李洪達(dá), 吳華瓏, 吳雙士, 趙季偉, 孫 浩, 胡 樂, 王永祥

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/揚(yáng)州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院 骨科, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

骨質(zhì)疏松癥是威脅中老年人群健康的常見疾病，以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞為主要特征，可導(dǎo)致骨脆性增加，增高骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。目前，骨質(zhì)疏松癥的診斷主要依靠骨密度的定量評(píng)估，通常采用雙能X線吸收測(cè)定法來(lái)測(cè)定。但單獨(dú)采用骨密度評(píng)估骨質(zhì)疏松癥的敏感性較低，可能導(dǎo)致潛在的骨質(zhì)疏松癥患者被遺漏。目前，多數(shù)骨代謝生物標(biāo)志物的研究都集中在單一的多肽或個(gè)別蛋白質(zhì)的測(cè)定方面，且有些生物標(biāo)志物標(biāo)記耗時(shí)且繁瑣，其結(jié)果有高度的不確定性。

同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ技術(shù))是蛋白質(zhì)定量分析的重要工具，該方法顯著降低了多重檢驗(yàn)的可變性，提高了蛋白質(zhì)定性和定量分析的準(zhǔn)確性。有研究[1]采用iTRAQ技術(shù)在骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者中鑒定出特異性血清生物標(biāo)志物, iTRAQ技術(shù)正迅速成為深入了解蛋白質(zhì)表達(dá)差異的重要工具。本研究通過梳理健康人群和老年性骨質(zhì)疏松癥人群血清差異性蛋白的相關(guān)研究，在總結(jié)前期大量骨質(zhì)疏松癥患者臨床治療方法的基礎(chǔ)上，利用iTRAQ技術(shù)篩選出骨質(zhì)疏松癥差異性蛋白，再經(jīng)查閱uniport 數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)，分析差異性蛋白的特性以及與骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性，以初步鑒定出骨質(zhì)疏松癥早期診斷的特異性血清蛋白標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 研究資料

選擇2018年6月—2019年3月在江蘇省蘇北人民醫(yī)院脊柱外科住院的老年男性患者為研究對(duì)象，在征得本院倫理辦公室公證同意及患者和家屬知情同意后收集血清。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 年齡18～<70歲，男性; ② 所有患者在取樣12 h前停服抗生素和激素類藥物; ③ 未接受規(guī)律抗骨質(zhì)疏松癥治療的患者; ④入院后行骨密度檢查者; ⑤ 能夠正常生活者，無(wú)行動(dòng)不便、腫瘤、器官移植、甲狀腺切除以及腎臟摘除手術(shù)病史。

實(shí)驗(yàn)材料包括Q Exactive Plus高分辨率質(zhì)譜儀，蛋白組學(xué)研究主要試劑、儀器、分析軟件，水合氯醛、硫酸慶大霉素、甲潑尼松龍琥珀酸鈉、磷酸鹽緩沖液(PBS)、牛血清白蛋白(BSA)、二喹啉甲酸(BCA)定量試劑盒(P0012), iTRAQ 試劑盒，強(qiáng)陽(yáng)離子交換(SCX)色譜柱、Easy nLC色譜系統(tǒng), Q Exactive質(zhì)譜儀，電泳儀。

1.2 研究方法

1.2.1 分組: 本研究共采集48例患者血清樣本，根據(jù)骨密度標(biāo)準(zhǔn)將血清樣本分為正常組和骨質(zhì)疏松組，每組24例。2組血清樣本又隨機(jī)分為4個(gè)編組，每個(gè)編組包含6例患者血清樣本。正常組A1～A4編組分別采用相對(duì)分子質(zhì)量依次為113、114、115、116的iTRAQ標(biāo)記，骨質(zhì)疏松組B1～B4編組分別采用相對(duì)分子質(zhì)量依次為117、118、119、121的iTRAQ標(biāo)記。見表1。

