陳宏麗 趙洪波 尹 剛③

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)教研室，汾陽(yáng) 032200)

頭頸部腫瘤包括由口腔、咽、喉的黏膜內(nèi)層引起的異質(zhì)腫瘤，占全世界腫瘤病例總數(shù)的六分之一[1]?？谇击[狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC) 是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病例約30萬例[2]。OSCC是一種具有破壞性的惡性腫瘤，具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性，預(yù)后較差[3]。外科手術(shù)是早期OSCC治療的主要方法，療效尚可，但仍有20%的患者死亡，且手術(shù)療法對(duì)于晚期和復(fù)發(fā)的OCSS患者治療具有局限性，OSCC的發(fā)病機(jī)制也尚未完全明確，因此研究OSCC的發(fā)病原因，尋找新的治療途徑，從而提高患者生存率是迫切需要的[4，5]。OSCC具有組織異質(zhì)性和復(fù)雜腫瘤微環(huán)境的重要特征，與腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)密切相關(guān)。CSCs是存在于腫瘤細(xì)胞的一小部分群體，具有促進(jìn)使腫瘤惡性增殖、推動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤耐藥和引起腫瘤復(fù)發(fā)的惡性生物學(xué)行為，統(tǒng)稱為干性。CSCs的干性是腫瘤預(yù)后較差的重要原因之一[6]。有研究從人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Cal-27可以培養(yǎng)分選出CD133高表達(dá)且具有較高自我更新能力的CSCs，因此從CSCs的角度去尋找OSCC新的治療途徑是重要研究方向之一[7]。近年來miRNAs在調(diào)控CSCs重要生物學(xué)功能方面的研究越來越多，這些研究均表明腫瘤中異常表達(dá)的miRNAs通過調(diào)控CSCs的干性促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8,9]。miR-125a是高度保守的miR-125家族成員，其異常表達(dá)在腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等生物過程中發(fā)揮重要作用[10]。在乳腺癌中，抑制miR-125a表達(dá)可導(dǎo)致CSCs生成減少。miR-125a在OSCC組織中表達(dá)減少，通過負(fù)調(diào)控雌激素相關(guān)受體α抑制OSCC細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而miR-125a表達(dá)情況對(duì)于OSCC 中CSCs的影響鮮有報(bào)道[11]。此外，E2F轉(zhuǎn)錄因子2(E2F transcription factor 2,E2F2)在多種腫瘤中為癌基因，可能為miR-125b的靶基因[12,13]。因此本文主要研究miR-125a在CSCs干性中發(fā)揮的作用及靶向調(diào)控E2F2的初步機(jī)制，為發(fā)現(xiàn)OSCC新的治療策略提供研究思路。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1組織樣本 根據(jù)以下條件：2015年6月～2016年6月入住山西醫(yī)科大學(xué)附屬汾陽(yáng)醫(yī)院的患者；均簽署知情同意書；未患有其他腫瘤或威脅生命健康的全身性疾??；未接受放化療、靶向治療等影響腫瘤的治療；具有完整的病例資料；病理專家證實(shí)為OSCC，共收集40例OSCC標(biāo)本。OSCC患者年齡28～75歲，平均年齡(45.98±21.65)歲，<55歲者15例，≥55歲者25例；男28例，女12例；另選取20例正?？谇火つそM織作為對(duì)照，年齡32～70歲，平均年齡(48.36±25.19)歲，<55歲者8例，≥55歲者12例；男13例，女7例；OSCC組與對(duì)照組患者的年齡、性別資料均具有可比性。所有組織標(biāo)本操作均由我院倫理委員會(huì)審核通過。

