劉慧云，謝強(qiáng)，涂忠亮

豐城市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，江西 宜春 331100

2 型糖尿病是一種代謝疾病，主要病因是由于肥胖導(dǎo)致身體對胰島素產(chǎn)生抗性[1]。二甲雙胍是治療2型糖尿病的有效藥物，具有耐受性好、廉價和口服使用的優(yōu)點(diǎn)[2-3]。二甲雙胍通過抑制肝臟產(chǎn)生葡萄糖的過程，并且提高身體對胰島素的敏感性，達(dá)到降低血糖的療效[4-5]。腸道菌群對身體代謝過程有著重要影響。對人和對小鼠的研究都發(fā)現(xiàn)，身體增肥過程中，腸道中厚壁菌門微生物占比升高而擬桿菌門微生物占比相對降低[6-7]。在接受胃旁路手術(shù)的人的腸道中，普氏菌屬微生物豐度在肥胖個體腸道內(nèi)會大幅升高[8]。有研究報道，在益生元喂養(yǎng)的小鼠腸道種雙歧桿菌屬微生物的數(shù)量增加有助于小鼠的葡萄糖耐受性，也有助于降低炎癥水平[9-10]。而對1 型糖尿病大鼠腸道微生物的研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬微生物增多時糖尿病癥狀更容易惡化[11]，而乳酸桿菌屬微生物不僅和肥胖相關(guān)，還被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)腸道中的免疫反應(yīng)[12-13]。綜合來看，腸道菌群可通過調(diào)整體內(nèi)脂類物質(zhì)的代謝、葡萄糖的吸收水平、膽汁酸受體的表達(dá)以及體內(nèi)炎性反應(yīng)的程度來影響糖類、脂類物質(zhì)的代謝[22]，可以推測腸道菌群既能夠一定程度上反映代謝狀態(tài)，也能夠通過影響代謝從而促進(jìn)或者抑制糖尿病的發(fā)展。本研究則利用16S測序手段調(diào)查使用二甲雙胍治療2 型糖尿病過程中腸道菌群的變化情況，并重點(diǎn)分析其中梭菌屬、普氏菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬等代謝相關(guān)的腸道菌群微生物豐度的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF 級ICR 雄性小鼠20 只(5 周齡，22 g左右)由江西中醫(yī)藥大學(xué)提供。

1.2 主要試劑 四氧嘧啶(629C021，Solarbio)；鹽酸二甲雙胍(621E024，Solarbio)；Zon Reagent TRIzon總RNA提取試劑盒(1714D，CWBIO)。

1.3 動物造模 SPF 級ICR 雄性小鼠9 只，體質(zhì)量22 g左右，隨機(jī)選3只作為對照組(BMCK、M2WCK和M42CK)，其余6只高糖高脂飲食飼養(yǎng)4周后腹腔注射四氧嘧啶溶液180 mg/kg，3 d 后測小鼠空腹血糖。以空腹血糖大于11.1 mmol/L 為糖尿病小鼠造模成功[14-15]。糖尿病小鼠隨機(jī)均分為二甲雙胍治療組(BMMet、M2WMet 和M42Met) 和 模 型 組(BMMod、M2WMod 和M42Mod)。二甲雙胍治療組給與每日兩次二甲雙胍600 mg/mL 灌胃，對照組和模型組給與生理鹽水灌胃。4周后取糞便提取微生物總RNA。

1.4 RNA提取 向小鼠糞便種加入PBS，勻漿后制成懸濁液，用篩子過濾掉渣滓。100×g離心3 min后留沉淀，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸清洗，如此離心重懸2次后得到再次離心收集沉淀的微生物，加入TRIzon，根據(jù)試劑盒說明書提取微生物總RNA，得到總RNA后加入RNA酶抑制劑后寄往高通量測序公司。

1.5 數(shù)據(jù)分析 使用QIIME軟件，調(diào)用UCLUST這一序列比對工具，高通量測序所得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU 劃分，并選取每個OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，然后比對RDP (Ribosomal Database Project)數(shù)據(jù)庫得到分類鑒定結(jié)果。隨后，根據(jù)每個OTU在每個樣本中所包含的序列數(shù)，構(gòu)建OTU在各樣本中豐度的矩陣文件[16-17]。

