陳姿含，王勇

（桂林醫(yī)學(xué)院廣西腫瘤免疫與微環(huán)境調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林）

0 引言

腦卒中是由于血管被堵塞造成腦組織缺血、缺氧或腦血管破裂出血所致的急性危重疾病[1]。其中，缺血性腦卒中患者占卒中相關(guān)疾病死亡率的87%，腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞很快因缺氧而死亡，其有效治療的時(shí)間窗非常狹窄。由于醫(yī)學(xué)的進(jìn)步使溶栓藥物和血管內(nèi)技術(shù)得到發(fā)展，使得缺血性腦卒中的致殘率和死亡率降低[2,3]。多數(shù)情況下，缺血后及時(shí)再灌注可使組織器官結(jié)構(gòu)和功能得到恢復(fù)，患者病情好轉(zhuǎn)康復(fù)。但缺血時(shí)間過長(zhǎng)進(jìn)行再灌注，反而會(huì)加重組織、器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。這種在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury， I/R）[4]。因此，研究腦缺血再灌注損傷的機(jī)制對(duì)于缺血性腦卒中的防治至關(guān)重要[5]。

腦缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，炎癥和鈣超載等，繼而誘導(dǎo)自噬、凋亡或細(xì)胞死亡。自噬是一種將細(xì)胞自身蛋白或細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中進(jìn)行降解的過程。自噬是在應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生的反應(yīng)，研究表明腦缺血再灌注損傷會(huì)激活自噬，自噬通過調(diào)控一系列信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)或損傷。Nazarinia，D[6]等研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠短暫大腦中動(dòng)脈閉塞后腦組織中自噬蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯增加。Guangyun Wang[7]等研究表明，在氧糖剝奪模型以后的PC12細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)增加。以上研究表明，自噬在腦缺血再灌注損傷中的條件下會(huì)被激活，自噬激活后會(huì)通過一系列信號(hào)通路發(fā)揮作用。

1 自噬相關(guān)信號(hào)通路

機(jī)體通過自噬來補(bǔ)充能量和氨基酸，實(shí)現(xiàn)機(jī)體本身的代謝需要和更新[8,9]。自噬包括巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，是通過運(yùn)送特定的載體到溶酶體中并形成自噬溶酶體。自噬過程包括將細(xì)胞質(zhì)蛋白和受損細(xì)胞器隔離膜分解成一種由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成的杯狀的雙層膜的自噬中間體。未成熟的隔離膜會(huì)生長(zhǎng)包裹內(nèi)容物，從而形成溶酶體，在可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子蛋白受體的介導(dǎo)下，溶酶體與自噬體膜融合。在此階段，內(nèi)含物進(jìn)行降解，使其在營(yíng)養(yǎng)耗盡時(shí)，細(xì)胞質(zhì)表面的LC3-II可以通過依賴于ATG4的去脂作用回收。然后，通過自噬體酸化和溶酶體水解酶降解[10,11]。

細(xì)胞自噬在生理?xiàng)l件下受到眾多信號(hào)通路的調(diào)控，從而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。目前研究發(fā)現(xiàn)與自噬有關(guān)的調(diào)節(jié)通路包括PI3K/Akt通路、AMPK通路、mTOR通路、NFκB通路、ROS通路、JNK通路、Sirt1通路等[12,13]。Wei yun Li 等[14]研究了雷公藤內(nèi)酯（Triptolide,TP）和2,4-二氨基-6-羥基嘧啶（2,4-diamino-6-hydroxypyrimidine, DAHP）在大鼠局部腦缺血再灌注損傷模型中起到神經(jīng)保護(hù)作用。通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)觀察到，在TP處理的大鼠和DAHP處理的大鼠中，PI3K，Akt和mTOR蛋白表達(dá)有明顯增加，這些結(jié)果表明TP和DAHP可以減少局灶性腦缺血，抑制自噬，減少大鼠腦細(xì)胞凋亡。紅花黃色素B （Safflower yellow B，SYB）屬于查耳酮化合物，Du Shibin等[15]研究發(fā)現(xiàn)，SYB預(yù)防處理明顯的抑制AMPK磷酸化，通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)觀察到，p-AMPK表達(dá)隨藥物濃度的增加而增加，NF-κB,和p-IκB的表達(dá)隨藥物濃度的增加而減少。SYB通過AMPK信號(hào)通路抑制NF-κB活性并減少自噬。保護(hù)大腦免受腦缺血再灌注損傷。Ying Zhang和Ju-Mei Miao研究[16]發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯K通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路使進(jìn)行氧糖剝奪的星形細(xì)胞自噬減少，發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。Wang Shou-Liang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，右旋美托咪定通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路TLR4/NF-κB減少炎癥反應(yīng)和自噬，發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

