陳曉霞，顏世果，李玉蘭

1.陜西省康復(fù)醫(yī)院口腔科，陜西 西安 710065；2.山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周科 山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250012

牙周病是危害人類健康的三大疾病之一。目前牙周病雖然可以通過系統(tǒng)的牙周治療取得良好的炎癥控制和功能改善[1-3]，但牙槽骨一旦發(fā)生吸收就很難重建，這也是很多牙周炎患者最終拔牙的主要原因。為尋找一種因子在基因水平上調(diào)控牙槽骨組織的再生，從而使缺失的牙周支持組織得以重建已成為研究者們努力奮斗的方向。

特殊富含AT 序列結(jié)合白2 (special AT-rich sequence binding protein2，Satb2)是近十年來研究的熱點(diǎn)基因，它是一種核基質(zhì)蛋白，同時(shí)也是具有高活性的轉(zhuǎn)錄因子。已有研究發(fā)現(xiàn)在牙周創(chuàng)傷的小鼠模型中植入Satb2 過表達(dá)的牙囊細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)組織學(xué)檢查均可觀察到小鼠牙周缺損區(qū)骨質(zhì)的再生和創(chuàng)傷愈合能力的增強(qiáng)，說明Satb2 蛋白在牙周創(chuàng)傷愈合的過程中起到了一定的促進(jìn)作用[4]。但國(guó)內(nèi)外對(duì)Satb2基因在牙周組織再生中的作用研究還是非常少，仍需要進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建Satb2慢病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究該基因在牙周組織再生中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pBS-SK-Satb2、293T細(xì)胞(山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)；pLenti6.3-IRES2-EGFP/V5 DEST 及包裝質(zhì)粒Mix (美國(guó)Invitrogen)；E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)菌(全式金公司)；Marker DL5000、Marker 15000、質(zhì)粒大量提取純化試劑盒、多功能凝膠回收試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；限制性內(nèi)切酶PacⅠ和AscⅠ、T4DNA Ligase (Fermentas 公司)；POLOdelivererTM3000轉(zhuǎn)染試劑(上海銳賽生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Satb2 基因引物設(shè)計(jì)與合成 參照Gen-Bank中目的基因Satb2 (NM-139146)序列設(shè)計(jì)PCR引物，同時(shí)在Satb2基因的上下游分別添加酶切位點(diǎn)PacⅠ和AscⅠ，上游引物為：5'-CTGTCATTAATTAAGCCAC CATGGAGCGGCGGAGCG-3'，下游引 物為：5'-TCTACGGCGCGCCTTATCTCTGGTCGGTTTCGGC-3'，引物序列中添加的酶切位點(diǎn)PacⅠ和AscⅠ分別用紅色字體標(biāo)出。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增 以攜帶目的基因的質(zhì)粒pBS-SK-Satb2 為模板擴(kuò)增目的基因Satb2，參照說明書配制PCR反應(yīng)體系，該循環(huán)體系如表1所示，循環(huán)結(jié)束后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒回收所需的目的片段。

1.2.3 重組慢病毒載體連接構(gòu)建 Satb2 基因PCR產(chǎn)物和慢病毒載體分別用PacⅠ和AscⅠ進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳分離酶切片段，回收目的片段。酶切后的PCR產(chǎn)物及目的載體通過T4DNA ligase 連接，配置連接體系如下：10×T4連接酶緩沖液1 μL，PCR-酶切產(chǎn)物3 μL，pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP 酶切產(chǎn)物2 μL，T4連接酶1 μL，補(bǔ)ddH2O至10 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α后，涂布于LA 平皿上過夜培養(yǎng)。第二日，挑取孤立的，圓滑的單菌落進(jìn)行菌落PCR 實(shí)驗(yàn)，將鑒定結(jié)果呈陽(yáng)性的克隆再接種到LB 液體培養(yǎng)基中，搖菌過夜，次日抽提質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。將菌落PCR和酶切鑒定結(jié)果均呈陽(yáng)性的單克隆重組慢病毒載體送測(cè)序，并進(jìn)行基因序列比對(duì)，測(cè)序工作由寶生物工程有限公司完成。

