楊寶娟 張 慶 王志紅 王武亮 張 珂

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450000)

宮頸癌發(fā)病率居全球女性惡性腫瘤第二位，死亡率位居女性生殖系統(tǒng)相關(guān)死亡的第一位[1]。流行病學(xué)調(diào)查全球每年有50萬例左右宮頸癌新發(fā)病例和28萬例左右宮頸癌相關(guān)死亡病例[2]。由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移使得宮頸癌患者預(yù)后較差，因此研究宮頸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尤為重要[3]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)被認(rèn)為具有自我更新能力，啟動(dòng)和驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，在腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4，5]。但是CSCs是存在于腫瘤細(xì)胞中的一小部分群體，需要鑒定和分離，現(xiàn)有研究報(bào)道宮頸癌中可以鑒定分離出宮頸癌干細(xì)胞(cervical cancer stem cells,CCSCs)[6，7]。CCSCs具有增殖快、軟瓊脂克隆形成、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)和致瘤性等生物學(xué)特性即為干性，CCSCs干性同樣受到驅(qū)動(dòng)基因、抑制基因和表觀遺傳學(xué)修飾相關(guān)基因等的調(diào)控[8-10]。組蛋白去甲基化轉(zhuǎn)移酶(lysine demethylation 5B,KDM5B) 主要在正常睪丸組織中表達(dá)，近年來研究報(bào)道KDM5B 在肝癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌及卵巢癌等常見的人類惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并在腫瘤增殖轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用[11-13]。KDM5B在宮頸癌中的表達(dá)水平及對(duì)CSCs的調(diào)控作用目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道，因此本文旨在研究KDM5B在宮頸癌組織中的表達(dá)水平和與患者臨床病理特征的關(guān)系，及其在CSCs干性調(diào)控中發(fā)揮的作用，為發(fā)掘治療宮頸癌新的分子基因靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1組織樣本 收集2011年1月～2013年1月入住我院的宮頸癌患者，獲得手術(shù)切除宮頸癌組織70例，患者年齡25～75歲，平均年齡(45.04±21.36)歲，要求所有患者具有完整的病歷資料和隨訪資料，并且未患有其他腫瘤或嚴(yán)重威脅生命健康的疾病，術(shù)前未接受放化療、靶向治療等任何形式的抗腫瘤治療，由兩位或兩位以上的病理專家共同證實(shí)為宮頸癌，另選取30例因良性病變切除的正常宮頸組織，未合并其他腫瘤或威脅生命健康疾病的患者作為對(duì)照，患者年齡30～70歲，平均年齡(47.34±19.95)歲。宮頸癌組與對(duì)照組患者的年齡相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有患者簽署知情同意書，并由我院倫理委員會(huì)審核通過。

1.1.2試劑與儀器 SP試劑盒、非免疫羊血清、DAB顯色試劑盒均購(gòu)于上海碧云天有限公司；加拿大中性樹膠購(gòu)于Solarbio公司；宮頸癌Caski細(xì)胞系和人宮頸上皮永生化細(xì)胞H8均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；DMEM-F12、DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；KDM5B siRNA由上海吉?jiǎng)P有限公司設(shè)計(jì)合成；蛋白裂解液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；MTS購(gòu)自美國(guó)Biovision公司；Transwell小室購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司；兔抗人KDM5B多克隆抗體(ab198884)、兔抗人OCT4多克隆抗體(ab181557)、鼠抗人Nanog多克隆抗體(ab109250)、兔抗人SOX2多克隆抗體(ab97959)和兔抗人GAPDH多克隆抗體(ab181602)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué) 采用SP免疫組織化學(xué)檢測(cè)KDM5B蛋白的表達(dá)，組織樣本在4%中性甲醛固定48 h以上，石蠟包埋，切成4 μm切片，70℃烘烤 2 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脫蠟15 min，70%、80%、90%、100%梯度酒精及雙蒸水，水化，置于檸檬酸鈉溶液中進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)，PBS沖洗2次后，室溫3%過氧化氫甲醇溶液避光孵育30 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加非免疫羊血清室溫封閉1 h，滴加1∶100稀釋的KDM5B一抗工作液，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次后滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS 洗滌3次后DAB試劑顯色，蘇木素染細(xì)胞核，常規(guī)梯度酒精脫水，干燥后加拿大中性樹膠封片。

