高松柏，劉 峰,2，詹 煒,2，樓 寶,2

(1.浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院水生生物研究所，浙江杭州 310021)

類胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGFs)是一類進化上保守的多肽，因其在結(jié)構(gòu)功能上與胰島素類似被稱為IGFs[1]。IGFs 在許多組織中都可以合成，在生物體中具有調(diào)節(jié)合成代謝、促進細胞的分化和分裂、抑制細胞凋亡以及調(diào)控生長發(fā)育和生殖過程等多種功能[2-5]。在魚類中，IGF 主要在肝臟中合成，在其他的一些組織器官中也有表達，通過自分泌和旁分泌方式釋放[6]。研究表明，IGF-1 對魚類具有生長調(diào)節(jié)的作用，并且通過影響血漿滲透壓、離子濃度、鰓絲Na+/K+-ATP 酶活性等參與滲透壓調(diào)解[7]。近幾年來，IGFs 基因的研究已經(jīng)在許多魚類中進行，如大黃魚Larimichthys crocea[8]、哲羅鮭Hucho taimen[9]、金魚Carassius auratus var.[10]、大西洋鮭Salmo salar[11]、大菱鲆Scophthalmus maximus[12]、金錢魚Scatophagus argus[13]、黃顙魚Pelteotagrus fulodraco[14]等。

大黃魚L.crocea 和小黃魚L.polyactis 是我國重要的海水經(jīng)濟魚類，營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)鮮美，深受廣大消費者喜愛。但是，由于過度捕撈、環(huán)境變化等原因，大黃魚的野生資源極其稀少，其養(yǎng)殖群體品質(zhì)下降，經(jīng)濟效益明顯降低[15]；小黃魚性早熟、日趨小型化現(xiàn)象日益明顯[16,17]，在小黃魚的養(yǎng)殖過程中，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖群體同樣存在個體小型化的現(xiàn)象。因此，對兩種魚進行遺傳改良意義重大。雜交育種是一種重要的遺傳改良技術(shù)手段之一[18]，我們實驗室通過人工控溫、控光及營養(yǎng)強化等方法促使小黃魚和大黃魚親魚性腺發(fā)育同步，采用人工催產(chǎn)授精的方式進行小黃魚雌魚與大黃魚雄魚的種間雜交，成功獲得雜交F1 代個體[19]。研究發(fā)現(xiàn)，15 月齡時，生長速度大于小黃魚而小于大黃魚，由此可知，在生長方面，雜交子代表現(xiàn)出了雜種優(yōu)勢[20]。雖然雜種優(yōu)勢的形成很大程度上取決于雜交F1 代的基因及其互作，但必須經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和表達為蛋白質(zhì)后才能對性狀起作用。SUN Ying，et al[21]研究指出GH/IGF 生長軸與雜交F1 優(yōu)勢性狀的形成具有明顯聯(lián)系。

為探討小黃魚與大黃魚雜交子代與雙親在生長相關(guān)性狀的基因差異表達，本次研究通過熒光定量PCR 技術(shù)檢測了IGF-1 基因在3 種魚15 月齡時不同組織中mRNA 表達差異情況，從分子水平上研究雜交子代與親本之間在生長性狀上的變化，進而探討IGF-1 基因與雜交F1 表現(xiàn)出的雜種優(yōu)勢的相關(guān)性。本次研究將為雜交F1 雜種優(yōu)勢研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為從基因水平的遺傳育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用大黃魚、小黃魚和雜交子代個體取自浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗場。3 種魚在相同的養(yǎng)殖環(huán)境下進行培育。養(yǎng)殖至15 月齡時，選取形態(tài)、體色均正常、健康無傷的3 種魚，雌雄個體各5 尾，測定體質(zhì)量(g)后，冰凍致死，快速解剖取腦、肝臟和肌肉組織置于RNA 保存液保存，備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA 提取和cDNA 第一鏈合成

