林宇沛，李春燕，谷寧，周滿紅

遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎病風濕科1、心內科2、急診科3，貴州 遵義 563003

近年來，心腦血管疾病已上升成為人類死亡的主要原因，不管是在發(fā)展中國家還是在發(fā)達國家中其所占的死因比重均呈上升趨勢[1]。他汀類藥物通過抑制合成膽固醇的甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway，MVAP)中的限速酶3-羥甲基-3-3 甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR)，使血清中膽固醇水平降低，以此來阻止動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展，進而降低中危以上的心腦血管疾病人群的發(fā)病率和心腦血管疾病患者的死亡率。由于他汀類藥物在心腦血管疾病的一級和二級預防中均起著積極作用，因此心腦血管疾病指南推薦患者及中、高危人群長期服用這類藥物[2]。另外，他汀類藥物除降低血脂的效應外，還具有“多效性”[3]，包括內皮功能的改善、免疫調節(jié)、抗氧化等作用，因此長期使用他汀類藥物除了得到降低膽固醇所帶來的益處外，其多效性對人類的壽命和健康程度的影響亦尚未可知。秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans，C.elegans，以下簡稱“線蟲”)常被作為一種重要的模式生物用以評價藥物總體效益[4]。甲羥戊酸途徑在線蟲中高度保守，但是線蟲的甲羥戊酸途徑缺少膽固醇合成分支[5]，這使得線蟲成為研究他汀類藥物的非依賴膽固醇作用的理想模式生物。阿托伐他汀鈣是在臨床上常用的他汀類藥物，其分子式(C33H34FN2O5)2Ca·3H2O，分子量1 209.42[6]。因此本文選擇阿托伐他汀鈣為實驗藥物，從線蟲的壽命、咽泵及身體擺動、應激等各方面研究該藥物的非依賴膽固醇作用對機體的影響。

1 材料與方法

1.1 線蟲株和菌株 線蟲株：野生型線蟲N2 線蟲株，由中國科學院昆明植物研究所惠贈。菌株：大腸埃希菌OP50 (E. coli OP50) (以下簡稱OP50)；銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)，均由中國科學院昆明植物研究所惠贈。

1.2 儀器與藥品 體視顯微鏡7-45X：舜宇光學科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱：北京福意電器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9052：上海精宏實驗設備有限公司；離心機TDZ4-WS：長沙高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機有限公司。阿托伐他汀鈣：美國Sigma公司。

1.3 同期化處理及分組

1.3.1 同期化處理 同期化取蟲卵較多的培養(yǎng)皿用7 mL純水沖洗培養(yǎng)基上的蟲卵至離心管中，加3 mL裂解液，1 200 r/min離心2 min，棄上清，加10 mL純水，洗滌3 次，最后加入M9緩沖液(約9 mL)。孵化8～12 h后，1 800 r/min離心10 min，棄上清，沉淀即為L1期線蟲。

1.3.2 分組 對照組為不添加藥物的空白對照組，實驗組分別為阿托伐他汀鈣藥物濃度為0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L，因在預實驗中發(fā)現藥物濃度大于100 μmol/L 時，線蟲的壽命縮短，濃度低于0.1 μmol/L 后藥物對線蟲壽命及相關指標無影響，1 μmol/L 濃度下線蟲咽泵頻率及身體擺動頻率增強，因此選擇0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L這四個藥物濃度梯度進行試驗，以進一步了解低濃度藥物對線蟲壽命及相關指標的影響。

1.4 OP50 喂養(yǎng)的壽命實驗 將同期化后L1 期線蟲培養(yǎng)至L4 期后，每組隨機挑取線蟲置于平皿中，每組3個平皿，每個平皿約30條線蟲，記錄天數為第0天，每日觀察線蟲存活情況，當線蟲無運動且經鉑絲金刺激后10 s無反應視為死亡，挑出平皿，并記錄死亡數目，前5 d需每日將線蟲轉移到新平皿上，5 d后可隔日將線蟲轉至新平皿。若出現線蟲爬出培養(yǎng)基失蹤、因爬出培養(yǎng)基致死以及蟲卵在體內孵化壓迫內臟致死的情況將不記錄，上述實驗重復3次。