在低倍顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，按染色程度計(jì)分：無黃色計(jì)0分，淺棕黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，深棕黃色計(jì)3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例計(jì)分，無陽性細(xì)胞計(jì)0分，<25%計(jì)1分；26%～50%計(jì)2分；51%～75%計(jì)3分；>75%計(jì)4分。按染色程度和陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分綜合判定，二者之和≤3分為陰性表達(dá)，>3分為陽性表達(dá)。術(shù)后電話及門診隨訪1～60個(gè)月，患者死亡或者時(shí)間截止時(shí)隨訪終止[14]。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Caski、H8細(xì)胞用DMEM-F12培養(yǎng)基+10%FBS培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。用無血清培養(yǎng)基將Caski細(xì)胞培養(yǎng)成腫瘤球，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤球制成單個(gè)細(xì)胞后重懸于FACS緩沖液中，實(shí)驗(yàn)組加入CD133 FITC 10 μl，對(duì)照組加入10 μl同型對(duì)照抗體，于4℃避光孵育30 min，每10 min混懸細(xì)胞1次，流式細(xì)胞儀上機(jī)分選出CD133+細(xì)胞CCSCs，擴(kuò)大培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)擴(kuò)大培養(yǎng)后CD133 陽性細(xì)胞率。將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CCSCs細(xì)胞胰酶消化后鋪至6孔板中，細(xì)胞完全貼壁后將脂質(zhì)體2000與KDM5B siRNA和對(duì)照組轉(zhuǎn)染試劑按說明書轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，分為KDM5B siRNA(si-KDM5B)和對(duì)照組(si-NC)，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。KDM5B siRNA序列：ATCGCTTGCTTCATCGATATT。

1.2.3MTS增殖實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，胰酶消化計(jì)數(shù)后以每孔150 μl培養(yǎng)基、2 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，組內(nèi)為6個(gè)復(fù)孔，鋪板后放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在鋪板后第0、1、2、3和4天時(shí)(即組間設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔)，每孔加入30 μl MTS工作液，培養(yǎng)箱中孵育2 h，全波長(zhǎng)掃描儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)取吸光度OD值，OD值越高提示細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn) 1.2%高壓滅菌的軟瓊脂與無血清培養(yǎng)基1∶1混勻后，均勻鋪至培養(yǎng)皿底部冷卻至固態(tài)作為底層膠。0.6%高壓滅菌的軟瓊脂與無血清培養(yǎng)基1∶1充分混勻37℃預(yù)熱后，與100 μl 1×105個(gè)各組細(xì)胞混勻鋪至底層膠上，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天顯微鏡下觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.2.5Transwell小室實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗3次，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞重懸至100 μl無血清培養(yǎng)基中，接種于Transwell小室的上室，500 μl完全培養(yǎng)基加入下室作為趨化因子，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察下室穿過10個(gè)細(xì)胞時(shí)終止培養(yǎng)，取出微孔膜，PBS洗滌3次，甲醇固定15 min，蘇木素染色。隨機(jī)計(jì)數(shù)顯微鏡下5個(gè)視野穿過的細(xì)胞，穿過細(xì)胞的數(shù)量越多，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，取5個(gè)視野的均值代表細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.2.6裸鼠移植瘤 按說明書將KDM5B干擾質(zhì)粒及對(duì)照NC，以復(fù)感染指數(shù)MOI(病毒/細(xì)胞數(shù)量)20感染CCSCs，分為KDM5B sh-RNA組和NC組。96 h后添加含1.0 μg/ml G418(遺傳霉素)的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天添加1次，直至所有細(xì)胞均可觀察到熒光。將篩選的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株CCSCssh-KDM5B和CCSCsNC分別以每只1×107個(gè)/100 μl注射到4周齡左右的裸鼠右側(cè)腋下，每組5只裸鼠。每3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體積，4周左右處死裸鼠，該實(shí)驗(yàn)的所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)。

