(yù)測蛋白分子量一致(圖1A)。ELISA檢測結(jié)果顯示，應(yīng)用rPyPP5免疫小鼠收集的血清與對照組相比，抗體特異性水平升高，且抗-PyPP5免疫血清抗體滴度在1∶128 000時與對照組有顯著差異(P<0.05，圖1B)。

圖1 rPyPP5表達(dá)檢測及免疫血清ELISA結(jié)果Fig.1 Expression of recombinant rPyPP5 and ELISA results of immune serumNote:A.Detection of recombinant rPyPP5 by coomassie brilliant blue staining；B.ELISA results of anti-serum obtained by immunizing mice with recombinant rPyPP5.PBS.Anti-serum obtained by PBS immunization;PyPP5.Anti-serum obtained by immunizing mice with recombinant Plasmodium yoelii PP5 protein.*.P<0.05；**.P<0.01.

2.2PP5在約氏瘧原蟲各階段的表達(dá)情況 提取約氏瘧原蟲不同階段的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分離，并用抗-PyPP5免疫血清進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，約氏瘧原蟲PP5蛋白在環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體、配子體、動合子等階段均有表達(dá)，且在裂殖體期表達(dá)達(dá)峰值(圖2A)。采用抗PyPP5免疫血清進(jìn)行的約氏瘧原蟲各發(fā)育階段的免疫熒光檢測結(jié)果顯示：PP5蛋白在環(huán)狀體、裂殖體、配子體和配子階段定位于原蟲胞漿(圖2B)。

圖2 PyPP5各階段表達(dá)和定位情況Fig.2 Expression and location of PyPP5 at each develop-ment stageNote:A.Western blot of Plasmodium yoelii cell lysates with anti-PyPP5 serum.R.Ring;T.Trophozoite;S.Schizont;G.Gametocyte;O.Ookinete.Positions of pre-stained molecular mass markers are indicated.Western blot with anti-Hsp70 serum is shown as loading controls.Arrows indicate PyPP5 and Hsp70 proteins，respectively.Lower panel shows the bands intensity of PyPP5 protein at each stage.Signal intensity was normalized by Hsp70 results.B.Localization of PP5 proteins at Plasmodium yoelii each develop-ment stage.

2.3抗-PyPP5免疫血清對有性階段原蟲的作用 體外免疫血清抑制實驗顯示，抗-PyPP5免疫血清使配子體出絲數(shù)目減少29.89%(P<0.05，圖3A)，與PBS免疫血清相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示抗-PyPP5免疫血清對雄配子體出絲有抑制作用。

瘧原蟲動合子培養(yǎng)基中加入1∶5倍稀釋的抗-PyPP5免疫血清與瘧原蟲培養(yǎng)24 h后可觀察到動合子形成減少，動合子數(shù)目減少38.59%(P<0.05，圖3B)。同時，經(jīng)過1∶5倍稀釋的抗-PyPP5免疫血清使動合子轉(zhuǎn)化減少64.30%(P<0.01，圖3C)。上述結(jié)果提示抗-PyPP5免疫血清對動合子的形成和成熟有抑制作用。

與PBS免疫血清相比，吸食過繼免疫-PyPP5免疫血清小鼠血液的蚊卵囊數(shù)目減少70.23%(P<0.001，圖3D)。吸食過繼免疫-PyPP5免疫血清小鼠血液的蚊感染率下降7.14%(表1)。上述結(jié)果提示抗-PyPP5免疫血清對蚊胃內(nèi)卵囊形成有抑制作用。

圖3 抗-PyPP5免疫血清對有性階段原蟲的作用Fig.3 Effect of anti-PP5 serum on sexual stageNote:A.Effect of anti-PyPP5 serum on male gametocyte exflagellation；B.Effect of anti-PyPP5 serum on ookinete number；C.Effect of anti-PyPP5 serum on ookinete conversion rate；D.Effect of anti-PyPP5 serum on oocysts formation.PBS.Anti-serum obtained by PBS immunization;PyPP5.Anti-serum obtained by immunizing mice with recombinant Plasmodium yoelii PP5 protein.*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

表1 抗-PyPP5免疫血清傳播阻斷效果Tab.1 Transmission blocking effect of anti-PyPP5 serum

3 討論

蛋白質(zhì)磷酸化在瘧原蟲有性生長發(fā)育階段具有重要作用[7]。蛋白磷酸酶由PPP、PPM和PTP三個基因家族編碼[13]。PP5屬于PPP家族成員，具有多種功能，包括類固醇信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAP激酶級聯(lián)的衰減以及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等[14]。PP5在約氏瘧原蟲中的功能尚未有研究報道。

傳播阻斷疫苗(transmission blocking vaccine，TBVs)經(jīng)典候選抗原，包括受精前的靶抗原如P48/45、P230，受精后的靶抗原P25以及蚊蟲中腸靶抗原[15]。P48/45傳播阻斷效果明顯，但其在體外無法形成正確空間結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致研究受阻。惡性瘧原蟲Pfs230抗體可在蚊胃阻斷瘧原蟲的發(fā)育，但是其阻斷活性依賴于補(bǔ)體，補(bǔ)體失活時，Pfs230抗體的阻斷活性消失[16，17]。受精后靶抗原P25為動合子表面蛋白，具有很強(qiáng)的免疫活性，但其存在有限的抗原多態(tài)性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，約氏瘧原蟲PP5重組蛋白免疫血清具有良好的免疫原性和抗原性，提示約氏瘧原蟲PP5蛋白可作為傳播阻斷疫苗候選抗原。有研究發(fā)現(xiàn)，伯氏瘧原蟲PP5免疫血清1∶5倍稀釋時可使配子體出絲數(shù)目和動合子轉(zhuǎn)化率減少[19]。而在本研究中，約氏瘧原蟲PP5免疫血清1∶5倍稀釋時使配子體出絲率和動合子轉(zhuǎn)化率分別下降29.89%和64.30%。上述研究結(jié)果提示，約氏瘧原蟲PP5免疫血清對配子體出絲、部分動合子的形成和成熟均有抑制作用。同時，本研究發(fā)現(xiàn)PyPP5免疫血清對蚊胃內(nèi)卵囊形成有抑制作用。以上結(jié)果說明PyPP5免疫血清對約氏瘧原蟲有性階段的生長發(fā)育有抑制作用。

綜上所述，本研究采用原核表達(dá)技術(shù)獲得約氏瘧原蟲PP5蛋白，并制備PyPP5特異性免疫血清。另外，本研究通過體外抑制實驗證實PyPP5免疫血清可以有效抑制有性階段原蟲的生長發(fā)育，從而為TBVs的研發(fā)提供了一定的實驗基礎(chǔ)。