劉雙，程東凱，于洪君，李寶山

（沈陽東方菁華醫(yī)院，遼寧 沈陽）

0 引言

胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）于1990年首次應(yīng)用，通過選擇女性胚胎來預(yù)防x連鎖隱性遺傳病男性患者的出生[1]。從那時起，診斷、活檢的適應(yīng)癥和活檢方法一直是倫理學(xué)家討論的主題。PGD最初的目的是防止嚴(yán)重遺傳性疾病從攜帶者遺傳給后代。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PGD的應(yīng)用正在擴(kuò)大，包括植入前基因篩查（PGS）和“設(shè)計嬰兒”。PGS主要用于診斷染色體非整倍性的發(fā)生[2,3]?！霸O(shè)計嬰兒”的概念是為那些尋找具有相容性供體進(jìn)行臍帶血移植的人而提出的[4]。

遺傳診斷已經(jīng)發(fā)展到可以進(jìn)行全面遺傳分析的程度。PGD傳統(tǒng)的檢測方式為熒光原位雜交（FISH）。隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步，單細(xì)胞DNA全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification, WGA）的發(fā)展為PGD的應(yīng)用帶來了巨大的優(yōu)勢。WGA使用微陣列技術(shù)能夠用于PGD和PGS的檢測[5]。雖然PGD對遺傳病攜帶者的益處已被廣泛接受，但在適應(yīng)癥、診斷方法、活檢分期和治療效率方面，PGS的使用仍是一個有爭議的話題。

1 胚胎活檢

胚胎植入前遺傳診斷包括輔助生殖技術(shù)和遺傳診斷。傳統(tǒng)的胚胎活檢方法為在第三天卵裂期8細(xì)胞階段取1-2個細(xì)胞進(jìn)行活檢。雖然2個細(xì)胞活檢的診斷準(zhǔn)確性優(yōu)于單細(xì)胞活檢，但收集兩個細(xì)胞對胚胎發(fā)育和植入的危害可能會增加[6]。另一方面，一項研究表明，在一個和兩個細(xì)胞活檢標(biāo)本的準(zhǔn)確性上沒有顯著差異[7]。

囊胚期活檢是目前大家常用的一種方法。該方法在第5天活檢5-10個滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞。胚泡活檢的好處包括能夠收集更多的細(xì)胞，提高擴(kuò)增效率，減少誤診和成本。單個細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增總是存在擴(kuò)增失敗、污染和等位基因脫落（ADO）的風(fēng)險，許多研究試圖提高這些技術(shù)的診斷效果[8-10]。然而更準(zhǔn)確的結(jié)果往往需要更大的樣本量。此外，據(jù)報道，囊胚中的非整倍性率顯著低于卵裂期胚胎[11]。一般情況下在胚胎第三天對胚胎進(jìn)行輔助孵化（AH）技術(shù)，并在第五天囊胚期收集孵出的滋養(yǎng)層細(xì)胞。但是，有時候內(nèi)細(xì)胞團(tuán)會從透明帶打開的位置溢出。為了避免活檢時傷到內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，另一種方法是第5天在遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的透明帶處給與AH，并收集溢出的滋養(yǎng)外胚層。

極體活檢也是進(jìn)行PGD胚胎活檢的一種方法。極體本身對胚胎發(fā)育沒有貢獻(xiàn)，這就是為什么極體活檢被認(rèn)為侵入性比胚胎細(xì)胞活檢更少的原因。然而，第一極體和第二極體有時很難區(qū)分，在技術(shù)上也很難收集。極性體活檢的主要局限性是只能獲得母親的遺傳信息；因此，極性體分析的主要目的是確定染色體的非整倍性。