1.2.7Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液(含有100×的蛋白酶和磷酸酶抑制劑)反復(fù)吹打，14 000 r/min、裂解30 min，4℃離心，20 min，上清液移至新的EP管中，BCA測(cè)蛋白濃度，煮沸變性后上樣SDS-PAGE電泳，以濕轉(zhuǎn)的方式將蛋白移至PVDF膜上，8%脫脂牛奶室溫封閉3 h，TBST洗滌3次后加入目的基因一抗孵育4℃過夜，TBST洗滌3次后，二抗室溫孵育2 h，ELC化學(xué)發(fā)光法曝光條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果

2.1KDM5B在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征的關(guān)系 KDM5B在宮頸癌和正常宮頸組織中的表達(dá)陽性率分別為68.57%(48/70)、36.67%(11/30)，宮頸癌組織中KDM5B陽性表達(dá)率顯著高于正常宮頸組織(χ2=8.837，P=0.003)。KDM5B在宮頸癌組織中的表達(dá)水平與患者的年齡、TNM分期和組織學(xué)分級(jí)均無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。KDM5B與宮頸癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān) (均P<0.05)。見表1。

表1 KDM5B在宮頸癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系[例(%)]Tab.1 Expression of KDM5B in cervical carcinoma and its relationship with clinicopathologic features[n(%)]

2.2宮頸癌組織中KDM5B的表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的影響 對(duì)70例宮頸癌患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，并按KDM5B在宮頸癌癌組織中的表達(dá)水平分為KDM5B陽性表達(dá)組和KDM5B陰性表達(dá)組。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：KDM5B陽性表達(dá)組宮頸癌患者的5年總生存率明顯短于KDM5B陰性表達(dá)組(Logrankχ2=23.081，P=0.000，圖1)。

圖1 宮頸癌組織中KDM5B的表達(dá)水平與患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系Fig.1 Relationship between expression of KDM58 in cer-vical carcinoma and postoperative survival time

2.3KDM5B在CCSCs中的表達(dá)水平 利用流式細(xì)胞術(shù)將Caski細(xì)胞分離培養(yǎng)的腫瘤球進(jìn)行分選，篩選出CD133+細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133+細(xì)胞為97.66%，Western blot檢測(cè)KDM5B在CD133+細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于在宮頸癌細(xì)胞Caski和人宮頸上皮永生化細(xì)胞H8中的表達(dá)，H8細(xì)胞中的表達(dá)最低(圖2)。

圖2 KDM5B蛋白在CCSCs中的表達(dá)Fig.2 Expressions of KDM5B protein in CCSCsNote:Compared with CD133+，*.P<0.05.

2.4抑制KDM5B表達(dá)對(duì)CCSCs增殖的影響 MTS法測(cè)定si-KDM5B和NC組CCSCs的增殖能力，結(jié)果顯示，與NC組相比，si-KDM5B組細(xì)胞增殖能力明顯減慢(P<0.05，圖3)。

圖3 MTS檢測(cè)KDM5B對(duì)CCSCs增殖能力的影響Fig.3 MTS detected effect of KDM5B on proliferation ability of CCSCsNote:Compared with si-NC group，*.P<0.05.

2.5抑制KDM5B表達(dá)對(duì)CCSCs克隆形成能力的影響 采用軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)測(cè)定si-KDM5B和NC組CCSCs的克隆形成能力，結(jié)果顯示si-KDM5B組腫瘤克隆球形成明顯小于NC組。si-KDM5B組腫瘤克隆球形成能力明顯弱于NC組(圖4)。

圖4 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KDM5B對(duì)CCSCs克隆形成能力的影響Fig.4 Soft agar clone formation assay detected effect of KDM5B on colony forming ability of CCSCs

2.6抑制KDM5B表達(dá)對(duì)CCSCs轉(zhuǎn)移能力的影響 采用Transwell小室測(cè)定si-KDM5B和NC組CCSCs的轉(zhuǎn)移能力，結(jié)果顯示si-KDM5B和NC組細(xì)胞穿膜數(shù)分別為(48.43±8.14) 個(gè)、(96.32±10.28)個(gè)。si-KDM5B組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯低于si-NC組(P<0.05，圖5)。