表1 正常組與骨質(zhì)疏松組樣本標(biāo)記信息

1.2.2 樣品制備: 采集2組患者血清，應(yīng)用10 kD超濾管進(jìn)行超濾濃縮，加入1倍體積的SDT裂解液，沸水浴15 min, 14 000 g離心20 min后取上清。采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析。分裝樣品, -80 ℃保存。

1.2.3 蛋白組學(xué)研究主要方法及步驟: 各樣品取20 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，判斷樣品裂解情況后采用超濾管酶解(FASP)方法對(duì)各樣品進(jìn)行酶解，得到肽段。采用 iTRAQ試劑盒按照ABI公司說(shuō)明書對(duì)每個(gè)肽段進(jìn)行iTRAQ 標(biāo)記，每個(gè)標(biāo)簽標(biāo)記100 μg, 將每組標(biāo)記后的肽段混合，采用AKTA Purifier 100進(jìn)行分級(jí)，然后分別脫鹽凍干。分級(jí)后的肽段樣品分別進(jìn)行2 h梯度Q-exactive分析，共計(jì)8次液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LCMS/MS)分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索: 采用高分辨率質(zhì)譜儀Q Exactive Plus進(jìn)行iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，采用Proteome Discoverer 2.1軟件將Q Exactive Plus產(chǎn)生的原始圖譜.raw格式文件轉(zhuǎn)化為.mgf格式，通過軟件內(nèi)置的工具提交到MASCOT 2.5服務(wù)器進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。此后通過Proteome Discoverer 2.1將MASCOT服務(wù)器上形成的查庫(kù)文件(.dat格式)傳回軟件，根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.01的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，獲得高度可信的定性結(jié)果。在定量分析過程中，本項(xiàng)目采用Proteome Discoverer 2.1軟件對(duì)肽段報(bào)告離子峰強(qiáng)度值進(jìn)行抽提，并對(duì)定量值進(jìn)行歸一化處理。

1.2.5 篩選骨質(zhì)疏松癥特異性蛋白: 篩選條件，差異性蛋白在骨質(zhì)疏松組的表達(dá)量顯著升高或降低(差異倍數(shù)>1.2,P<0.01), 差異蛋白在正常組中表現(xiàn)為無(wú)顯著差異(差異倍數(shù)<1.2或P>0.01)。質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為.raw格式，采用軟件Mascot 2.3和ProteinPilot 4.4進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析。篩選骨質(zhì)疏松相關(guān)的候選蛋白質(zhì)，初步建立診斷模型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 差異蛋白鑒定和定量結(jié)果評(píng)估

本實(shí)驗(yàn)中質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集自Q Exactive Plus高分辨率質(zhì)譜儀，能夠獲得高質(zhì)量的一級(jí)質(zhì)譜的分子離子圖譜(MS1)和碎片圖譜(MS2圖譜)。使用MASCOT分析工具對(duì)MS圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最終獲得每張MS2圖譜的得分。結(jié)果顯示, MS2的MASCOT得分較為理想，約70%以上的肽段得分在20分以上，肽段得分中位數(shù)為20分。見圖1。每一套iTRAQ數(shù)據(jù)在定性分析工作中均使用FDR<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合所得的優(yōu)秀肽段得分分布情況，進(jìn)一步說(shuō)明MS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

圖1 肽段離子得分分布

肽段數(shù)量對(duì)應(yīng)柱狀圖，表示鑒定到的具有對(duì)應(yīng)離子得分的肽段數(shù)量; 肽段累積百分比對(duì)應(yīng)累積曲線，表示不高于對(duì)應(yīng)離子得分的肽段累積百分比。

2.2 差異蛋白的鑒定及定量

本實(shí)驗(yàn)基于iTRAQ技術(shù)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果，共獲得227 876個(gè)二級(jí)質(zhì)譜譜圖總數(shù)，鑒定肽段匹配到的譜圖數(shù)共47 491個(gè)，鑒定到的肽段總數(shù)為11 063個(gè)，鑒定到的唯一肽段總數(shù)為4 713個(gè)。最終，共鑒定出932個(gè)蛋白質(zhì)用于進(jìn)一步研究。932個(gè)差異蛋白中，符合表達(dá)差異倍數(shù)大于1.2倍(上調(diào)、下調(diào))且符合P<0.05篩選標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)視為差異表達(dá)蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，共有31個(gè)差異蛋白，包括8個(gè)上調(diào)蛋白和23個(gè)下調(diào)蛋白。見表2。