2 PI3K/Akt/mTORC1信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中的調(diào)節(jié)作用

2.1 PI3K/Akt/mTORC1信號(hào)通路

PI3K受到酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體的刺激時(shí)，PI3K在質(zhì)膜附近與p85發(fā)生反應(yīng)，p110亞基與p85結(jié)合使磷脂酰肌醇2磷酸轉(zhuǎn)化成磷脂酰肌醇3磷酸。磷脂酰肌醇3磷酸與蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的N端PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使AKT從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，使Akt蛋白上的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（Thr308）和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（Ser473）磷酸化而使其激活。激活后的Akt通過直接和間接兩種途徑激活其底物雷帕霉素靶體蛋白（mTOR）。直接途徑是通過磷酸化mTOR，間接途徑是通過失活結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2（tuberous sclerosis2,TSC2）維持Rheb的GTP結(jié)合態(tài)，然后激活mTOR[18]。

已有大量研究顯示，腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展與PI3K/Akt/mTOR自噬信號(hào)通路有關(guān)。PI3K/Akt/mTORC1信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用，包括抑制氧自由基生成增多，鈣超載，細(xì)胞凋亡和炎癥因子等因素的綜合作用導(dǎo)致的腦缺血再灌注損傷。深入研究PI3K/Akt/mTORC1信號(hào)通路與自噬的關(guān)系對(duì)于腦缺血再灌注損傷的防治具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。

2.2 PI3K/Akt/mTORC1與氧自由基

活性氧自由基與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腦功能障礙的病理生理學(xué)機(jī)制有關(guān)。研究表明活性氧自由基參與許多腦部疾病的形成，如腦缺血再灌注損傷[19]。在局灶性或全腦性腦缺血中，腦血流（cerebral blood flow , CBF）在被閉塞的血管中減少，供氧量也隨之減少。在復(fù)氧過程中在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中通過酶催化氧化反應(yīng)的底物自發(fā)或通過溶栓再灌注來提供氧氣。當(dāng)缺血再灌注發(fā)生時(shí)，在此期間產(chǎn)生的氧自由基酶促進(jìn)轉(zhuǎn)化[20]。在缺氧條件下線粒體的通透性轉(zhuǎn)換孔形成，導(dǎo)致自由基大量產(chǎn)生和促凋亡分子的釋放[21]。事實(shí)上，活性氧幾乎可以破壞任何細(xì)胞成分。氧自由基是引起炎癥和凋亡發(fā)生的重要信號(hào)因子。信號(hào)傳導(dǎo)通路PI3K/Akt是調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激和消除炎癥的主要信號(hào)通路，在對(duì)抗機(jī)體炎癥起到了神經(jīng)保護(hù)作用。Bing Chun Yan等[22]發(fā)現(xiàn)通過加巴噴丁的預(yù)處理PI3K，P-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR水平升高，腦缺血再灌注時(shí)氧自由基增多，說明腦缺血再灌注時(shí)通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTORC1信號(hào)通路使氧自由基增多，氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注中起到重要作用。

2.3 PI3K/Akt/mTORC1與鈣超載

Ca2+在腦缺血再灌注損傷中，鈣分布紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣濃度異常性升高，即鈣超載。過量的Ca2+通過激活多種Ca2+依賴性酶引起細(xì)胞損傷，如：鈣依賴一氧化氮合酶，鈣蛋白酶和各種蛋白酶與內(nèi)切核酸酶。Ca2+通過N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-Daspartic acid,NMDA-和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙 酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid,AMPA）為受體的通道，通過電壓門控Ca2+通道和Na+-Ca2+交換通道進(jìn)入神經(jīng)元。另外，從與Ca2+結(jié)合的蛋白的細(xì)胞器中釋放，可以進(jìn)一步增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。細(xì)胞毒性產(chǎn)物的形成例如自由基和白三烯，不可逆線粒體損傷和炎癥都是由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+過量所引發(fā)的壞死和程序性細(xì)胞死亡[23,24]。鈣超載激活Ca2+依賴性蛋白酶，促使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，致使活性氧生成增加，損害組織細(xì)胞。信號(hào)傳導(dǎo)通路PI3K/Akt/mTORC1是調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激和消除炎癥的主要信號(hào)通路，在對(duì)抗機(jī)體炎癥中起到了神經(jīng)保護(hù)作用。