表1 目的基因PCR循環(huán)體系

1.2.4 病毒包裝與濃縮 提取重組慢病毒質(zhì)粒pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP，濃度保證在1 μg/μL 以上，DNA 的A260/A280在1.8～2.0。取兩支無菌離心管分別加入1.5 mL Opti-MEM，一只管內(nèi)加入載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒Mix 各6 μg，另一支管內(nèi)加入POLOdelivererTM3000 轉(zhuǎn)染試劑24 μL，輕輕混勻，室溫孵育5 min，之后再將兩管液體混合，并輕輕顛倒混勻，靜置孵育20 min。取3 mL 混合液均勻滴加在狀態(tài)良好的293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于48 h、72 h、80 h后收集細(xì)胞上清液，先于4℃、3 000 r/min 離心10 min，其上清液經(jīng)0.45 μm 膜濾器輕輕過濾于離心管中，再經(jīng)4℃、22 000 r/min 離心2 h，棄上清液，沉淀用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底溶解，最后收集至1.5 mL EP 管內(nèi)，分裝存于-80℃冰箱。通過采用熒光顯微鏡觀察法來測(cè)定慢病毒滴度。

1.2.5 病毒感染293T細(xì)胞 感染前1 d取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T 細(xì)胞以5×104密度接種于12 孔培養(yǎng)板中，使轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度達(dá)到80%左右。實(shí)驗(yàn)分為三組：A，重組慢病毒感染組；B，空載體感染組；C，未感染細(xì)胞對(duì)照組。A、B 組分別加入100 μL 重組慢病毒液和對(duì)照病毒液，同時(shí)加入終濃度為8 μg/mL 的Polybrene促進(jìn)感染，感染24 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，感染72 h后觀察各組熒光表達(dá)情況。

1.2.6 qPCR 法檢測(cè)目的基因 將感染72 h 后的293T細(xì)胞利用Trizol法提取mRNA，經(jīng)DNaseI處理后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后采用qPCR 檢測(cè)目的基因Satb2的表達(dá)，引物設(shè)計(jì)如表2。

表2 目的基因qPCR引物設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒菌落PCR 鑒定 挑取經(jīng)篩選后呈單克隆生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳得到一條約2 202 bp的亮帶，與目的基因長(zhǎng)度相符，見圖1。

圖1 pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP重組載體菌落PCR鑒定

2.2 重組慢病毒酶切鑒定 重組慢病毒載體pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP 用PacⅠ和AscⅠ對(duì)其進(jìn)行雙酶切，最終得到兩條亮帶，大片段約9.1 kb，小片段約2 202 bp，與目的基因相符，見圖2。

圖2 pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP酶切鑒定

2.3 測(cè)序結(jié)果 將菌落PCR 和酶切鑒定結(jié)果均呈陽(yáng)性的重組慢病毒載體送測(cè)序，并進(jìn)行基因序列比對(duì)，結(jié)果顯示，Satb2 基因序列與GenBank 報(bào)道的序列完全一致，見圖3。

圖3 Satb2測(cè)序圖

2.4 慢病毒包裝及滴度測(cè)定結(jié)果 重組慢病毒pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP 及空載體分別與包裝質(zhì)粒Mix共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，收集、濃縮病毒液，取其中一支病毒液10 倍倍比稀釋后分別感染293T 細(xì)胞，感染72 h 后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并選取合適的孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)熒光顯微鏡觀察法的測(cè)定公式計(jì)算出重組慢病毒滴度為7.9×107ifu/mL，空載體慢病毒滴度為1×108ifu/mL。

2.5 慢病毒感染293T細(xì)胞結(jié)果 重組慢病毒(A組)及空載體慢病毒(B組)感染293T細(xì)胞72 h后，在熒光顯微鏡下可以觀察到大量熒光，感染效率達(dá)到70%左右，未感染組(C組)細(xì)胞未見熒光表達(dá)，見圖4～6。

圖4 重組慢病毒感染293T細(xì)胞（A組）

2.6 目的基因Satb2 的表達(dá) 慢病毒感染293T細(xì)胞72 h 后，利用qPCR 檢測(cè)目的基因Satb2 的表達(dá)，結(jié)果顯示A 組Satb2 mRNA 的表達(dá)量增加了約106倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而B 組和C 組目的基因的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖7。

圖6 正常293T細(xì)胞（C組）

圖7 目的基因檢測(cè)