2 單基因遺傳病的PGD診斷

單基因遺傳性疾病的遺傳模式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、x連鎖顯性遺傳、x連鎖隱性遺傳和線粒體遺傳?？尚械腜GD的先決條件是清楚的了解這對夫婦攜帶的某些遺傳性疾病的突變等位基因，以尋求IVF+PGD。遺傳分析主要是基于PCR技術(shù)應(yīng)用于從早期胚胎分裂階段獲得的單細(xì)胞樣本。然而，PGD的準(zhǔn)確性和診斷效率一直受到限制，因為單細(xì)胞診斷在技術(shù)上是最具挑戰(zhàn)性和難度的，極有可能產(chǎn)生質(zhì)量不理想的結(jié)果。擴(kuò)增失敗、ADO、嵌合現(xiàn)象以及污染都會影響單細(xì)胞PCR擴(kuò)增的效果。當(dāng)細(xì)胞中兩個等位基因中只有一個被擴(kuò)增到可檢測水平時，就會發(fā)生ADO，這通常影響5-20%的單細(xì)胞擴(kuò)增。

由于單細(xì)胞診斷總是有絕對的局限性，雙細(xì)胞活檢可以在不降低植入效率的情況下提供更高的診斷準(zhǔn)確性。囊胚活檢可對5個細(xì)胞進(jìn)行取樣，便于診斷，降低誤診風(fēng)險。為了提高診斷準(zhǔn)確性和擴(kuò)大診斷變異，需要對DNA擴(kuò)增方法進(jìn)行優(yōu)化。WGA被認(rèn)為有很大潛力為每一個獨立的PCR擴(kuò)增提供足夠的DNA模板，包括檢測突變和多態(tài)性標(biāo)記。當(dāng)一種疾病突變已知時，主要是在胚胎活檢的細(xì)胞中進(jìn)行分析。然而，當(dāng)致病突變未知時，則通過連鎖分析（或性別關(guān)聯(lián)疾病的性別分析）進(jìn)行診斷。該方法目前正在研究中，以確保單核苷酸多態(tài)性（SNP）可用于單個突變的表型和多態(tài)分析[12]。

未受影響的可移植胚胎的數(shù)量也因遺傳疾病類型的不同而不同。據(jù)估計，常染色體隱性疾病中受累胚胎的頻率為1/4，常染色體顯性疾病中為1/2，x連鎖隱性疾病中為1/4。

3 WGA技術(shù)

WGA技術(shù)有很多優(yōu)點，特別是在PGD的應(yīng)用中。PGD最大的技術(shù)難題是分析來自一個或幾個細(xì)胞的有限數(shù)量的DNA拷貝。WGA為包括突變檢測和單體型分析在內(nèi)的獨立PCR擴(kuò)增提供了足夠的DNA模板。WGA的另一個優(yōu)點是能夠通過重復(fù)分析和單體型分型來確認(rèn)診斷。此外，WGA被認(rèn)為可以降低擴(kuò)增失敗或ADO造成誤診的風(fēng)險。

WGA過程的原理分為兩類：①基于pcr原理；②非基于pcr原理。在WGA開發(fā)的初始階段，利用15個堿基寡核苷酸隨機(jī)引物進(jìn)行引物擴(kuò)增（PEP），開發(fā)了一種基于pcr的WGA。第二階段是簡并寡核苷酸引物PCR （dopp -PCR），它使用部分簡并序列的引物來提高擴(kuò)增效率?；赑CR原理WGA的兩種技術(shù)GenomePlex和PicoPlex目前已用于PGD或PGS。它涉及到使用一種來自嗜熱細(xì)菌的DNA聚合酶，并在適宜的溫度之間重復(fù)循環(huán)，從而使DNA依次變性和伸長。GenomPlex是PEP和DOPPCR的組合擴(kuò)增技術(shù)，使用簡并寡核苷酸引物與通用接頭匹配的引物連接，用于片段化模板。PicoPlex是繼GenomPlex之后發(fā)展起來的，與BAC克隆微陣列分析相匹配，目前廣泛應(yīng)用于aCGH分析。

基于非PCR的WGA基于多重置換擴(kuò)增（MDA）和外切核酸酶抗性引物和噬菌體u29 DNA聚合酶。MDA在恒溫反應(yīng)中進(jìn)行，產(chǎn)生具有多種結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物（長度為10kb）。MDA產(chǎn)物可通過PCR和寡核苷酸序列進(jìn)行單體型分析。

