張玉鳳 張浩 孫劍 (淮安市婦幼保健院麻醉科，江蘇 淮安 223002)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是患者手術(shù)麻醉后出現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為麻醉后患者記憶力，抽象思維及定向力障礙，并伴有社會(huì)活動(dòng)能力減退，即人格、社交能力和認(rèn)知能力的改變〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)血清神經(jīng)生長因子(NGF)水平與全麻手術(shù)患者POCD有關(guān)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)七氟烷能夠降低宮頸癌及前列腺增生患者血清NGF水平,并對(duì)術(shù)后1 d認(rèn)知功能造成一定影響〔2,3〕，丙泊酚麻醉同樣影響患者術(shù)后血清NGF水平及簡易智能狀態(tài)檢查量表評(píng)分〔4〕，這些研究均提示早期監(jiān)測(cè)血清NGF水平有利于預(yù)測(cè)POCD的發(fā)生，而外源性給予NGF可顯著影響腦神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展〔5,6〕，但具體分子機(jī)制尚不明確。

NGF與高親和力受體酪氨酸基酶(Trk)A結(jié)合后能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞下游炎癥反應(yīng)通路的激活〔7,8〕，可能是緩解POCD發(fā)展的重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)在表皮生長因子(EGF)和角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)與受體結(jié)合后均會(huì)通過Gαi1/3激活招募Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白(Gab 1)，具體機(jī)制主要是受體、Gαi1/3、Gab1形成復(fù)合物，從而介導(dǎo)下游信號(hào)通路的激活〔9,10〕。EGF受體(R)和KGFR都是具備酪氨酸激酶活性的細(xì)胞表面受體，與TrkA相似。因此猜測(cè)Gαi1/3同樣能與TrkA受體及信號(hào)下游的Gab1結(jié)合，從而影響NGF的功能發(fā)揮，損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。本文運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)抑制Gαi1/3的表達(dá)，觀察其對(duì)小鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)用避暗實(shí)驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn)記錄小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)健康C57/B6小鼠75只，6～7月齡，體重26～32 g，由揚(yáng)州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組(n=15):C 組、P組，P1組、P2組和P3組。除C組外其余4組采取異氟烷吸入建立POCD模型。海馬區(qū)立體定位注射P組慢病毒空載體，P1組慢病毒包裹的 Gαi1-shRNA，P2組慢病毒包裹的 Gαi3-shRNA，P3組慢病毒包裹的 Gαi1/3-shRNA，C組不進(jìn)行藥物及手術(shù)干預(yù)。

1.2小鼠POCD模型制備〔11〕采用異氟烷吸入制備小鼠 POCD 模型，選取成年 C57/B6 小鼠，經(jīng)7 d適應(yīng)環(huán)境后，持續(xù)吸入 1.5%異氟烷4 h，術(shù)后注意保暖待小鼠麻醉恢復(fù)翻正反射后放回籠子里各自飼養(yǎng)。

1.3避暗試驗(yàn) 避暗試驗(yàn)分為訓(xùn)練和正式試驗(yàn)兩個(gè)階段：訓(xùn)練前將小鼠頭背著洞口放入明室，先適應(yīng)環(huán)境 3 min，然后給暗室銅柵通以36 V電流，小鼠一進(jìn)入暗室即受電擊，其正確反應(yīng)是回到明室，銅柵通電持續(xù) 5 min，此為訓(xùn)練過程。24 h后對(duì)小鼠進(jìn)行記憶測(cè)驗(yàn)，記錄小鼠第一次進(jìn)入暗室的時(shí)間，此為避暗潛伏期。

1.4Morris 水迷宮試驗(yàn) 被動(dòng)避暗試驗(yàn)結(jié)束后，開始Morris水迷宮試驗(yàn)，分為訓(xùn)練期、定向航行試驗(yàn)和空間搜索試驗(yàn)三部分進(jìn)行。訓(xùn)練期：在定向航行試驗(yàn)前1 d，水池中不放置平臺(tái)，使小鼠在水中自由游泳 2 min，使其適應(yīng)環(huán)境。定向航行試驗(yàn)：進(jìn)行定向航行試驗(yàn)時(shí)，將平臺(tái)放在固定的第二象限。該試驗(yàn)訓(xùn)練小鼠每天 4 次，共5 d。訓(xùn)練時(shí)，將小鼠面向池壁從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池，記錄鼠入水到找到水下隱蔽平臺(tái)并站立于其上所需時(shí)間，作為潛伏期，并記錄從小鼠入水至找到平臺(tái)通過路徑的總長度。小鼠找到平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上站立30 s。若入水后60 s若小鼠仍未能找到平臺(tái)，則將其輕輕從水中引導(dǎo)拖上平臺(tái)，并停留30 s，然后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。每只鼠從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池為1次訓(xùn)練，兩次訓(xùn)練間隔2 min?？臻g搜索試驗(yàn)： 在定向航行試驗(yàn)結(jié)束后，即第6天，將平臺(tái)撤去，使其在水中尋找原平臺(tái)所在位置，共120 s，記錄從小鼠第1次到達(dá)平臺(tái)原來所在位置的時(shí)間，及穿越原平臺(tái)的次數(shù)，來評(píng)價(jià)小鼠記憶重現(xiàn)的能力。

