金明霞，謝谷艾，喻愛林，劉曉華，嚴(yán)員英，涂業(yè)茍

（江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013）

【研究意義】 松材線蟲病是“松樹癌癥”，自 1982年我國在南京市中山陵首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病，之后，不斷在其他地區(qū)發(fā)現(xiàn)。至 2019年底全國共有 18個(gè)省（市）的 666個(gè)縣級行政區(qū)、4333個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)級行政區(qū)發(fā)生松材線蟲病，發(fā)生總面積達(dá) 111.46 萬 hm 2 ，造成病枯死松樹 1946.74 萬株；與 2018年相比新增縣級疫區(qū) 85個(gè)，新增鄉(xiāng)鎮(zhèn)疫點(diǎn) 1074個(gè)，發(fā)生面積和病枯死松樹數(shù)量同比增長 71.67%和 82.56%。江西省現(xiàn)有 10個(gè)設(shè)區(qū)市的 84個(gè)縣（市、區(qū)）的 495個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)疫情，清理?。?、瀕）死松樹 468.23 萬株，清理面積 13.65 萬 hm 2 ，與 2018年相比，新增疫區(qū) 17個(gè)，疫情占比 84.00%，呈現(xiàn)全省域流行趨勢，疫情非常嚴(yán)峻，廬山、井岡山、龍虎山等風(fēng)景名勝區(qū)也已然感病。

注干藥劑預(yù)防松材線蟲病發(fā)生是一項(xiàng)重要的防治措施，特別是在風(fēng)景名勝區(qū)進(jìn)行優(yōu)勢木的保護(hù)，但目前江西省常用的且效果較好的注干藥劑主要是甲維鹽，成本較高，因此開發(fā)新型的、成本較低的注干藥劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【前人研究進(jìn)展】多年來，我國學(xué)者對松材線蟲藥劑毒力測定做了大量的研究工作[1-7]，但實(shí)踐中應(yīng)用于林間防治的藥劑不多，且成本較高。α-三噻吩最初是從萬壽菊中分離出的一種活性化學(xué)物質(zhì)[8]。其在太陽光下或 300～400 nm紫外光下，具有明顯的殺蟲活性[9]。趙博光等[10]曾在山東長島利用 α-三噻吩加惡喹酸注射潛伏樹以預(yù)防松材線蟲病，取得了良好的效果，且成本較低?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)及擬解決的關(guān)鍵問題】為開發(fā)利用 α-三噻吩應(yīng)用于江西省馬尾松林進(jìn)行注干預(yù)防松萎蔫病的發(fā)生，筆者測定了 α-三噻吩對江西省地理種源松材線蟲的室內(nèi)抑制作用及在松樹體內(nèi)的傳導(dǎo)特性，擬為江西省馬尾松林進(jìn)行藥劑注干防治松材線蟲病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)基地概況

江西省萬安縣沙坪鎮(zhèn)，地理坐標(biāo)為 114°48′E，26°17′N，平均海拔 300 m，面積為 115.8 hm 2 ，群落類型為馬尾松(Pinus massonianaLamb.)+烏飯子(Vaccinium bracteatumThumb)+芒萁(Dicranopteris dichotomaBernh)，主要林下植被有石斑木(Rhaphiolepis indicaLindl)、黃梔子(Gardenia jasminoidesEllis)、輪葉蒲桃(Syzygium grijsiiMerr. et Perry)等。馬尾松林齡 15～30 a，松林為 840～1200 株/hm 2 ，林分郁閉度 0.3～0.6，樹高 2.5～13 m，胸徑 5～20 cm。為松材線蟲病疫情山場，松褐天牛發(fā)生嚴(yán)重。

1.2 供試松材線蟲

2017年11月項(xiàng)目組從江西省萬安縣疫區(qū)收集枯死木，用貝曼漏斗法分離分離線蟲，經(jīng)鑒定收集分離后的線蟲為松材線蟲后，將線蟲接種到長滿了灰葡萄孢菌（Botryis cinerea）的平板上，置于恒溫箱中28 ℃培養(yǎng)，一周后，將培養(yǎng)好的松材線蟲用雙層紙巾包好，置于漏斗中，加適量水，分離 12 h，接取分離液下端 10 mL 線蟲液，在顯微鏡下計(jì)數(shù)線蟲液中松材線蟲的密度，稀釋至一定濃度備用。

1.3 供試藥劑

α-三噻吩，南京林業(yè)大學(xué)自主研制的藥劑；二甲基亞砜（DMSO），市售。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

Molecular Devices 酶標(biāo)儀，充電式電鉆，TG328B 型分析天平，HG101-3 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，真空抽濾泵等。

1.5 測定方法

1.5.1 抑制試驗(yàn)在配制的馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基中分別加入不同量的 α-三噻吩溶液，使培養(yǎng)基中的α-T 的含量分別達(dá)到 0.1，1，10，100 μg/L，以不加入 α-三噻吩溶液作為對照組。在長滿灰葡萄孢的平板上接種 50 條松材線蟲，轉(zhuǎn)入 9 cm培養(yǎng)皿中，并用濕潤濾紙保濕，封口膜封口。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置為黑暗條件，28 ℃。5 d 后分離木屑中的松材線蟲數(shù)量并計(jì)算其抑制率。