采用TransZol 法提取各組織總RNA。利用NanoDrop 2000 測定RNA 濃度以及OD260/280，并通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。利用gDNA Remover(全式金，中國)去除基因組DNA，cDNA 第一鏈合成利用5×TransScript All-in-One SuperMix for qPCR 反轉(zhuǎn)錄酶(全式金，中國) 在eppendorf nexus PCR 儀(Eppendorf，德國)完成。反應(yīng)程序85 ℃15 min，10℃5 min。

1.2.2 引物設(shè)計

參考大黃魚(登錄號：NM_001303334.1)、小黃魚(小黃魚基因測序結(jié)果注釋獲得)的IGF-1 CDS 序列，以β-actin 作為內(nèi)參，用Primer Premier 6 軟件設(shè)計熒光定量特異性引物，所用引物由金維智生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 IGF-1 qPCR 引物序列Tab.1 qPCR primer sequences of IGF-1

1.2.3 PCR 產(chǎn)物測序和分析

利用用于熒光定量的引物對3 種魚進行PCR 擴增，驗證擴增產(chǎn)物的差異性，使用2×EasyTaq PCR SuperMix (+dye)試劑(全式金)分別以3 種魚的肝臟組織cDNA 為模板，反應(yīng)體系按照試劑說明配置，反應(yīng)程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72 ℃延伸5 min；10 ℃保存。PCR 產(chǎn)物送至金維智生物科技公司進行測序獲得3 種魚的目的片段。

利用Clustalx 軟件對雜交子代與大黃魚和小黃魚的PCR 產(chǎn)物序列進行比對分析，使用DNAMAN 8 軟件預測氨基酸序列并進行序列同源性分析。

1.2.4 IGF-1 基因的表達量測定

使用實時熒光定量PCR 方法測定IGF-1 基因表達量，反應(yīng)體系25 uL，包括2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金)12.5 μL、正反向引物各0.5 μL、cDNA 模板2 μL、ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40 次，10 ℃保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

熒光定量實驗結(jié)果利用Step-one software 軟件讀取(包括目的基因與內(nèi)參基因β-actin)，用2-ΔΔCT法表示目的基因的相對表達量，數(shù)值均用平均數(shù)±標準差(Mean±SE)表示。利用SPSS 20.0 軟件對各組中基因相對表達量進行單因素方差(One way ANOVA)分析，以P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 15 月齡3 種實驗魚體質(zhì)量比較分析

對取樣實驗魚體質(zhì)量進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果列于表2。如表所示，15 月齡時，3 種魚體質(zhì)量由高到低為大黃魚＞雜交子代＞小黃魚。大黃魚和雜交子代雌雄性之間體質(zhì)量差異顯著(P＜0.05)；小黃魚雌雄性個體之間差異不顯著(P＞0.05)。

表2 15 月齡3 種實驗魚體質(zhì)量比較分析Tab.2 Comparison of body weight for the three fish at 15 months of age

2.2 擴增產(chǎn)物序列的生物信息學分析

2.2.1 雜交子代和親本PCR 產(chǎn)物對比分析

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)測序和序列拼接后，使用Clustalx 和DNAMAN 8 軟件比對雜交子代和親本PCR 擴增獲得的DNA 序列，結(jié)果顯示，小黃魚和大黃魚IGF-1 基因序列同源性100%，說明IGF-1 基因在近親物種中具有非常強的保守性；雜交F1 與兩者的同源性均為96.29%，說明所用特異引物在雜交子代中擴增獲得的確實為IGF-1 基因序列，同時也可發(fā)現(xiàn)兩種物種雜交產(chǎn)生的后代存在一定的遺傳變異(圖1)。

圖1 雜交魚與親本IGF-1 基因cds 序列對比Fig.1 Comparison of nucleotides between hybrid fish and parent IGF-1 gene CDs sequence