4 芯片診斷技術(shù)

WGA技術(shù)與臨床微陣列技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)了PGD基因的綜合分析。在比較基因組雜交（CGH）中，通過WGA擴(kuò)增檢測和對照DNA，用熒光色素（Cy3和Cy5）進(jìn)行差異標(biāo)記。將標(biāo)記的DNA混合并應(yīng)用于競爭雜交的微陣列。在這項技術(shù)發(fā)展的歷史上，已經(jīng)提出了包含小DNA （aCGH）的陣列平臺，并成功地從單個細(xì)胞中進(jìn)行了分析。迄今為止，利用BAC克隆的aCGH檢測染色體不平衡和非整倍體的高檢測性能已被廣泛應(yīng)用[13]。aCGH技術(shù)的不足包括無法檢測多倍體，如三倍體、小基因突變、平衡染色體結(jié)構(gòu)異常等。利用寡核苷酸陣列檢測aCGH可檢測基因缺失或重復(fù)等小基因突變；然而，其他限制在理論上是不可克服的。

為了彌補(bǔ)aCGH的不足，SNP陣列還對PGD和PGS進(jìn)行了綜合分析。具有寡核苷酸的SNP陣列為每個標(biāo)記提供了一個基因型（即，AA, BB，或AB）。在連鎖分析、染色體異常和非整倍體篩選的基礎(chǔ)上，已開發(fā)出用于單基因疾病PGD的SNP陣列。在非整倍體和親本互易位檢測能力方面，SNP和aCGH技術(shù)的診斷效率是一樣的。然而，與aCGH不同的是，SNP技術(shù)可以檢測多倍體和較小的突變。

5 NGS技術(shù)

NGS技術(shù)的最新進(jìn)展已經(jīng)發(fā)展到遺傳分析的另一個階段，并被引入到PGD和PGS中[14]。NGS潛在的分析優(yōu)勢包括降低DNA測序成本，增強(qiáng)對部分非整倍體的檢測，增強(qiáng)對多細(xì)胞樣品中嵌合現(xiàn)象的檢測，以及實現(xiàn)分析自動化的潛力[15,16]。在NGS和aCGH之間已經(jīng)證明了可移植胚胎的完全一致性。然而，用于PGD的NGS panel僅能進(jìn)行5000次非整倍體分析。雖然NGS提供了高分辨率和準(zhǔn)確的檢測小于14mb片段大小的缺失，它仍然無法檢測平衡染色體重排，此外，序列覆蓋和實際深度不足以進(jìn)行等位基因檢測[17]。

6 PGS

PGS是PGD的一個子類。PGD的主要目的是為遺傳疾病的攜帶者篩選出基因正常的胚胎。與PGD相比，PGS的目的是改善妊娠和分娩的結(jié)局[18]。大多數(shù)流產(chǎn)在妊娠早期是由非整倍體引起的；因此，PGS的首要目標(biāo)是降低流產(chǎn)率。PGS通常用于高齡產(chǎn)婦和反復(fù)植入失敗的患者，以及反復(fù)流產(chǎn)的正常核型患者[19]。PGS有時也用于因為男性不育的夫婦，或者已經(jīng)生產(chǎn)出患有染色體異常的嬰兒的夫婦，也可以用于具有放療和化療史的夫婦。自1995年以來，F(xiàn)ISH分析在PGS檢測中廣泛應(yīng)用，并且aCGH和SNP陣列最近也用于PGS的檢測。目前已有研究利用FISH進(jìn)行卵裂期胚胎（blastomere） PGS檢測，結(jié)果指出通過移植正常診斷的胚胎，可以提高每次移植的著床率，降低流產(chǎn)率[20-22]。然而，大多數(shù)PGS試驗都是非隨機(jī)的研究。2007年Mastenbroek等發(fā)表的第一項隨機(jī)對照研究（RCT）顯示，PGS患者的分娩率明顯較低[23]。此后發(fā)表了許多PGS的隨機(jī)對照研究，沒有證據(jù)表明FISH診斷可改善分娩率。