1.1.2試劑與儀器 TRIzol、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒等均購(gòu)自日本TaKaRa公司；OSCC細(xì)胞系Cal-27、人口腔黏膜角化細(xì)胞HOK均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖、RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清FBS均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；miR-125a mimic由上海捷瑞生物有限公司設(shè)計(jì)合成；MTS購(gòu)自美國(guó)Biovision公司；6孔板、Transwell小室、低黏附板等均購(gòu)自美國(guó)Corning公司；RIPA裂解液、BCA檢測(cè)蛋白濃度試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司；兔抗人OCT4多克隆抗體(ab181557)、鼠抗人Nanog多克隆抗體(ab109250)、兔抗人SOX2多克隆抗體(ab97959)、兔抗人GAPDH多克隆抗體(ab181602)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR 將機(jī)械研磨破碎的組織及細(xì)胞采用TRIzol裂解氯仿提取法獲得總RNA。設(shè)計(jì)合成miR-125a引物F:5′-CCGTCCCTGAGACCCTT-TAAC-3′,R:5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。內(nèi)參GAPDH引物F:5′-GGAGCGAGATCCCTCCA-AAAT-3′,R:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，SYBR Premix ExTaq試劑盒體系進(jìn)行qRT-PCR，采用2-ΔΔCt法分析各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，檢測(cè)miR-125a表達(dá)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 DMEM高糖+10%FBS培養(yǎng)OSCC細(xì)胞系Cal-27，RPMI1640+10%FBS培養(yǎng)人口腔黏膜角化細(xì)胞HOK，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。將Cal-27細(xì)胞腫瘤球制成單個(gè)細(xì)胞后依次與小鼠抗人CD133抗體、小鼠抗人CD44抗體包被的磁珠孵育，分選出CD133+CD44+的CCSCs和CD133-CD44-的細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD133+CD44+陽(yáng)性細(xì)胞率[12]。CSCs細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)胰酶消化后鋪至6孔板，按說明書將脂質(zhì)體2000與對(duì)照組和miR-125a mimic轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至CSCs，分為NC組和miR-125a mimic組，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3MTS增殖實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組CSCs細(xì)胞胰酶消化計(jì)數(shù)，以2 500個(gè)/孔、150 μl培養(yǎng)基接種于96孔板，培養(yǎng)0、1、2、3和4 d，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，輕輕放至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞完全貼壁后在對(duì)應(yīng)時(shí)間每孔加入30 μl MTS工作液，在培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處OD值。

1.2.4軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組CSCs細(xì)胞胰酶消化計(jì)數(shù)，以1×105個(gè)/孔重懸于1 ml 20%無血清培養(yǎng)基與0.6 %滅菌的軟瓊脂1∶1混合物，鋪至預(yù)先鋪好固體膠(500 μl 20%無血清培養(yǎng)基與500 μl 1.2%滅菌后的軟瓊脂1∶1充分混勻后冷卻為固態(tài))的6 cm培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天在顯微鏡下觀察克隆形態(tài)并拍照。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組CSCs細(xì)胞胰酶消化計(jì)數(shù)，無血清培養(yǎng)基洗3次，以1×105個(gè)/孔、100 μl無血清培養(yǎng)基接種于Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上室，500 μl完全培養(yǎng)基加入下室作為趨化因子，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至下室穿過10個(gè)細(xì)胞時(shí)終止培養(yǎng)，PBS將聚碳酸酯微孔膜上室面細(xì)胞洗掉，甲醇固定微孔膜15 min，蘇木素染細(xì)胞核。隨機(jī)計(jì)數(shù)顯微鏡下5個(gè)視野聚碳酸酯微孔膜下室面細(xì)胞。

1.2.6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組CSCs細(xì)胞，加入RIPA裂解液(含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，勻漿機(jī)冰上裂解10 min，4℃、13 000 r/min 離心30 min，取上清液，BCA檢測(cè)蛋白濃度，變性后SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕性轉(zhuǎn)膜，5% BSA室溫封閉3 h，TBST清洗5 min后加入一抗(1∶500)孵育4℃過夜，TBST清洗5 min×3次后，二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光條帶。

1.2.7miR-125a靶基因的驗(yàn)證 TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)miR-125a的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分別將以下4組共轉(zhuǎn)染至CSCs：E2F2-wt與miR-125a mimics共轉(zhuǎn)染組(E2F2-wt+miR-125a)；E2F2-wt與NC共轉(zhuǎn)染組(E2F2-wt+NC)；E2F2-mut與miR-125a mimics共轉(zhuǎn)染組(E2F2-mut+miR-125a)；E2F2-mut與NC共轉(zhuǎn)染組(E2F2-mut+NC)，收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)各組熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1miR-125a在組織和正常口腔黏膜組織中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果表明，OSCC miR-125a在OSCC組織中的表達(dá)(1.08±0.44)顯著低于正?？谇火つそM織(1.65±0.47)(t=4.625，P=0.000)。miR-125a在腫瘤直徑≥4 cm組織中的表達(dá)顯著低于直徑<4 cm組織，在TNM Ⅲ～Ⅳ期組織中的表達(dá)顯著低于Ⅰ～Ⅱ期組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 miR-125a在OSCC組織中的表達(dá)水平與臨床病例特征間的關(guān)系Tab.1 Relationship between expression level of miR-125a in OSCC and clinical case