微生物分類進(jìn)化等級樹是通過使用GraPhlAn 軟件將每個樣本所含有的OTU 的豐度信息和分類學(xué)組成數(shù)據(jù)映射至NCBI Taxonomy 所提供的微生物分類等級樹而得到的[18]。

PCA分析通過線性變換，將原始的高維數(shù)據(jù)(如菌群OTU 豐度矩陣)通過線性變換組合，投影到維度較低的空間坐標(biāo)系(即主成分)中，從而達(dá)到降維、簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的目的，展現(xiàn)樣本的自然分布[19]。PCA 分析能夠從原始數(shù)據(jù)中提取樣本間最主要的差異特征，并根據(jù)這些差異特征將樣本在新的低維坐標(biāo)系中依次排序，使得樣本在新坐標(biāo)系中的距離遠(yuǎn)近能在最大程度上還原樣本間的實(shí)際差異。通過R 軟件對PCA 分析得到的二維數(shù)據(jù)作圖，可以得知群落樣本的主要分布特征，從而量化樣本間的差異和相似度。

2 結(jié)果

2.1 腸道微生物16S 測序定性分析結(jié)果 可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)指根據(jù)序列相似度設(shè)置閾值，將測序得到的各樣本的序列進(jìn)行歸并，彼此間相似度高于該閾值的序列都將歸并為一個OTU。目前大多數(shù)基于16S rRNA基因的菌群結(jié)構(gòu)多樣性研究中，通常都以97%的序列相似度作為OTU 劃分閾值，該閾值大致相當(dāng)于分類學(xué)中物種(Species)水平的序列差異。

將豐度值低于全體樣本測序總量0.001% (1/100 000)的OTU 去除后進(jìn)行OTU 劃分并對分類地位[21]鑒定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，見表1。

表1 腸道微生物16S測序分類鑒定統(tǒng)計

對OTU 豐度矩陣中每個樣本的序列總數(shù)在不同深度下隨機(jī)抽樣，以每個深度下抽取到的序列數(shù)及其對應(yīng)的OTU數(shù)繪制稀疏曲線。如圖1所示，圖中各樣品曲線隨測序深度增加已經(jīng)變得平緩，表明測序結(jié)果已足夠反映當(dāng)前樣本所包含的多樣性。

腸道微生物分類進(jìn)化等級樹分析結(jié)果如圖2所示。在門水平豐度最高的是A.厚壁菌門(Firmicutes)，K.擬桿菌門(Bacteroidetes)次之。在屬水平豐度最高的是J.乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，F(xiàn).異桿菌屬(Allobaculum)次之。

2.2 腸道微生物豐度比較 各樣本在門分類水平所含有的微生物類群數(shù)量，如圖3所示；各樣本在屬分類水平所含有的微生物類群數(shù)量，如圖4所示；總體豐度前50 位的屬在各組樣品中豐度水平，如圖5 所示。3個糖尿病模型組小鼠腸道微生物中都出現(xiàn)了乳酸桿菌屬微生物顯著減少的情況，而其中兩個出現(xiàn)了Allobaculum屬微生物增多的情況；而3 個二甲雙胍治療糖尿病組小鼠腸道微生物中都出現(xiàn)了乳酸桿菌屬微生物恢復(fù)性增多的現(xiàn)象。

圖1 稀疏曲線(Rarefaction curve)

圖2 分類等級樹

圖3 門水平分類學(xué)組成和分布圖

圖4 屬水平分類學(xué)組成和分布圖

圖5 總體豐度前50位的屬在各組樣品中豐度水平

圖6 組間PCA分析

2.3 代謝相關(guān)的腸道微生物變化情況比較 將每組的三只小鼠的腸道微生物豐度數(shù)據(jù)取平均值，然后對三組的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，組間PCA 分析結(jié)果見圖6。根據(jù)文獻(xiàn)選擇了梭菌屬、擬桿菌-普氏菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬等代謝相關(guān)的腸道微生物種群進(jìn)行組間豐度變化情況分析，根據(jù)PCA 分析結(jié)果，每個屬的微生物中選擇組間差異最大的兩種微生物，篩選出的微生物在組間豐度變化情況見表2～表6。其中梭菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬微生物出現(xiàn)了二甲雙胍處理組的微生物豐度在對照組和模型組之間的情況。