3 討論

Satb2 是一種新型特殊富含AT 序列的DNA 結(jié)合蛋白，它可以與核基質(zhì)附著區(qū)(nuclear matrix regions，MARs)結(jié)合并能以MAR依賴的方式同時(shí)激活多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄[5-6]。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)Satb2作為一個(gè)高級(jí)調(diào)控因子同時(shí)參與了多種重要組織的生物學(xué)過程，如在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育；顱面形態(tài)的形成、發(fā)育；成骨細(xì)胞的分化、成熟；上腭的形成以及腫瘤的發(fā)生等方面都起著重要作用[7-10]。尤其在骨骼發(fā)育過程中，Satb2不僅可以通過調(diào)節(jié)多種特異性成骨基因的轉(zhuǎn)錄來影響骨組織的形成，而且還可以通過協(xié)同作用增強(qiáng)其他轉(zhuǎn)錄因子如runx2、osx、Atf4的活性來調(diào)節(jié)骨發(fā)生和成骨細(xì)胞分化[11-13]，說明Satb2在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨再生的過程中是一個(gè)強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)錄因子。DOWREY等[14]通過研究推測(cè)Satb2 可能通過兩種機(jī)制調(diào)節(jié)骨的增殖，首先Satb2 可能調(diào)節(jié)前成骨細(xì)胞周期變換所必需基因的表達(dá)；第二，與其他MAR 結(jié)合蛋白類似，Satb2 可能參與DNA 復(fù)制。Satb2-/-基因敲除小鼠表現(xiàn)出下頜遠(yuǎn)端骨骼發(fā)育不全，出生時(shí)，缺乏Satb2 的小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重下頜后縮并死于腭裂[15]。張瑾[4]研究發(fā)現(xiàn)，Satb2 在牙胚中表達(dá)，說明Satb2在牙齒、牙周組織發(fā)育中也起著一定作用。在模擬牙周創(chuàng)傷的小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)Satb2 能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、牙囊細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，從而促進(jìn)小鼠牙周創(chuàng)傷區(qū)的愈合[4]，同樣過表達(dá)Satb2的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能顯著增強(qiáng)牙科種植體周圍新骨的形成和骨密度[16]，由此說明Satb2 在牙周組織骨再生中發(fā)揮了一定作用。BANě?KOVá等[17]發(fā)現(xiàn)在牙齦區(qū)的骨化和部分非骨化的外周口腔纖維瘤中可檢測(cè)到Satb2 的表達(dá)，可推斷Satb2 在牙周來源的纖維瘤變過程中也發(fā)揮作用。另外，Satb2 相關(guān)綜合征是一種新近被描述的臨床綜合征，其特征表現(xiàn)為發(fā)育遲緩/智力殘疾、語言發(fā)育缺失或受限、顱面異常(包含腭部和牙齒異常)、行為問題和畸形特征等[18-19]。Satb2 基因異常的患者口腔臨床表現(xiàn)可以有牙齒遲萌、夜磨牙、流涎、過大牙等癥狀；影像學(xué)表現(xiàn)則有牙根形成延遲、嚴(yán)重遲萌或第二雙尖牙缺失、畸形牙和牛牙癥等[20]，說明Satb2 基因異常影響人類牙齒的形成和發(fā)育。盡管現(xiàn)有的研究已經(jīng)證實(shí)Satb2 在牙齒發(fā)育、牙周組織骨再生等方面發(fā)揮了一定作用，但其能否作為牙周組織再生的理想因子仍需要進(jìn)一步探討和研究。

本實(shí)驗(yàn)通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增出目的基因Satb2，然后利用PacⅠ和AscⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)將其插入到慢病毒pLenti6.3-IRES2-EGFP/V5 DEST 之中，從而成功構(gòu)建了攜帶Satb2 基因的慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP。該慢病毒經(jīng)過包裝、濃縮，病毒濃度達(dá)到7.9×107ifu/mL，我們利用病毒液感染293T細(xì)胞后可以觀察到大量熒光，并檢測(cè)出目的基因mRNA的過表達(dá)，說明我們包裝出的病毒顆粒具有感染活性，從而為進(jìn)一步研究目的基因Satb2 在牙周組織再生過程中所起的作用奠定了基礎(chǔ)。