活檢的分期和診斷方法可能會影響植入和分娩的比例。在胚胎發(fā)育過程中，卵裂期胚胎活檢被認(rèn)為比囊胚活檢更具侵襲性。此外，由于染色體重排和/或發(fā)育失敗，胚泡滋養(yǎng)外胚層的非整倍性發(fā)生率可能更低。目前，使用aCGH或SNP陣列的全面染色體分析已被普遍用于代替FISH[24]。

7 倫理學(xué)適應(yīng)癥

已確定胚胎植入前遺傳診斷是高危人群的一種選擇，他們的子女可能患有嚴(yán)重的遺傳疾病或殘疾；然而，PGD在遺傳載體和確保減少流產(chǎn)和其他疾病方面有著廣泛的潛在應(yīng)用?；驒z測技術(shù)發(fā)展出的圖譜擴(kuò)大了PGD適應(yīng)癥的選擇范圍，這從倫理和法律定義的角度引發(fā)了爭議。PGD的適應(yīng)癥不僅應(yīng)根據(jù)個人的要求或權(quán)利，而且應(yīng)考慮到各種各樣的社會紀(jì)律和互助，從生育自主權(quán)的角度來決定。

迄今為止，PGD主要應(yīng)用于高外顯率突變引起的疾病，這些突變存在著嚴(yán)重影響新生兒發(fā)育的高風(fēng)險。然而，很難在嚴(yán)重和非嚴(yán)重疾病之間劃清界限，許多討論圍繞著PGD適應(yīng)癥是否應(yīng)該擴(kuò)展到低外顯率突變、遲發(fā)性疾病或遺傳性殘疾。在PGD之前，基因咨詢對于支持和確保患者在進(jìn)入周期之前清楚地了解其優(yōu)點和缺點是至關(guān)重要的。

關(guān)于PGD指標(biāo)的討論可能無法達(dá)成明確的共識。歐洲人類生殖和胚胎學(xué)會倫理與法律專責(zé)小組認(rèn)為，如果PGD符合比例標(biāo)準(zhǔn)，那么它在道德上是可以接受的，在討論PGD可能的適應(yīng)癥時應(yīng)該考慮心理和關(guān)系因素。盡管有爭議的跡象仍然存在。如果性別選擇的目的是避免跨代傳遞，那么PGD在道德上是可以接受的，而社會性別選擇則被認(rèn)為是不可接受的。

8 未來展望和總結(jié)

盡管PGD是一種成熟的技術(shù)，但PGS仍在爭論中，隨著對人類胚胎發(fā)育的更好理解，隨著設(shè)計更好的前瞻性隨機(jī)試驗獲得更多數(shù)據(jù)，PGS將被臨床所接受。臨床研究將隨著對人類胚胎發(fā)育的更好理解而不斷發(fā)展，可從前瞻性隨機(jī)試驗獲得更多數(shù)據(jù)，如活檢時間的影響，不同基因分型方法（包括qPCR，aCGH，SNP陣列和NGS）之間的局限性和比較，以及明確定義的目標(biāo)人群，如孕婦年齡高的女性或反復(fù)流產(chǎn)的女性。通過WGA的改進(jìn)和NGS分析流程的優(yōu)化等技術(shù)方面的進(jìn)展預(yù)測，可以解決許多當(dāng)前未解決的問題，但也可能出現(xiàn)更多問題。它需要IVF臨床醫(yī)生，進(jìn)行活組織檢查的胚胎學(xué)家以及進(jìn)行基因分型的遺傳學(xué)家的共同努力，以使PGS的辯論最終得到解決。在參加IVF+PGD / PGS計劃之前，應(yīng)向所有病例提供非指導(dǎo)性遺傳咨詢，并提供當(dāng)時最佳和最新的證據(jù)。