表3 擬桿菌-普氏菌屬(Bacteroides-Prevotella)差異情況

表2 梭菌屬(Clostridium)差異情況

表5 乳酸桿菌屬(Lactobacillus)差異情況

表4 擬桿菌屬(Bacteroides)差異情況

表6 雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)差異情況

3 討論

本研究試圖增加對兩個問題的了解，一是對糖尿病模型組小鼠的腸道微生物和對照組小鼠的正常腸道微生物進(jìn)行比較，研究糖尿病造模導(dǎo)致模型小鼠血糖水平保持在偏高的狀態(tài)下對腸道微生物的影響；二是對糖尿病模型組小鼠腸道微生物和接受二甲雙胍灌胃給藥的糖尿病小鼠腸道微生物進(jìn)行比較，研究二甲雙胍灌胃給藥而降低血糖水平的條件下有哪些微生物的豐度更接近正常組的狀態(tài)，并且研究二甲雙胍本身對小鼠的腸道微生物是否有顯著的影響。

從各腸道菌群樣本在門分類水平所含有的微生物類群數(shù)量可以發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門是豐度最高的一塊，占總微生物80%以上的比例。三只模型組小鼠相對于正常組小鼠，都出現(xiàn)了厚壁菌門微生物占比降低而擬桿菌門微生物占比升高的現(xiàn)象。二甲雙胍治療組小鼠相對于模型組小鼠，有2 只小鼠出現(xiàn)了厚壁菌門微生物占比上升而擬桿菌門微生物占比下降的現(xiàn)象，可以認(rèn)為這2 只二甲雙胍治療組小鼠的厚壁菌門和擬桿菌門微生物豐度水平向正常組的狀態(tài)轉(zhuǎn)化。而二甲雙胍治療組的另一只小鼠出現(xiàn)了擬桿菌門微生物占比下降的現(xiàn)象，但是疣微菌門(Verrucomicrobia)的微生物占比大幅上升，厚壁菌門微生物占比變化幅度不大。其他研究中發(fā)現(xiàn)腸道微生物中厚壁菌門微生物占比升高而擬桿菌門微生物占比降低有助于身體肥胖[6]，本實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病造模對厚壁菌門和擬桿菌門微生物的占比有著相反的效果，可以推測糖尿病狀態(tài)下身體保持高血糖水平，糖分轉(zhuǎn)化為脂肪過程受抑制等代謝狀態(tài)也反映到腸道微生物豐度水平上。

進(jìn)一步細(xì)化到屬分類水平，可以發(fā)現(xiàn)相對于正常組，3 個糖尿病模型組小鼠腸道微生物中都出現(xiàn)了乳酸桿菌屬(屬于厚壁菌門)微生物顯著減少的情況，而3個二甲雙胍治療糖尿病組小鼠腸道微生物中都出現(xiàn)了乳酸桿菌屬微生物恢復(fù)性增多的現(xiàn)象。在各個樣品中乳酸桿菌屬微生物的豐度在厚壁菌門微生物中數(shù)一數(shù)二，可以認(rèn)為乳酸桿菌屬微生物在菌群變化中起著決定性的作用。而在M4WMet 小鼠腸道微生物中占比大幅上升的疣微菌門微生物基本上是阿克曼西亞屬(Akkermansia)微生物。有研究報道，二甲雙胍給藥的肥胖小鼠腸道微生物中阿克曼西亞屬屬和梭菌屬微生物占比顯著上升，而且具有抑制脂肪代謝過程的效果[20]。本研究在進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析中選擇了梭菌屬、擬桿菌-普氏菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬等與肥胖或者糖尿病相關(guān)的腸道微生物種群進(jìn)行組間豐度變化情況分析，根據(jù)PCA分析結(jié)果每個屬的微生物中選擇組間差異最大的兩種微生物，篩選出的微生物在組間豐度變化情況顯示其中梭菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬微生物出現(xiàn)了二甲雙胍處理組的微生物豐度在對照組和模型組之間的情況，也就是說二甲雙胍給藥讓糖尿病小鼠腸道中梭菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬微生物豐度向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變，可以推測這三個屬的微生物與二甲雙胍治療糖尿病的過程有較高的相關(guān)性。

綜上所述，受二甲雙胍影響，糖尿病小鼠腸道菌群微生物會更傾向抑制脂肪代謝減輕肥胖，達(dá)到有利于減輕糖尿病的效果。而梭菌屬、擬桿菌屬和乳酸桿菌微生物可以作為二甲雙胍對腸道菌群影響的標(biāo)志性微生物。