楊峰山, 孫 叢, 唐若瑤, 馬玉堃, 付海燕, 劉春光

(1. 黑龍江大學 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心, 哈爾濱 150500;2. 黑龍江大學 生命科學學院 黑龍江省寒地生態(tài)修復與資源利用重點實驗室, 哈爾濱 150080;3. 黑龍江大學 生命科學學院 黑龍江省普通高校分子生物學重點實驗室, 哈爾濱 150080)

苯唑草酮(topramezone，簡稱TO)是2016年上市的玉米田間除草劑[1-2]，其主要通過抑制雜草中類胡蘿卜素和葉綠素的合成，使雜草不能完成光合作用而逐漸死亡[3]，能有效防除世界范圍內(nèi)玉米作物上的主要禾本科雜草和闊葉雜草。然而，由于其在土壤中自然消解緩慢，半衰期長達125 d[4]，苯唑草酮的施用帶來了土壤殘留藥害等問題。研究[5-6]表明，苯唑草酮可能會使小鼠患有甲狀腺瘤，還可能會增加小鼠和兔子骨骼骨化位點的改變和變異的風險；另外，施用了苯唑草酮的玉米田土壤對后茬敏感作物水稻會產(chǎn)生較為明顯的抑制效果[7]。目前，對苯唑草酮的藥效以及毒理方面的報道較多，但對其微生物降解方面報道較少。本研究從黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)施用苯唑草酮的玉米田土壤中篩選出兩株以其為唯一碳氮源的菌株，對其進行種屬鑒定、降解能力測定等研究，以期為利用這兩株細菌進行苯唑草酮污染土壤的微生物修復提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

土壤樣品來源于黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)施用苯唑草酮的玉米試驗田。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

98.4%質(zhì)量分數(shù)苯唑草酮標準品(德國巴斯夫公司)，97%質(zhì)量分數(shù)苯唑草酮原藥(德國巴斯夫公司)。

Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)[8]；基本培養(yǎng)基(MM)[8]。

苯唑草酮無機鹽培養(yǎng)基(MM+TO)：基本培養(yǎng)基滅菌后按比例加入97%苯唑草酮原藥備用。

1.2 方法

1.2.1 苯唑草酮降解菌株的篩選及降解能力定量分析

參考搖瓶富集培養(yǎng)法[9]，馴化質(zhì)量濃度分別為5、50、100、200、300、400、500、600、800和1000 mg/L，分離能夠以苯唑草酮為唯一碳氮源生長的菌株，將其接入到500 mg/L的MM+TO液體培養(yǎng)基中，設(shè)置不加菌為對照組，稱重并記錄，30 ℃，170 r/min，培養(yǎng)7 d，補齊水分，使用二氯甲烷對培養(yǎng)液中的苯唑草酮進行萃取，利用HPLC對樣品進行分析，色譜柱：Waters 300×3.9 mm，波長：254 nm；流動相為甲醇∶水(乙酸銨1.25 g/L)=1∶4；柱溫：30 ℃；流速：1.4 mL/min；進樣量：20 μL。

繪制苯唑草酮的標準曲線，回收率和降解率的計算公式如下：

添加回收率(%)=(實測質(zhì)量濃度÷添加質(zhì)量濃度)×100%

(1)

降解率(%)=[1-(處理實測質(zhì)量濃度÷對照實測質(zhì)量濃度)]×100%

(2)

1.2.2 苯唑草酮降解菌株的生長曲線測定

將活化后的菌株TOB1和TOB2分別以1%接種到兩種培養(yǎng)基(LB和MM+TO)中，另設(shè)MM+TO不接菌為對照組，其中TO的質(zhì)量濃度分別為500 mg/L和5 mg/L，每組處理3個重復，利用酶標儀測定降解菌株的生長狀況，參數(shù)如下：溫度30 ℃，轉(zhuǎn)數(shù)180 r/min，波長600 nm，運行72 h，每15 min檢測1次，繪制生長曲線。

1.2.3 菌株的種屬鑒定

利用革蘭氏染色法觀察細胞形態(tài)以及平板法觀察菌落形態(tài)，參考《伯杰細菌鑒定手冊(第九版)》和東秀珠的《常見細菌鑒定手冊》測定生理生化特征。將PCR擴增16S rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫并獲得登錄號，然后采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以確定菌株的種屬關(guān)系[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中降解菌的分離與純化