圖5 Transwell檢測(cè)KDM5B對(duì)CCSCs轉(zhuǎn)移能力的影響Fig.5 Transwell detected effect of KDM5B on metastasis ability of CCSCs

2.7抑制KDM5B表達(dá)對(duì)CCSCs致瘤性的影響 分別注射CCSCssh-KDM5B和CCSCsNC后，CCSCssh-KDM5B組裸鼠體積顯著低于CCSCsNC組(P<0.05，圖6)。

圖6 KDM5B對(duì)CCSCs致瘤能力的影響Fig.6 Effect of KDM5B on tumorigenicity of CCSCsNote:A.Nude mice were dissected for tumor size;B.Vernier caliper was used to measure the tumor volume of nude mice；compared with CCSCsNC group,*.P<0.05.

2.8抑制KDM5B表達(dá)對(duì)CCSCs干性基因的影響 Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，si-KDM5B組OCT4、 Nanog和SOX2蛋白表達(dá)顯著降低(圖7)。

圖7 Western blot檢測(cè)KDM5B對(duì)CCSCs干性基因蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Western blot analysis of effect of KDM5B on dry gene protein expression of CCSCsNote:Compared with Si-NC group，*.P<0.05.

3 討論

宮頸癌是嚴(yán)重威脅全球女性健康的常見婦科腫瘤，發(fā)病率和死亡率較高[1，2]。宮頸癌患者早期癥狀的隱匿性，使得大多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，容易出現(xiàn)化療藥物抵抗及復(fù)發(fā)，是目前宮頸癌治療面臨的巨大挑戰(zhàn)[15，16]。CSCs作為解釋同一腫瘤內(nèi)腫瘤細(xì)胞具有不同的表型和功能異質(zhì)性的模型，對(duì)腫瘤的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為均具有重要的促進(jìn)作用，同時(shí)CSCs可以作為藥物靶點(diǎn)，消除CSCs可以克服宮頸癌細(xì)胞的鉑類化療耐藥。

CSCs雖然是腫瘤細(xì)胞中的一小部分細(xì)胞，但卻是腫瘤細(xì)胞發(fā)生的起始，是促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)耐藥的關(guān)鍵，具有促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的特性，即干性，而干性通常是由癌基因及抑癌基因等相關(guān)關(guān)鍵因子調(diào)控[8-10]。Huang等[17]研究發(fā)現(xiàn)分化抑制因子ID3可以通過增加β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性來促進(jìn)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(ICC)干細(xì)胞的干性，并且可以作為預(yù)測(cè)ICC患者對(duì)輔助化學(xué)療法反應(yīng)的新型生物標(biāo)志物。軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)在乳腺癌細(xì)胞中陽性表達(dá)與患者的低存活率和較高的復(fù)發(fā)率相關(guān)，并在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中表明COMP表達(dá)增加了乳腺癌中癌癥干細(xì)胞的比例，其通過增加Notch3和Jagged1之間的相互作用來調(diào)節(jié)癌癥干細(xì)胞群[18]。T-box轉(zhuǎn)錄因子3(Tbx3)通過控制干細(xì)胞自我更新和分化來調(diào)節(jié)干細(xì)胞的維持從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[18]。研究報(bào)道KDM5B在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并發(fā)揮重要作用，KDM5B也稱為JARID1，2007年首次被鑒定為組蛋白去甲基化酶，通過參與調(diào)控靶基因啟動(dòng)子周圍的多個(gè)抑制性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，發(fā)揮廣泛調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用[19]。KDM5B與其他三個(gè)家族成員KDM5A、KDM5C和KDM5D共同組成KDM5家族，KDM5家族包含五個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：催化JmjC結(jié)構(gòu)域、N末端JmjN結(jié)構(gòu)域、ARID結(jié)構(gòu)域、PHD指結(jié)構(gòu)域和C5CH2結(jié)構(gòu)域，參與去甲基化酶活性[20]。越來越多的研究表明KDM5B具有致癌作用，KDM5B在乳腺癌組織中高表達(dá)，采用KDM5蛋白小分子抑制劑抑制KDM5B蛋白的表達(dá)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞活力下降[21]。在胃癌中，KDM5B通過調(diào)節(jié)Akt通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[22]。腫瘤細(xì)胞可利用KDM5A獲得順鉑等細(xì)胞毒性劑的化療耐受性[23]。根據(jù)KDM5B促癌的生物學(xué)功能推測(cè)其可能與CSCs干性相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)JARID1B/KDM5B過表達(dá)導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖增加和腫瘤球形成，與CSCs和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志物的表達(dá)呈正相關(guān)[24]。KDM5B在維持類似肝細(xì)胞癌CSCs的特征中起重要作用，敲減KDM5B的表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞體外腫瘤球形成和侵襲[25]。Zhou等[26]報(bào)道KDM5B在宮頸癌細(xì)胞中升高主要逆轉(zhuǎn)miR424-5p觸發(fā)的細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡增加，沉默KDM5B表達(dá)同樣抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，但是KDM5B與CCSCs的相關(guān)研究尚未見有報(bào)道。