1.5 PA 喂養(yǎng)的壽命實驗 使用PA 喂養(yǎng)線蟲，其余同OP50喂養(yǎng)的壽命實驗。

1.6 熱應激實驗 將各組線蟲培養(yǎng)5 d 后置于35℃環(huán)境下培養(yǎng)12 h，每2 h 觀察其死亡數目，死亡的線蟲挑出平皿并記錄(死亡標準同前)，直到全部線蟲死亡。上述實驗重復3次。

1.7 咽泵頻率和身體擺動頻率測量

1.7.1 咽泵頻率測定 與壽命實驗同時進行，當生存天數為第1 天時開始，每隔2 d 測一次，各組隨機選擇15 條線蟲在放大100 倍視野下，計時20 s 觀察其咽泵運動次數，上述實驗重復3次。

1.7.2 身體擺動頻率測定 與壽命實驗同時進行，當生存天數為第1天時開始，每2 d測一次，在將線蟲轉板時轉至未加細菌的各組NGM 平皿中，后加入100 μL稀釋后菌液，各組隨機選擇15條線蟲計時20 s觀察其身體擺動次數(頭部或尾部來回算1次)，上述實驗重復3次。

1.8 生殖實驗和生殖應激實驗

1.8.1 生殖實驗 生殖實驗將同期化后的線蟲培養(yǎng)至L4期幼蟲，每組15個平皿，每個平皿中隨機挑取1條線蟲，連續(xù)轉3 d，每日轉板，待蟲卵發(fā)育至成蟲后計數各組每個平皿上的線蟲數量，上述實驗重復3次。

1.8.2 生殖應激實驗 生殖應激實驗在生殖實驗的基礎上每日轉板后將線蟲置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min。余同普通環(huán)境培養(yǎng)。

1.9 統計學方法 采用SPSS18.0 統計軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±±s)表示；壽命實驗及熱應激實驗均繪制Kaplan-Mmeier 生存曲線，采用Log-rank檢驗進行生存分析；咽泵頻率和身體擺動頻率的比較采用SNK檢驗；產卵量的比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OP50喂養(yǎng)下的壽命實驗 各組線蟲壽命如圖1和表1所示。不同濃度的阿托伐他汀鈣組線蟲的平均壽命改變率與對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

圖1 OP50喂養(yǎng)下不同濃度阿托伐他汀鈣對線蟲生存曲線的影響

表1 OP50喂養(yǎng)下不同濃度阿托伐他汀鈣對線蟲壽命的影響

2.2 PA 喂養(yǎng)的壽命實驗 在使用PA 作為食物來源的情況下，各組線蟲壽命見圖2和表2。0.5 μmol/L、1 μmol/L 以及10 μmol/L 組線蟲的平均壽命改變率與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.3 阿托伐他汀鈣對線蟲熱應激壽命的影響 在35℃的環(huán)境下，各組線蟲壽命如表3 所示。在熱應激的情況下，0.5 μmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L組線蟲的平均壽命改變率與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4 咽泵頻率 各濃度組線蟲咽泵頻率在各時間點的變化如圖3 所示。0.5 μmol/L 和1 μmol/L 組的咽泵頻率分別與對照組比較均增快，差異均有統計學意義(P<0.05)。

表2 PA喂養(yǎng)下不同濃度阿托伐他汀鈣對線蟲壽命的影響

圖2 PA喂養(yǎng)下不同濃度阿托伐他汀鈣對線蟲生存曲線的影響

表3 熱應激時不同濃度阿托伐他汀鈣對線蟲壽命的影響

圖3 不同濃度阿托伐他汀鈣對線蟲咽泵頻率的影響

2.5 身體擺動頻率 對照組、1μmol/L組、10μmol/L組和100 μmol/L 組線蟲身體擺動頻率各時間點的變化如圖4 所示。0.5 μmol/L 組和1 μmol/L 組的身體擺動頻率分別與對照組比較均增快，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖4 不同濃度阿托伐他汀鈣對線蟲身體擺動頻率的影響

2.6 生殖實驗 各組線蟲產卵量如圖5所示。各組線蟲的產卵量分別為(209.13±22.53)個、(224.93±31.06)個、(222.33±26.64)個、(220.13±33.98)個，與對照組的(223.6±29.39)個比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