從土壤中分離純化出4株細菌菌株，分別編號為TOB1、TOB2、TOB3和TOB4，具體結(jié)果如圖1所示：菌株TOB1的單菌落呈現(xiàn)乳白色，不透明，圓形，邊緣整齊，表面光滑，中央凸起；菌株TOB2的單菌落呈現(xiàn)淡粉色，半透明，圓形，邊緣整齊，表面光滑，中央凸起；菌株TOB3的單菌落呈現(xiàn)金黃色，不透明，圓形，邊緣整齊，表面光滑；菌株TOB4的單菌落呈現(xiàn)乳黃色，半透明，圓形，邊緣不整齊。

A：TOB1；B：TOB2；C：TOB3；D：TOB4

2.2 苯唑草酮降解菌株的降解能力定量分析

苯唑草酮標樣的標準曲線的線性回歸方程為：y=13 170x-20 530，其相關(guān)系數(shù)：R2=0.995 7，通過計算可以得到苯唑草酮的添加回收率為85.6%。 苯唑草酮的殘留質(zhì)量濃度(圖2)顯示，在初始質(zhì)量濃度500 mg/L 苯唑草酮培養(yǎng)液中，與對照組相比，添加4種菌株培養(yǎng)7 d后，苯唑草酮的殘留質(zhì)量濃度降低了16.31%～28.76%[圖2(a)]，在初始質(zhì)量濃度為5 mg/L的苯唑草酮培養(yǎng)液中，苯唑草酮的殘留質(zhì)量濃度降低了25.23%～85%[圖2(b)]，其中，菌株TOB1和TOB2對于兩種質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)出較高的降解能力，保藏這兩株菌做后續(xù)研究。

2.3 苯唑草酮降解菌株的生長曲線

如圖3所示，菌株TOB1和TOB2在LB培養(yǎng)基中，72 h內(nèi)都能夠呈現(xiàn)正常的生長狀態(tài)：菌株TOB1在0～1 h處于延遲期，在3～19 h處于對數(shù)生長期，在20～55 h處于對數(shù)穩(wěn)定期，在56～72 h處于衰亡期；菌株TOB2在0～5 h處于延遲期，在6～35 h處于對數(shù)生長期，在36～50 h處于對數(shù)穩(wěn)定期，在54～72 h處于衰亡期。然而兩個菌株都在MM+TO中有所抑制，與對照組相比，在MM+TO(500 mg/L)培養(yǎng)基中這兩株菌有所生長，菌株TOB1在42～69 h內(nèi)OD值能達到0.124～0.157，菌株TOB2在3～66 h OD值能達到0.119～0.232。在MM+TO(5 mg/L)的培養(yǎng)基中，兩株菌也能夠生長，菌株TOB1在1～72 h內(nèi)OD值能達到0.110～0.326，菌株TOB2在1～72 h OD值能達到0.103～0.236。綜上所述，兩株菌在低質(zhì)量濃度苯唑草酮溶液中(5 mg/L)比在高質(zhì)量濃度(500 mg/L)中生長狀態(tài)較好，菌株TOB1的生長狀態(tài)明顯高于菌株TOB2。

2.4 菌株種屬鑒定

染色后在油鏡下的觀察結(jié)果(圖4)顯示，菌株TOB1和TOB2都呈現(xiàn)紅色，均為革蘭氏陰性菌。其中TOB1為短粗的桿狀菌，排列成鏈狀，TOB2為直形的桿狀菌。菌株TOB1和TOB2的生理生化鑒定結(jié)果如表1所示。

(a)經(jīng)菌株處理后初始濃度為500 mg/L苯唑草酮的殘留濃度；(b)經(jīng)菌株處理后初始濃度為5 mg/L苯唑草酮的殘留濃度

(a)菌株TOB1生長于MM+TO(5 mg/L)；(b)菌株TOB2生長于MM+TO(5 mg/L)；(c)菌株TOB1生長于MM+TO(500 mg/L)；(d)菌株TOB2生長于MM+TO(500 mg/L)