1.5Western印跡法檢測(cè)海馬區(qū)Gαi1、Gαi3蛋白表達(dá)水平 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠并取海馬組織，加入預(yù)冷的放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)裂解緩沖液及0.1%的PMSF，冰上勻漿。勻漿后離心提取上清液，即海馬組織總蛋白。用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定各樣品總蛋白濃度，以最低蛋白濃度為標(biāo)準(zhǔn)配成等濃度等體積的蛋白樣品。以樣本體積的1/4為標(biāo)準(zhǔn)加入5×蛋白上樣緩沖液，搖勻后沸水煮10 min，-20℃保存待用。用濕式電轉(zhuǎn)儀法，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗Gαi1、Gαi3，4℃孵育過夜。第二天加二抗，室溫孵育2 h，TBST洗10 min，重復(fù)3次，用堿性磷酸酯酶試劑盒顯色，待晾干后掃描條帶，采用Image J圖像軟件分析各蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與Tubulin灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，重復(fù)測(cè)量方差分析。

2 結(jié) 果

2.1小鼠海馬區(qū)Gαi1和Gαi3蛋白表達(dá) 與C組和P組比較，P1組海馬區(qū)Gαi1蛋白表達(dá)水平顯著下降，P2組海馬區(qū)Gαi3蛋白表達(dá)水平顯著下降，P3組海馬區(qū)Gαi1和Gαi3蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組海馬組織Gαi3和Gαi3蛋白表達(dá)

2.2避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與C組比較，其他4組避暗潛伏期顯著縮短(P<0.05);與P組比較，P1組和P2組避暗潛伏期無明顯變化(P>0.05)，而P3組避暗潛伏期顯著縮短(P<0.05)。見表1。

2.3定位航行實(shí)驗(yàn) 與C組比較，第3天及以后其他四組潛伏期顯著延長(P<0.05);與P組比較，P1組和P2組潛伏期無明顯變化(P>0.05)，而第4、5天P3組潛伏期顯著延長(P<0.05)。見表1。

表1 各組避暗實(shí)驗(yàn)及Morris水迷宮定位航行結(jié)果比較

2.4空間探索實(shí)驗(yàn) 與C組比較，其他四組第1次到達(dá)原平臺(tái)所在位置時(shí)間顯著延長，穿越原平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05);與P組比較，P1組和P2組第1次到達(dá)原平臺(tái)所在位置時(shí)間及穿越原平臺(tái)次數(shù)無顯著差異(P>0.05)，而P3組第1次到達(dá)原平臺(tái)所在位置時(shí)間顯著延長，穿越原平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05)。見表2。

表2 Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

G蛋白又稱鳥嘌呤核苷酸蛋白，由α、β和γ亞單位構(gòu)成的異源三聚體。G蛋白根據(jù)α亞單位功能命名包括Gαs、Gαi、Gαq、Gα12，其中Gαi是成員最多的一種G蛋白〔12〕。Gαi又分為Gαi1、Gαi2、Gαi3、GαiO和Gαit等〔13〕。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為 Gαi 蛋白只和 G 蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)結(jié)合〔14,15〕。而最近研究發(fā)現(xiàn)Gαi 蛋白通過耦聯(lián)并激活下游接頭蛋白 Gab1介導(dǎo)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)-TrkB信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)〔16〕。NGF與BDNF同屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子，是神經(jīng)系統(tǒng)重要的生長因子。NGF 主要有兩種膜表面受體，即TrkA和神經(jīng)營養(yǎng)素受體 p75(p75)。TrkA 識(shí)別并結(jié)合 NGF 后，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞存活、增殖和分化的作用〔17〕。本研究說明Gαi1和Gαi3在NGF-TrkA信號(hào)通路中可能發(fā)揮著相似或相同的生物學(xué)效應(yīng)。

綜上，同時(shí)抑制海馬區(qū)Gαi1和Gαi3蛋白表達(dá)可以加重POCD小鼠認(rèn)知功能障礙，而單獨(dú)抑制Gαi1或Gαi3對(duì)POCD小鼠認(rèn)知功能無明顯改變。