為了研究KDM5B在CCSCs中發(fā)揮的作用，本研究采用免疫組化方法檢測(cè)KDM5B在宮頸癌中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示KDM5B在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常宮頸組織，發(fā)現(xiàn)KDM5B蛋白陽性表達(dá)與宮頸癌腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。采用Kaplan-Meier生存曲線發(fā)現(xiàn)KDM5B陽性表達(dá)與患者預(yù)后顯著相關(guān)，KDM5B陽性表達(dá)患者5年總生存期較短。Huang等[12]同樣采用免疫組化分析KDM5B在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(SCCHN)組織和癌旁上皮組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCCHN中KDM5B的表達(dá)高于相鄰的非癌組織，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)及預(yù)后密切相關(guān)。KDM5B在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)增加與腫瘤體積大、TNM分期晚期和患者的總體存活率降低顯著相關(guān)[11]。以上結(jié)果均提示KDM5B可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

CSCs在腫瘤細(xì)胞中的含量較低，并且分離存在一定的困難，無血清懸浮培養(yǎng)法和流式細(xì)胞儀基于CSCs表面免疫學(xué)分子標(biāo)志物分選法是目前分離CSCs的主要方法，CD133已被證實(shí)為CCSCs表面免疫學(xué)分子標(biāo)志物之一[27-29]，本文結(jié)合兩種方法篩選出97.66%的CD133+細(xì)胞為CCSCs。而Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KDM5B在CCSCs中的表達(dá)顯著高于在宮頸癌細(xì)胞Caski和人宮頸上皮永生化細(xì)胞H8中的表達(dá)，H8細(xì)胞中的表達(dá)最低，與其在宮頸癌組織水平表達(dá)具有一致性，采用小干擾RNA技術(shù)干擾目的基因KDM5B的表達(dá)研究其對(duì)CCSCs的影響，MTS增殖實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抑制CCSCs細(xì)胞中KDM5B基因的表達(dá)后細(xì)胞增殖、克隆形成能力、轉(zhuǎn)移能力和致瘤能力均下降，即抑制CCSCs的干性。功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KDM5B基因可能為CCSCs干性的促進(jìn)因子。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor,OCT4)是維持正常干細(xì)胞和CSCs特征的主要轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控其他Nanog、SOX2等干性因子，OCT4、 Nanog、SOX2均為CSCs干性標(biāo)志物，對(duì)CCSCs的干性均具有主要作用，因此采用Western blot檢測(cè)KDM5B對(duì)OCT4、 Nanog和SOX2干性基因蛋白的表達(dá)影響，結(jié)果顯示抑制KDM5B的表達(dá)后，CCSCs中蛋白的表達(dá)下降，表明KDM5B可能促進(jìn)CCSCs的干性[30-32]。

綜上所述，KDM5B在宮頸癌組織和CCSCs中高表達(dá)，與宮頸癌患者的腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，干擾KDM5B的表達(dá)顯著抑制CCSCs的干性，KDM5B在宮頸癌的治療中具有潛在作用，可以為干預(yù)宮頸癌惡性生物學(xué)行為提供新的思路。