(a)TOB1;(b)TOB2

兩株菌株16S rDNA片段PCR擴增電泳檢測結(jié)果(圖5)顯示，兩個菌株均產(chǎn)生了高亮的16S rDNA片段，其大小相近，約為1.5 kb。

菌株TOB1和TOB2經(jīng)過16S rDNA測序后得到的核苷酸序列，通過對其進行BLAST比對后可以看出，菌株TOB1與不動桿菌屬的16S rDNA序列相似性都超過了99%，菌株TOB2與假單胞菌屬的16S rDNA序列相似性都超過了99%，提交至GenBank獲得的登錄號分別為MK719973和MK719974，結(jié)合形態(tài)、生理生化特征和系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)，初步將TOB1鑒定為不動桿菌屬(Acinetobactersp.)，初步將TOB2鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)。

表1 菌株TOB1和TOB2的生理生化反應特征

M：Marker DL10000

圖6 菌株TOB1和 菌株TOB2的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

目前，國內(nèi)外主要側(cè)重于苯唑草酮的雜草防效和毒理方面的研究，國內(nèi)僅有吉林農(nóng)業(yè)大學和浙江工業(yè)大學對苯唑草酮殘留方面的相關(guān)報道：苯唑草酮的水解半衰期為354.1～807.0 d；光解的半衰期為24.1～64.7 h[11]；馮義志等[12]研究表明，按27～40.5 g a.i./hm2用量,噴霧施藥1次，收獲期采樣，玉米植株、青玉米和玉米中苯唑草酮殘留量均低于0.01 mg/kg,土壤中苯唑草酮殘留量均低于0.02 mg/kg。然而，針對苯唑草酮污染的土壤微生物修復，國內(nèi)外尚鮮見報道。本研究從黑龍江省施用苯唑草酮玉米田土壤中馴化分離出兩株對苯唑草酮有降解能力的菌株TOB1和TOB2。在7 d的時間內(nèi)，相比于菌株TOB3和菌株TOB4，菌株TOB1和菌株TOB2降解率較高：對于質(zhì)量濃度為500 mg/L的苯唑草酮，這兩株菌的降解率分別為28.76%和22.43%；對于質(zhì)量濃度為5 mg/L的苯唑草酮，這兩株菌的降解率分別為85%和82.65%。但是，這兩株菌都能夠在含苯唑草酮的培養(yǎng)基中生長，在低質(zhì)量濃度(5 mg/L)苯唑草酮溶液中比在高質(zhì)量濃度(500 mg/L)中生長狀態(tài)較好，菌株TOB1的生長狀態(tài)好于菌株TOB2。

將菌株TOB1和菌株TOB2分別鑒定為Acinetobactersp.(不動桿菌屬)和Pseudomonassp.(假單胞菌屬)。關(guān)于不動桿菌屬針對石油污染沉積物、含菲廢水及多環(huán)芳烴污染土壤、石油烴等方面修復降解的報道[13-15]較多。郭火生[16]研究發(fā)現(xiàn)Acinetobactersp. DNS32菌株具有較好的降解能力,在阿特拉津質(zhì)量濃度100 mg/L的培養(yǎng)液中,48 h的降解率可達97.63%,且在相對較低溫度下也具有一定的降解能力。關(guān)于假單胞菌屬針對應用百菌清污染的土壤，對染化廢水中典型類持久性有機污染物以及對二氯喹啉酸危害煙草等方面生物的修復報道[17-19]已經(jīng)很多，趙昕悅等[20]研究表明Pseudomonassp. ZXY-1在11 h內(nèi)可完全降解初始質(zhì)量濃度為100 mg/L的阿特拉津，降解效率為99%。本研究對質(zhì)量濃度為500 mg/L的苯唑草酮降解效率不高(10%～15%)，然而，對于質(zhì)量濃度為5 mg/L的苯唑草酮降解效率很高(90%～99%)。本研究所篩選出這兩個種屬的細菌菌株對苯唑草酮的降解能力不如上述文獻報道中其對阿特拉津的降解能力高，有可能是因為在中國阿特拉津的施用已經(jīng)有近40年，土壤中微生物對其適應能力較強，而苯唑草酮是新興起的除草劑，在中國剛剛上市3年，施用時間較短，土壤中微生物對其耐受能力較差，導致細菌對其降解能力和菌體生長狀況較弱，不過不動桿菌屬和假單胞菌對苯唑草酮的降解作用屬首次報道，其對低質(zhì)量濃度苯唑草酮殘留的土壤修復有一定的研究價值與應用前景。今后將從菌株對作物的致病性以及微生物菌劑土壤修復方面開展研究，再進一步研究菌株對苯唑草酮的降解分子機理。