2.2OSCC干細(xì)胞的分選與鑒定結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD133+CD44+細(xì)胞陽(yáng)性率為92.15%，Western blot檢測(cè)OCT4、 Nanog和SOX2干性標(biāo)志蛋白在CD133+CD44+細(xì)胞中表達(dá)顯著高于CD133-CD44-細(xì)胞(P<0.05)，見圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)OCT4、Nanog和SOX2干性標(biāo)志蛋白在CD133+CD44+細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.1 Western blot detected expressions of OCT4,Nanog and SOX2 stem marker proteins in CD133+CD44+ cellsNote:Compared with CD133-CD44-cells,*.P<0.05.

2.3miR-125a在OSCC干細(xì)胞中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-125a在CD133+CD44+細(xì)胞和CD133-CD44-細(xì)胞中的表達(dá)為0.26±0.04和0.49±0.10，均低于人口腔黏膜角化細(xì)胞HOK(1.02±0.03)，在CD133+CD44+細(xì)胞中的表達(dá)最低。miR-125a mimic轉(zhuǎn)染OSCC干細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)顯示miR-125a mimic組中miR-125a的表達(dá)(11.99±2.13)顯著高于NC對(duì)照組(1.05±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-125a的表達(dá)Fig.2 qRT-PCR detected expressions of miR-125a in cells of each groupNote:Compared with HOK cells,*.P<0.05;compared with NC group,#.P<0.05.

2.4MTS檢測(cè)miR-125a過表達(dá)對(duì)OSCC干細(xì)胞增殖的影響 與NC對(duì)照組相比，miR-125a mimic組細(xì)胞增殖能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 MTS檢測(cè)miR-125a對(duì)OSCC干細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 MTS detected effect of miR-125a on proliferation of OSCC stem cellsNote:Compared with NC group,*.P<0.05.

2.5軟瓊脂克隆檢測(cè)miR-125a 過表達(dá)對(duì)OSCC干細(xì)胞克隆形成能力的影響 miR-125a mimic組細(xì)胞克隆形成能力明顯弱于NC對(duì)照組，見圖4。

圖4 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-125a對(duì)OSCC干細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig.4 Soft agar colony formation assay detected effect of miR-125a on clone formation ability of OSCC stem cell

2.6Transwell檢測(cè)miR-125a 過表達(dá)對(duì)OSCC干細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 miR-125a mimic組和NC對(duì)照組細(xì)胞穿膜數(shù)分別為(67.98±11.35)個(gè)和(101.35±8.56)個(gè)。miR-125a mimic組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯低于NC對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 Transwell檢測(cè)miR-125a過表達(dá)對(duì)OSCC干細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響Fig.5 Transwell assay detected effect of miR-125a on OSCC stem cell metastasis

2.7miR-125a對(duì)E2F2的調(diào)控作用 如圖6A所示，TargetScan7.1軟件在線預(yù)測(cè)顯示E2F2啟動(dòng)子區(qū)有miR-125a的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)E2F2與miR-125a的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，突變位點(diǎn)見圖6B，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，與E2F2-wt+NC共轉(zhuǎn)染組相比，E2F2-wt+miR-125a共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而E2F2-mut+NC和E2F2-mut+miR-125a組之間的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6C。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-125a mimic組OSCC干細(xì)胞中E2F2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，見圖6D、E。

圖6 miR-125a對(duì)E2F2基因的調(diào)控作用Fig.6 Regulation of E2F2 by miR-125aNote:Compared with NC group,P<0.05.