2.2.2 IGF-1 基因表達的氨基酸序列對比

通過DNAMAN 8 軟件預測PCR 產(chǎn)物序列編碼氨基酸序列，結(jié)果顯示，大黃魚和小黃魚PCR 擴增產(chǎn)物序列編碼氨基酸數(shù)量均為124 個，雜交子代中編碼氨基酸123 個。通過比對分析得知，小黃魚和大黃魚PCR 擴增產(chǎn)物序列編碼氨基酸序列相似度100%，雜交F1 與大黃魚、小黃魚的PCR 擴增序列編碼的氨基酸殘基共有9 個不相同，序列相似度為92.74%，說明IGF-1 基因氨基酸序列在魚類中具有一定的保守性，同時也可發(fā)現(xiàn)兩個物種的雜交子代出現(xiàn)了一定的遺傳變異，此結(jié)果與DNA 序列分析結(jié)果相一致(圖2)。

圖2 IGF-1 基因表達的氨基酸序列對比Fig.2 Comparison of amino acid sequences expressed by IGF-1 gene

2.3 IGF-1 基因表達量分析

2.3.1 同種魚不同組織中IGF-1 基因mRNA 表達量的比較分析

為了比較IGF-1 基因在雌雄個體之間的表達差異，以雄性個體為參照，對3 種魚3 個組織的IGF-1基因表達量進行統(tǒng)計分析并作圖3。從圖中可以看出，大黃魚肌肉組織中IGF-1 基因表達量在雌雄個體之間差異不顯著；腦和肝臟中IGF-1 基因表達量表現(xiàn)為雌性顯著大于雄性。小黃魚和雜交魚的肌肉、腦和肝臟組織中IGF-1 基因表達量均表現(xiàn)為雌性個體顯著大于雄性個體。

圖3 IGF-1 基因在大黃魚(LC)、小黃魚(LP)和雜交子代(HY)中的雌雄表達差異Fig.3 IGF-1 expression differences between male and female in L.crocea (LC),L.polyactis(LP) and hybrids (HY)

為了比較不同組織之間IGF-1 基因表達差異，以肝臟組織表達量為對照，分別比較大黃魚、小黃魚和雜交F1 個體3 種組織中IGF-1 基因的表達差異，結(jié)果如圖4 所示。從圖中可以看出，3 種魚不同組織間IGF-1 基因mRNA 表達量差異顯著(P＜0.05)，均表現(xiàn)為：肝臟＞腦＞肌肉。其中，大黃魚雌性個體中，3 種組織均存在顯著差異，而雄性個體中肌肉與肝臟組織表達量差異顯著(P＜0.05)，腦組織與肌肉和肝臟差異均不顯著(P＞0.05)；小黃魚雌性個體中肝臟和腦組織中IGF-1 基因mRNA 表達量差異不顯著，兩者顯著大于肌肉，雄性個體中3 個組織之間差異顯著；雜交子代雌性和雄性個體不同組織中IGF-1 基因表達量呈顯著差異(P＜0.05)。

圖4 大黃魚(A)、小黃魚(B)和雜交F1(C)不同組織中IGF-1 基因mRNA 表達量的比較分析Fig.4 Comparative analysis of IGF-1 gene expressions of L.crocea,L.polyactis and their hybrids in different tissues

2.3.2 3 種魚同一組織IGF-1 基因表達量的比較分析

以雜交F1 的組織表達量作為參照，分析3 種魚相同組織中IGF-1 基因表達量差異，結(jié)果如圖5 所示。從圖中可以看出，3 個組織中3 種魚的IGF-1 基因表達量均存在顯著差異，其中，小黃魚的表達量均為最高，雜交子代表達量次之(除了雄性個體的肌肉組織)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，肌肉中，雜交子代雌性基因表達量顯著小于小黃魚，顯著大于大黃魚(P＜0.05)；雄性個體中小黃魚和大黃魚基因表達量差異不顯著，均顯著大于雜交子代(P＜0.05)。腦中，雜交子代雌性個體基因表達量與大黃魚差異不顯著，均顯著小于小黃魚(P＜0.05)；雄性個體中，雜交子代基因表達量顯著低于小黃魚，但是顯著高于大黃魚(P＜0.05)。肝臟中，雜交子代雌性個體基因表達量顯著低于小黃魚，但是顯著大于大黃魚(P＜0.05)；雄性個體中，小黃魚基因表達量顯著高于大黃魚(P＜0.05)，而雜交子代介于兩者之間且差異均不顯著。