表2 質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)定量結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 生物信息分析

為了深入了解骨質(zhì)疏松癥患者血清蛋白質(zhì)的生物學(xué)變化，作者根據(jù)基因本體論對(duì)差異蛋白進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)差異蛋白存在于各種生物過程，如細(xì)胞凋亡(IGFBP3, KRT9, KRT6B, KRT14, KRT5), 代謝過程(ALDOB, IGFBP3), 細(xì)胞成分組織(CNN2), 生物調(diào)節(jié)(IGKV4-1, (OSTF1, CNN2, EphA4, ALDOB, ANKRD13A, IGFBP3, MOB1B), 免疫過程(IGKV4-1, IGKV2D-29), 刺激反應(yīng)(KRT14), 發(fā)展過程(KRT5, KRT9, KRT6B, KRT14, OSTF1), 生物黏附(EphA4), 生產(chǎn)過程(CNN2, IGKV4-1, IGKV2D-29)等。

本研究進(jìn)一步對(duì)31個(gè)差異蛋白進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示，在確定的31個(gè)蛋白中, 13個(gè)在蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)中相互連接。此外，作者發(fā)現(xiàn)KRT基因位于網(wǎng)絡(luò)中樞，并與其他蛋白質(zhì)存在復(fù)雜的聯(lián)系; EphA4明顯上調(diào)且參與細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡，生物信息學(xué)功能符合預(yù)期; OSTF1與骨質(zhì)疏松的發(fā)生呈正相關(guān)，與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致。因此，作者篩選出EphA4、角蛋白(KRT)、破骨細(xì)胞刺激因子1(OSTF1)基因所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)，作為骨質(zhì)疏松癥患者潛在的生物標(biāo)志物。基于生物通路分析(IPA)的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析見圖2。

綠色標(biāo)志表示表達(dá)下調(diào),紅色標(biāo)志表示表達(dá)上調(diào)。圖2 基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

本研究是通過iTRAQ技術(shù)定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究正常人與骨質(zhì)疏松癥患者血清差異蛋白的情況，共定量了931種蛋白質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)了31種差異蛋白，其中8個(gè)上調(diào), 23個(gè)下調(diào)。根據(jù)對(duì)差異蛋白質(zhì)的IPA分析，展示了差異基因相互作用的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)各蛋白的功能分析結(jié)果，作者篩選出EphA4、KRT、OSTF1作為骨質(zhì)疏松癥患者潛在生物標(biāo)志物。

EphA4即Ephrin A型受體4, 是酪氨酸激酶受體超家族的成員，是生長(zhǎng)激素(GH)信號(hào)傳導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)劑。受體酪氨酸激酶與位于鄰近細(xì)胞上的膜結(jié)合的Ephrin家族配體結(jié)合，導(dǎo)致接觸依賴性雙向信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)入鄰近細(xì)胞。受體下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑稱為正向信號(hào)傳導(dǎo)，而Ephrin配體下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑則稱為反向信號(hào)傳導(dǎo)。受體酪氨酸激酶高度混雜，在Eph受體中具有獨(dú)特的特性，可以結(jié)合GPI錨定的Ephrin-A和跨膜的Ephrin-B配體并被其激活生理活性。通過Ephrin配體激活后，通過調(diào)節(jié)Rac、Rap和Rho GTPases活性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)和整聯(lián)蛋白依賴性細(xì)胞黏附。在控制軸突引導(dǎo)的不同步驟(包括建立皮質(zhì)脊髓突部)的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用，在神經(jīng)肌肉回路發(fā)育過程中也可能控制運(yùn)動(dòng)軸突和感覺軸突的分離。研究[2]發(fā)現(xiàn)EphA4在癌癥生物學(xué)以及脊髓損傷、多發(fā)性硬化、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)和阿爾茨海默病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，EphA4不僅在軸突導(dǎo)向中發(fā)揮作用，還在突觸可塑性中發(fā)揮作用，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)中也發(fā)揮著防止軸突再生的作用。研究[3]顯示, EphA4基因敲除小鼠在脊髓損傷后表現(xiàn)出顯著的軸突再生現(xiàn)象，而EphA4敲除和野生型小鼠的組織學(xué)差異在傷后4 d就已經(jīng)非常明顯。EphA4還具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管形成的作用。本研究中, EphA4在骨質(zhì)疏松組中表達(dá)上調(diào)明顯，可能與體內(nèi)生長(zhǎng)激素分泌下降、神經(jīng)肌肉回路控制力下降、老年性血管改變、反饋性增強(qiáng)EphA4表達(dá)有關(guān)。