3 討論

OSCC具有高發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重危害人類生命健康[14]。OSCC的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及患者對(duì)化療放療的抗性是治療的主要障礙，也是導(dǎo)致患者預(yù)后較差的主要原因[3]。雖然近些年醫(yī)學(xué)的進(jìn)步使OSCC的治療效果得到一定改善，但患者5年生存率并未明顯提高[15]。分子醫(yī)學(xué)的最新發(fā)展使研究者認(rèn)識(shí)到腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)是破壞細(xì)胞增殖、分化和凋亡正常機(jī)制的結(jié)果。干細(xì)胞是具有自我更新和分化潛能的多能細(xì)胞，而腫瘤干細(xì)胞是目前已經(jīng)證實(shí)的與干細(xì)胞具有相似功能的存在于腫瘤細(xì)胞中的一小部分細(xì)胞群體，是腫瘤細(xì)胞增殖的源頭和維持腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的動(dòng)力，在腫瘤的惡性生物學(xué)行為中具有重要地位[16]。Zhang等[17]利用低髓樣細(xì)胞白血病1(Mcl-1)基因特異性抑制劑S63845或A-1210477抑制Mcl-1表達(dá)，細(xì)胞凋亡信號(hào)啟動(dòng)，肝細(xì)胞癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Nanog、Sox2和KLF4表達(dá)水平降低，并顯著抑制了腫瘤球形成，提示腫瘤干細(xì)胞具有作為藥物靶點(diǎn)的潛能。

越來越多的研究報(bào)道m(xù)iRNAs在調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的干性中發(fā)揮重要功能。miRNAs是一類長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸且高度保守的內(nèi)源性RNA，不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，其可作為促癌因子和抑癌因子在腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等功能[18]。miRNAs同樣在腫瘤干細(xì)胞干性中具有正調(diào)控和負(fù)調(diào)控作用。在肝癌干細(xì)胞中干擾miR-21表達(dá)可顯著抑制高侵襲肝癌干細(xì)胞的增殖和侵襲[19]。miR-30-5p在結(jié)直腸癌中表達(dá)降低，過表達(dá)miR-30-5p可通過抑制USP22顯著降低干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和Sox2表達(dá)、腫瘤球形成和細(xì)胞增殖[9]。近年來miRNAs在OSCC中調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的機(jī)制逐漸清晰，Lin等[20]報(bào)道m(xù)iR-1246在OSCC組織和腫瘤干細(xì)胞中高表達(dá)，miR-1246靶向抑制CCNG2可顯著降低腫瘤干細(xì)胞的干性。ΔNp63和miR-138-5p通過相互作用促進(jìn)OSCC細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和腫瘤干細(xì)胞干性[21]。miR-125a位于染色體19q13.41，屬于miR-125家族，miR-125家族成員的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[22]。Yang等[23]發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，其在體內(nèi)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，在體外通過靶向VEGFA抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。而miR-125a在骨巨細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)，且其高表達(dá)與腫瘤局部浸潤(rùn)、分級(jí)和復(fù)發(fā)有關(guān)。同時(shí)miR-125a可通過靶向TET2和Foxp3刺激IL-17A表達(dá)，通過靶向APC和GSK3β刺激β-連環(huán)蛋白表達(dá)，最終促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞的致瘤性和增殖[24]。由此可以推斷miR-125a在不同腫瘤中的表達(dá)水平及作用機(jī)制不同，而miR-125a在OSCC中的研究較少，因此作者對(duì)此進(jìn)行了研究。

實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)miR-125a在40例OSCC組織和20例正常口腔黏膜組織中的表達(dá)水平，qRT-PCR結(jié)果顯示miR-125a在OSCC組織中的表達(dá)顯著低于口腔黏膜組織，而Tiwari等[13]同樣采用qRT-PCR檢測(cè)20例OSCC組織和配對(duì)的癌旁組織中miR-125a的表達(dá)水平，結(jié)果表明，與癌旁組織相比，有16例OSCC組織中miR-125a表達(dá)下調(diào)，與本文研究結(jié)果一致，提示miR-125a可能為抑癌因子。由于吸煙、飲酒等危險(xiǎn)因素，OSCC男性患者較多，此外OSCC發(fā)病多見于老年人，但隨著社會(huì)的發(fā)展，性行為方式的改變、輻射化學(xué)致癌物的接觸以及藥物濫用導(dǎo)致的免疫抑制等原因使得OSCC發(fā)病年齡提前，研究報(bào)道有4%～6%的OSCC發(fā)生年齡小于40歲，且這種年輕化趨勢(shì)仍然在發(fā)展[25]。