圖5 3 種魚肌肉(A)、腦(B)和肝臟(C)IGF-1 基因表達量的比較分析Fig.5 Comparative analysis of expression of IGF-1 gene in muscle,brain,and liver of three fish

3 討論

IGF-1 基因在脊椎動物中廣泛存在[22-23]，具有調(diào)節(jié)分裂分化、胚胎發(fā)育、生長等功能[24-25]。本次研究對小黃魚、大黃魚及其雜交子代的IGF-1 基因cDNA 序列PCR 擴增獲得的序列進行了對比分析，結(jié)果顯示，大黃魚和小黃魚的產(chǎn)物序列完全一致，而雜交子代與雙親的同源性均為96.29%，表明近緣物種之間IGF-1基因的同源性較高，具有一定的保守性的同時也存在部分變異。此結(jié)果在其他魚類中也有相關(guān)報道，如黃鰭鯛Acanthopagrus latus 與牙鲆Paralichthys olivaceus 的同源性為86.5%，與黑鯛Acanthopagrus schlegelii的同源性為100%[26]，巖原鯉Procypris rabaudi 與鯉魚Cyprinus carpio、鯪魚Cirrhinus molitorella、黑鯛及斑馬魚Barchydanio rerio 的同源性均在95%以上[27]。報道指出，對于不同的物種的不同組織，IGF-1 基因表達量存在一定的差異[28-29]。在本次對15 月齡的小黃魚、大黃魚及其雜交子代IGF-1 基因表達量進行了測定分析中，同樣得出，3 種魚的IGF-1 基因表達量存在顯著差異，其中，小黃魚的IGF-1 基因表達量高于大黃魚，除了雄性個體的肌肉組織，其余組織均達到顯著水平。

魚類IGF-1 主要由肝臟合成，在其他的一些組織器官中也有表達[30,31]。陶敏等[32]研究日本白鯽Carassius cuvieri IGF-1 基因組織表達發(fā)現(xiàn)，在肝臟、肌肉和腦3 個組織中，肝臟中基因表達量最高，其次是肌肉和腦。錢焜等[33]研究發(fā)現(xiàn)花鱸Lateolabrax japonicus 的肝臟是IGF-1 基因表達量最高的場所，肌肉和腦次之。本實驗通過對3 種魚的肌肉、腦和肝臟組織進行IGF-1 基因表達量測定，發(fā)現(xiàn)IGF-1 基因在3 個組織中均有一定量的表達，不同組織之間表達量具有明顯的差異，其中，肝臟是3 種魚體內(nèi)IGF-1 含量最多的組織器官，其次是腦和肌肉，研究結(jié)果與上述報道結(jié)果相一致。比較3 種魚可得出，小黃魚各組織IGF-1 基因表達量均最高，雜交F1 的表達量除了雄性肌肉中的表達量之外，均大于大黃魚的基因表達量。基因表達量的分析結(jié)果與體質(zhì)量的分析結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，基因表達量的排序(小黃魚＞雜交子代＞大黃魚)與本次研究中體質(zhì)量的排序(大黃魚＞雜交子代＞小黃魚)以及劉峰等[20]報道的結(jié)果，均存在較大差異，即3 種魚的生長速度與IGF-1 基因表達量不成正相關(guān)關(guān)系，主要原因可能是生長性狀除了受到IGF-1 基因的影響，還受到其他生長相關(guān)基因的調(diào)控，并且IGF-1 基因本身也還受到GH/IGF 軸的調(diào)控[34-36]。本次研究結(jié)果再次證明了基因與性狀不是一一對應(yīng)的關(guān)系[37-38]，因此，除了在DNA 水平上探討位點雜合性及互作方式與雜種優(yōu)勢的關(guān)系外，還應(yīng)從雜交種與親本在基因表達調(diào)控等方面來探討雜種優(yōu)勢的遺傳機理。