圖5 不同濃度阿托伐他汀鈣對線蟲產卵量的影響

2.7 生殖應激實驗 在熱應激的條件下，各組線蟲產卵量如圖6 所示。0.1 μmol/L、0.5 μmol/L 組的產卵量與對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。1 μmol/L、10μmol/L組的產卵量與對照組相比，分別增加了16.19%和18.16%，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

圖6 熱應激條件下不同濃度阿托伐他汀鈣對線蟲產卵量的影響注：與對照組比較，aP<0.05。

3 討論

BAIGENT 等[7]的臨床研究發(fā)現人類使用他汀類藥物后全因死亡率降低10%。SPINDLER 等[8]發(fā)現辛伐他汀可通過減少果蠅體內蛋白質的異戊二烯化來延長果蠅的平均壽命。M?RCK 等[9]使用氟伐他汀處理線蟲后使其呼吸頻率降低，從而使其平均壽命增加14%。本研究中，在普通的培養(yǎng)條件下，實驗組與對照組相比線蟲平均壽命并沒有延長，不過在其壽命的中期階段1 μmol/L 組線蟲咽泵頻率及身體擺動頻率的增齡性衰減與對照組相比有所延緩。CATARINA等[10]發(fā)現他汀類藥物抑制HMGR后，蛋白質的異戊二烯化減少了，由此未折疊的蛋白積累，進一步引起內質網非折疊蛋白反應(endoplasmic reticulum unfolded protein response，UPRer)。內質網應激反應是細胞對內質網蛋白累積的一種適應性應答方式，細胞通過減少蛋白質合成，促進蛋白質降解，增加幫助蛋白質折疊的分子伴侶等方式緩解內質網壓力，適當的應激能讓細胞更加健康，但內質網應激反應過強或持續(xù)時間過長超過細胞自身調節(jié)能力時就會傷害細胞[11]。因此推測1 μmol/L組的線蟲壽命中期階段增齡性衰減的咽泵頻率和身體擺動頻率和對照組相比衰減地更加緩慢的原因，可能是累積的無效蛋白激活線蟲的UPRer剛好能延緩線蟲的這些增齡性生理改變，然而隨著無效蛋白持續(xù)累積，其激活的UPRer強度和時間長度不再對線蟲起保護作用，甚至可能會對線蟲造成損傷。

KIRIENKO等[12]認為在銅綠假單胞菌對線蟲致死性部分原因是由于細菌定居于線蟲腸腔產生的活性氧中間產物對寄宿部位進行損害。在以銅綠假單胞菌作為食物的條件下以及在熱應激的情況下，1 μmol/L 和10 μmol/L 組線蟲的平均壽命均有延長。YANG 等[13]在大鼠試驗中證實了辛伐他汀較強的抗氧化的能力。研究顯示，他汀類藥物的輻射防護作用是由于抑制了幾種炎性激酶[14]。LU 等[15]認為他汀類藥物在小鼠的急性缺血/再灌注損傷中有著神經保護作用。因此在銅綠假單胞菌及熱休克的應激情況下實驗組線蟲的生存時間較對照延長，可能是因為藥物的抗氧化、抑制炎性激酶及神經保護的作用。

KHODAKARAMI 等[16]認為部分藥物通過掠奪生殖資源的分配來延長線蟲壽命。在普通條件下培養(yǎng)時各實驗組線蟲的生殖能力與對照相比無差異，而在熱應激情況下，1 μmol/L和10 μmol/L組線蟲生殖能力與對照組相比更強。因此可以推測在應激條件下阿托伐他汀鈣并非通過掠奪線蟲的生殖資源來延長壽命，相反，在應激情況下他汀對線蟲的生殖還有保護作用。

心血管疾病預防指南指出他汀類藥物可用于更多的適應證[17]，這意味著他汀類藥物的應用將會更加廣泛。由于患者需要長期服用他汀類藥物，在得益于他汀類藥物降脂帶來的作用時，藥物的非膽固醇依賴性作用對人類的壽命和總體健康程度的影響值得研究。

綜上所述，低濃度的阿托伐他汀鈣可以延緩線蟲咽泵和身體擺動頻率的衰減，低、中濃度的藥物可以提高線蟲對抗應激的能力。低、中濃度的阿托伐他汀鈣不會影響線蟲的壽命、發(fā)育及生殖。因此，推測長期服用低劑量的阿托伐他汀鈣引起的非膽固醇依賴性作用可能不會縮短人類的壽命，還可能會提高其健康水平。