OSCC最常發(fā)生于舌部，但腫瘤形成的其他常見部位是唇部和口底區(qū)[26]。因此對(duì)miR-125a在OSCC患者性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-125a在腫瘤直徑較大、TNM晚期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)降低，表明miR-125a在OSCC中表達(dá)下調(diào)可能促進(jìn)OSCC的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究報(bào)道腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞外泌體中miR-125a表達(dá)水平降低，促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和腫瘤干細(xì)胞干性[27]。miR-125a在喉癌組織和腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)下降，過表達(dá)miR-125a通過靶向造血細(xì)胞特異性蛋白1相關(guān)蛋白X-1(HAX-1)逆轉(zhuǎn)喉癌干細(xì)胞順鉑耐藥[28]。

為了研究miR-125a與OSCC干細(xì)胞干性關(guān)系，采用無血清培養(yǎng)及磁珠分選的方法將腫瘤干細(xì)胞從OSCC細(xì)胞系Cal-27細(xì)胞中分離并提純，研究報(bào)道OSCC干細(xì)胞表面分子為CD133+CD44+，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD133+CD44+細(xì)胞陽(yáng)性率為92.15%，Western blot檢測(cè)OCT4、Nanog和SOX2干性標(biāo)志蛋白在CD133+CD44+細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，表明CD133+CD44+細(xì)胞為腫瘤干細(xì)胞[29]。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-125a在OSCC干細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于在Cal-27細(xì)胞和人口腔黏膜角化細(xì)胞HOK中的表達(dá)，HOK細(xì)胞中的表達(dá)最高，與在OSCC組織中的表達(dá)一致。而miR-125a mimic轉(zhuǎn)染OSCC干細(xì)胞，MTS增殖實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-125a過表達(dá)后OSCC干細(xì)胞增殖、腫瘤球形成能力和轉(zhuǎn)移能力均下降，顯著抑制OSCC干細(xì)胞的干性。

生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)miR-125a顯著抑制腫瘤干細(xì)胞的干性，其具體調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。miRNAs通過與靶基因mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)發(fā)揮作用其靶基因可有數(shù)十個(gè)到數(shù)百個(gè)[30]。Tiwari等[13]報(bào)道在OSCC細(xì)胞中miR-125a靶向抑制雌激素相關(guān)受體α表達(dá)、降低細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)。通過TargetScan7.1軟件預(yù)測(cè)以及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，證實(shí)E2F2為miR-125b直接調(diào)控的靶基因。E2F2是E2F家族成員，是調(diào)節(jié)各種生物學(xué)過程的轉(zhuǎn)錄因子家族，研究表明E2F2在宮頸癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤中為致癌基因[12,13]。E2F2在OSCC的研究報(bào)道中顯示，其啟動(dòng)子區(qū)變異增加HPV16血清陽(yáng)性的OSCC患病風(fēng)險(xiǎn)[31]。Li等[32]發(fā)現(xiàn)E2F2變體可作為OSCC患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。同時(shí)越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道E2F2與腫瘤干細(xì)胞的干性相關(guān)，Gujar等[33]報(bào)道E2F2是維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新所必需的。此外E2F2可以作為多種miRNAs的靶基因，miR-4319可通過E2F2抑制三陰乳腺癌干細(xì)胞中腫瘤球的自我更新和形成，并抑制體內(nèi)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[34]。miR-99a通過其與E2F2的3′-UTR區(qū)直接結(jié)合抑制肺癌干細(xì)胞的干性[35]。而OSCC干細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-125a mimic后，qRT-PCR結(jié)果顯示E2F2 mRNA表達(dá)水平顯著下降，表明miR-125a可能通過靶向負(fù)調(diào)控E2F2抑制腫瘤干細(xì)胞的干性，其具體作用機(jī)制需在后續(xù)研究中深入探討。

綜上所述，miR-125a在OSCC組織和腫瘤干細(xì)胞中低表達(dá)，其低表達(dá)與OSCC患者的腫瘤直徑、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，miR-125a可能通過負(fù)調(diào)控E2F2抑制OSCC干細(xì)胞的干性，miR-125a可能為治療OSCC的潛在靶點(diǎn)，可為干預(yù)OSCC惡性生物學(xué)行為提供新的研究思路。