Ning Ma[25]等研究通過動(dòng)脈內(nèi)人類尿激酶原預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)通過蛋白免疫印跡法觀察到，通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白水平表達(dá)均增加的蛋白有Caspase-3，Bax，p-PI3K和p-Akt，蛋白水平表達(dá)減少的蛋白有Bcl-2。通過調(diào)節(jié)線粒體上的通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrialpermeablity transitionpore , MPTP）,使Ca2+從結(jié)合蛋白的細(xì)胞器中釋放，可以進(jìn)一步增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。細(xì)胞毒性產(chǎn)物引發(fā)不可逆的線粒體損傷，引發(fā)炎癥、細(xì)胞壞死和程序性細(xì)胞死亡。

2.4 PI3K/Akt/mTORC1與細(xì)胞凋亡

腦缺血再灌注中的細(xì)胞凋亡由許多因素誘導(dǎo)，包括興奮毒性，自由基增多，炎癥，線粒體和DNA損傷，以及細(xì)胞色素c從線粒體中釋放，細(xì)胞凋亡發(fā)生在輕度缺血性損傷后，特別是在缺血性半影內(nèi)[26]。細(xì)胞凋亡是一個(gè)耗能過程，因此再灌注可以通過恢復(fù)氧和能量來增加了細(xì)胞凋亡[27]。缺血后，半胱天冬酶活化促進(jìn)細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)蛋白，例如Bcl-2的下調(diào)和Bax/Bids以及死亡受體家族的上調(diào)。半胱天冬酶3的活化可以激活下游的因子，半胱天冬酶1,3,8和9都參與腦缺血神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[28]。迄今為止，已有研究表明信號(hào)傳導(dǎo)通路PI3K/Akt/mTORC1參與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)，從而對(duì)腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用[29]。

Teng-Fei Li 等研究表明[30]，通過白楊素預(yù)處理調(diào)節(jié)PI3K /Akt/mTOR通路，減少了大鼠腦缺血/再灌注損傷所引起的神經(jīng)損傷。先將白楊素預(yù)處理7天，隨藥物濃度的增加，給藥組與I / R組相比，p-PI3K，p-Akt，p-mTOR呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，TNF-α，IL-6，IL-1β呈現(xiàn)減少趨勢(shì)。白楊素通過調(diào)節(jié)PI3K / Akt / mTOR通路減少炎癥反應(yīng)，對(duì)腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。

2.5 PI3K/Akt/mTORC1與炎癥因子

缺血性損傷引發(fā)腦實(shí)質(zhì)中的炎性級(jí)聯(lián)，其可通過許多機(jī)制進(jìn)一步放大組織損傷。在閉塞的幾分鐘內(nèi)，出現(xiàn)促炎基因的上調(diào)，產(chǎn)生炎癥因子，如血小板活化因子，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α , TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（interleukin 1 β , IL-1 β）等。在血管內(nèi)皮黏附因子表達(dá)后，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)移到腦損傷部位發(fā)生炎癥反應(yīng)，由活化的炎性細(xì)胞和受損神經(jīng)元（NO，超氧化物和前列腺素類等）產(chǎn)生的毒性介質(zhì)可以放大組織損傷。腦缺血再灌注早期先是由中性粒細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)到達(dá)缺血區(qū)域發(fā)生炎癥作用[31]，隨后巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的產(chǎn)生進(jìn)一步加劇了炎癥反應(yīng)。信號(hào)傳導(dǎo)通路PI3K/Akt/mTORC1參與相關(guān)炎癥因子，從而對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡起到調(diào)節(jié)作用[32]。

川陳皮素是一種多甲氧基黃酮，Yuzhen Zheng等[33]研究表明，用100 mg和200 mg的川陳皮素腹腔注射后在大鼠局部腦缺血再灌注損傷模型中，通過蛋白免疫印跡法觀察發(fā)現(xiàn)蛋白水平表達(dá)均增加的蛋白有Akt，mTOR。蛋白水平表達(dá)均減少的蛋白有IL-β，TNF-α和IL-6。說明川陳皮素通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路Akt/mTOR，減少了炎癥反應(yīng)和自噬，發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

3 結(jié)論與展望

在腦缺血再灌注損傷的出現(xiàn)、發(fā)展全過程中，自噬發(fā)揮著多重作用。適當(dāng)激發(fā)自噬，能夠起到對(duì)再灌注過程中的神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。但如果自噬加劇，將會(huì)造成細(xì)胞死亡。關(guān)鍵在于如何調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬發(fā)揮對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用。自噬通過調(diào)節(jié)通路PI3K/Akt/mTORC1減少了腦缺血再灌注中神經(jīng)細(xì)胞的損傷。隨著對(duì)自噬及PI3K/Akt/mTORC1信號(hào)通路的研究不斷深入，通過藥物對(duì)自噬的合理干預(yù)調(diào)控，期望其能應(yīng)用與臨床，為缺血性腦卒中的防治開拓新的思路。