KRT是細(xì)胞骨架的重要組成成分，主要存在于上皮細(xì)胞中，維持上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性，并在上皮細(xì)胞保護(hù)中起重要作用。KRT還在細(xì)胞極化、細(xì)胞大小調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)翻譯和細(xì)胞器定位中發(fā)揮作用。人上皮細(xì)胞中已經(jīng)鑒定了54種功能性角蛋白，包括28種I型(酸性形式, K9-K28)和26種Ⅱ型(堿性形式, K1-K8和K71-K74)蛋白[4]。本研究中，差異表達(dá)的角蛋白基因有KRT1、KRT5、KRT9、KRT14、KRT6B、KRT77。有研究[5]分析來(lái)自腎移植排斥反應(yīng)的受體的血清樣品，發(fā)現(xiàn)抗KRT1抗體很可能是自身抗體，且與臨床同種異體移植有關(guān)。KRT6已被研究[6]證實(shí)可作為尿路上皮癌的可能的生物標(biāo)志物。本研究中, KRT1、KRT5、KRT9、KRT14、KRT6B、KRT77均在骨質(zhì)疏松組表達(dá)下調(diào)，且KRT作為細(xì)胞骨架成分之一，在骨質(zhì)疏松發(fā)展中可能起重要作用。

OSTF1是由破骨細(xì)胞自身產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，其可增強(qiáng)破骨細(xì)胞形成和骨吸收。OSTF1通過與肌球蛋白1E(Myo1E)的直接相互作用，導(dǎo)致Myo1E錨定到細(xì)胞質(zhì)并防止其轉(zhuǎn)移到肌動(dòng)蛋白成核位點(diǎn)，從而對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性產(chǎn)生負(fù)面影響。有研究[7]通過OSTF1敲除小鼠模型證明長(zhǎng)骨中的小梁質(zhì)量增加，證實(shí)了OSTF1在骨骼發(fā)育中的作用。OSTF1也被證明與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1(SMN1)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因2(SMN2)的相互作用，其喪失會(huì)導(dǎo)致脊髓性肌萎縮[8]。全基因組關(guān)聯(lián)研究[9]認(rèn)為OSTF1的變異與冠狀動(dòng)脈疾病、體質(zhì)量指數(shù)的變化、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化癥和非酒精性脂肪性肝病相關(guān)。本研究中OSTF1表達(dá)在骨質(zhì)疏松組明顯上調(diào)，證實(shí)OSTF1與骨質(zhì)疏松的發(fā)生呈正相關(guān)。

綜上所述，本研究已經(jīng)檢測(cè)出一些可能會(huì)成為早期診斷骨質(zhì)疏松癥的生物標(biāo)志物，根據(jù)IPA分析及各差異蛋白生理功能對(duì)比，篩選出EphA4、KRT、OSTF1等3個(gè)差異蛋白，初步認(rèn)定為骨質(zhì)疏松癥的蛋白標(biāo)志物，可進(jìn)一步探討其相關(guān)機(jī)制。