記 CK 線蟲平均數(shù)為R0，處理線蟲平均數(shù)為R，則此處理對線蟲繁殖的抑制率Rx為：

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用 DPS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.5.2 α-三噻吩在樹體內(nèi)傳導(dǎo)測定選用江西省林業(yè)科學(xué)院內(nèi)栽植的 6～7 a 黑松 6 株，注藥前測量黑松胸徑和樹高。準(zhǔn)確配制 2×10－3g/mL 的 α-三噻吩丙酮溶液。使用充電式電鉆，在黑松苗試驗(yàn)株基部斜向下打孔，向孔中注入 α-三噻吩溶液，分別使 α-三噻吩與松苗的質(zhì)量比達(dá)到 1 μg/g、3 μg/g，每處理注 3株。注藥后傷口用 Parafilm“M”膜封口，并用鋁箔紙包裹避光。對照株注射等量丙酮。

稱取 0.01 g 的 α-三噻吩晶體，用分析純丙酮配制出 α-三噻吩含量分別為 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，另設(shè)空白對照。 設(shè)置酶標(biāo)儀參數(shù)為激發(fā)光波長 352 nm、發(fā)射光波長 428 nm，增益 8 檔下，測定每一濃度溶液的熒光值。以 α-三噻吩溶液濃度為 X 軸，熒光值為 Y 軸建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

在黑松注藥 7 d 后，剪取其松苗 1 a 枝條，去除樹皮，稱取新鮮木質(zhì)部質(zhì)量，置于干燥箱 40 ℃烘干24 h，稱量干木質(zhì)部，計(jì)算相對含水量。每株黑色均采集 3 根枝條，干燥后將木質(zhì)部剪碎，每枝稱取 0.5 g，置于 100 mL三角瓶中，每份加入 10 mL 丙酮，在室溫下浸提 3 h，真空抽濾，濾液避光保存，濾渣則轉(zhuǎn)入三角瓶，繼續(xù)加入 10 mL 丙酮，繼續(xù)浸提 3 h，共浸提抽濾 3次，合并濾液。將對照松苗干燥木質(zhì)部浸提液設(shè)置為零值，測定各濃度濾液的熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和 RWC 計(jì)算新鮮木質(zhì)部中 α-三噻吩的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-三噻吩對松材線蟲抑制作用

經(jīng)對松材線蟲抑制率研究表明：培養(yǎng)基中 α-三噻吩的含量分別為 0.1，1，10，100 μg/L 濃度下對松材線蟲繁殖能力的影響呈顯著差異（P＜0.05），隨著培養(yǎng)基中藥劑含量的不斷升高，其對線蟲的抑制率不斷上升，當(dāng)培養(yǎng)基中藥劑含量達(dá) 100 μg/L 時(shí)，其對線蟲的抑制率為 85.94%（表 1）。

表1 不同濃度 α-三噻吩對松材線蟲的抑制作用

表2 黑松一年生枝條含水量測定

2.2 α-三噻吩在黑松體內(nèi)含量測定

圖1 α-三噻吩溶液標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

經(jīng)對注藥后一周枝條含水量測定，注藥量為1 μg/g 和 3 μg/g，一周后其平均含水量為 53.33%和 54.47%；檢測新鮮枝條中 α-三噻吩的含量分別為 1.04 μg/g 和 3.07 μg/g，和注藥量 1 μg/g 和3 μg/g 相符，可見黑松注藥一周后藥劑能順利疏導(dǎo)到各方向枝條中，且均勻分布，藥劑的藥效可以很好的在樹干枝條中起作用，黑松注藥后各部位的藥效一致（表 2、表 3）。在特定激發(fā)光波長和發(fā)射光波長條件下，利用 Molecular Devices 酶標(biāo)儀作出 α-三噻吩標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線 （圖1）。 在 0.1～1.0 μg/mL 內(nèi)，α-三噻吩質(zhì)量濃度與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系（R2=0.9996）。

表3 注射 α-三噻吩后黑松枝條內(nèi)藥劑含量

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)表明 α-三噻吩對松材線蟲具有良好的抑制作用，當(dāng)培養(yǎng)基中藥劑含量達(dá) 100 μg/L 時(shí)，其抑制率為85.94%。 經(jīng)對注藥后一周枝條含水量測定，注藥量為1 μg/g和3 μg/g，一周后其平均含水量分別為53.33%和 54.47%；并檢測到新鮮枝條中 α-三噻吩的含量分別為 1.04 μg/g和 3.07 μg/g，這和前期的注藥量 1 μg/g和 3 μg/g濃度相符，表明注藥一周后藥劑能順利疏導(dǎo)到各方向枝條中，且均勻分布，藥劑在樹干和枝條的藥效具有同等效力，故從藥劑對松材線蟲的抑制作用和在松樹內(nèi)傳導(dǎo)特性來看，α-三噻吩非常適用于林間防治松材線蟲病。